外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略

第22卷 第3期 吉首大学学报(自然科学版)Vol.22 No.3 2001年9月J ournal of J ishou University(Natural Science Edi ti on)Sept.2001文章编号:1007-2985(2001)03-0040-05外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略聂东宋,梁宋平,李 敏(湖南师范大学生命科学院,湖南长沙 410081)摘 要:高效表达外源蛋白,在理论和实践上特别是在生物制药中具有重要意义,巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一.影响外源蛋白在P.pas toris中表达的因素很多,主要包括外源基因自身的特性、载体、宿主细胞几个方面,了解和灵活运用它们的联系,有助于获得外源基因在P.pastoris中的高效表达.关键词:巴氏毕赤酵母;外源蛋白;高效表达中图分类号:Q75 文献标识码:A巴氏毕赤酵母(P.pastoris)是一种单细胞真核生物,基因工程菌近年来已被广泛用于商业化生产外源蛋白.与其它表达系统比较,该系统具有以下优点:(1)高表达.该表达系统利用醇氧化酶基因启动子很强,细胞生长速度快,所以该表达系统表达的外源蛋白产量很高,如破伤风毒素蛋白的产量高达12g/L[1],其它表达系统一般为毫克级.(2)高稳定.由于该表达系统的表达载体不是以自主复制的质粒形式存在,而是整合到酵母染色体上,所以构建的菌株十分稳定.(3)高分泌.P.pastoris中一些分泌信号和先导序列如a-因子的分子生物特性已研究得十分清楚,加之它身体的生物学特性,其分泌表达可达10g/L,这在已知的分泌表达系统中是十分罕见的.虽然已有许多蛋白在P.pastoris中实现了高效表达,但仍有一些蛋白表达量相对较低,如 -cryptogein表达量级为1~5mg/L[2],AFP在摇瓶中表达时最高水平不超过5mg/L[3],有些甚至不能表达,如HIV表面糖蛋白[4].此外,酵母表达系统的局限性还在于分泌表达产物的不均一性,如信号肽加工不完全,表达产物内部降解等现象[5] 其次,当利用该系统的载体将外源基因通过双交换整合到宿主体中AOX1基因位置时,AOX1基因被破坏,这样使细胞利用甲醇能力大大降低.从而大大延长了细胞培养发酵时间.这种外源蛋白表达的差异,一方面是由于外源基因本身的特性而引起的,另一方面,表达条件也对表达量起了极其重要的作用.笔者综述了影响甲醇酵母中外源基因高效表达的各种因素,并阐述了优化外源蛋白在P.pastoris中高效表达的策略.1 外源基因本身的特性对表达的影响1 1外源基因的A+T组成外源基因本身的4种核苷酸的组成对基因的表达起重要作用.许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录,共有序列ATTATTTTATAAA就是一个转录提前终止信号 Caro1A Scorer[6]在表达人免疫缺损病毒(HI V)包膜糖蛋白gp120时,这个信号造成了gp120的转录提前终止.提前终止被认为是一种具有种族特异性的现象,如在P.pastoris中不能表达的HIVE NV蛋白在酿酒酵母中表达良好.[4]因此,可以通过调整高A+T含量区的核苷酸的组成来避免提前终止的发生,使其A+T含量在30%~50%收稿日期:2001-08-05基金项目:国家自然科学基金资助项目(39670392)作者简介:聂东宋(1967-),男,湖南省衡阳县人,湖南师范大学硕士研究生,主要从事基因结构与功能研究.范围内,CareJJ [1]用这种方法使破伤风毒素C 片段得到高效表达.1 2密码子的选择在不改变氨基酸组成的前提下,通过修饰密码子序列也可以提高表达水平.目前公认的观点是:通过优化基因的密码子序列,可以适应tRNA 的同工受体及宿主的反义密码子摇摆位置处被修饰的核苷酸的丰度,同时也有利于翻译的二级结构的形成.在酵母中表达较高的基因往往是采用酵母本身所偏爱的密码子,研究也表明在所有61个密码子中有25个是酵母所偏爱的[7].赵翔[8]通过对Pichia pastoris 的28个蛋白编码基因的同义密码子的使用情况的分析,确定了P.pastoris 的19个高表达优先密码子.这些结果与已知的Saccharomyles Cervisiae 及Kluyveromyles lactis 的密码子基本相似,但在谷氨酸的密码选择上截然相反.谷氨酸以GAG 为高表达优越密码而不是以S.cerevisiae 和ctis 所偏爱的GAA 为优越密码.姚斌等[9]在P.Pastoris 中表达植酸酶时,把在酵母中使用频率为0的精氨酸的密码子突变为使用频率较高的密码子时,表达水平提高了37倍.1 3mRNA5 非翻译区(5 -UTR)核苷酸的序列和长度5 -UTR 的核苷的序列和长度影响外源基因的表达.由于UTR 太长或太短都会造成核糖体40S 亚基识别障碍,因此,一个适当长度的5 -UTR 有助于mRNA 进行有效的翻译.Aox1基因5 -UTR 长为114nt 且富余A+ ,因此,为了获得最佳蛋白表达量,维持外源基因mRNA5 -UTR 尽可能与Aox1mRNA5 -UTR 相似是十分必须的,最好二者保持一致.Sreekrishna 等[10]通过调整人体血清白蛋白的(HSA)的mRNA5 非翻译区使之与醇氧化酶Aox1的非翻译区保持一致后,HSA 的表达量提高50倍以上,肠组织蛋白酶E (C TSE)的表达水平通过5 -UTR 的调整亦极大地增加[11].此外5 -UTR 应避免AUG 序列,以确保mRNA 从实际翻译起始位点开始翻译,起始密码AUG 周围不应形成二级结构,可通过密码子的替换来达到目的.2 外源蛋白在P.pastoris 中的高效表达策略2 1优化表达载体系统1)载体的选择.应用甲醇酵母表达异源蛋白时有多种载体可供选择,既有胞内表达载体(如pPIC3),又有分泌表达载体,如pPIC9,PHI L-D,PA0804,Pa0815,Ppsc3K 等.一般而言,对于非分泌蛋白采用胞内表达方式,而对于正常分泌蛋白则选择分泌型载体,这样更有利于表达产物的分离纯化.2)选择强启动子.P.pastoris 载体中最常用的启动子为Aox1启动子(Aox1promoter P Aox1),它的甲醇诱导性很强,因此,由它控制的外源基因通常能得到高效表达.也有人曾用P Aox2和P DAS 启动子,但二者的强度大大低于PAox1.如果带有外源基因的载体通过双交换整合起P.pastoris 的Aox1基因位置时,Aox1基因将被破坏.虽然Aox2和Aox1基因的序列同源性高达97%,但Aox1基因表达产物在正常细胞中仅占总酶量的5%.这样就使细胞利用甲醇的能力大大下降,从而使表达量下降且延长了细胞发酵时间(150~200h).为了克服这一缺点,戴秀玉[12]等通过分离选择恢复利用甲醇能力的自发突变体,从Aox1基因缺陷菌株中分离得到Mut +的自发突变体.他们对突变体的Aox2基因上游区域经PCR 护增产物测序,确定了该突变体在-255和-529两个位置的碱基发生了改变,而这两个位置为阻遏蛋白结合区域.该区域发生点突变后阻遏蛋白便不能很好地与之结合,通过去阻遏作用使得转录效率增强,从而提高表达量和缩短发酵时间.最近一种无需甲醇诱导而能组成性表达外源基因的毕赤酵母载体pGAPB 和pGAPB 已经构建成功,这些载体利用了三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因启动子P GAP ,在它的控制下B-1acz 基因表达率比甲醇诱导下的以P Aox1启动子的产量更高[13].由于该组成型启动子不需甲醇诱导,发酵工艺更为简单,而且产量更高,所以成为替代PAox1的最强有力的启动子.Doring 等[14]分别用pGAPZB 和pPICZB 来生产兔肾肽载运蛋白(rPE PTZ)和小人肠肽转运蛋白(hpEPTZ),前者表达的这两种蛋白的产量均比后者高4倍,看来在生产哺乳动物膜转运蛋白时pGAP 比PAox1更理想.3)信号肽的选择.分泌表达是一种理想的蛋白质生产方式,既可以减轻宿主细胞代谢负荷,又可减少宿主细胞蛋白酶对外源蛋白的降解.利用外源蛋白自身信号肽与酵母信号肽表达外源蛋白均有成功报道.用自身信号肽在P.pastoris 中表达成功的例子如人血清白蛋白和牛凝血酶等.但如果自身的信号肽序列效41第3期 聂东宋,等:外源蛋白在巴氏毕赤酵母中的高效表达42吉首大学学报(自然科学版)第22卷果不佳则可尝试用甲醇酵母的信号肽.这些信号肽主要有酸性磷酸酶基因PHO1的信号肽、蔗糖酶基因SUC2的信号肽、间质金属蛋白酶(MMP)的信号肽及转化酶(invertase)的信号肽等.其中a-因子信号肽使用最广,尤其对于小分子物质如抑肽酶、表皮生长因子、凝血固子X 等[10].杨晟[15]等采用a-因子信号肽比利用人血清白蛋白天然前导肽作为分泌信号肽可使重组人血清白蛋白表达量高出10%左右.另外如果外源基因产物不能分泌到体外,还可将产物连上一个定向肽(peroxisome targeting singal,P TS),使其定向运输到过氧化物酶体中,以免产物积累对宿主细胞造成毒害,同时产物自身的稳定性会大大增强.Water-ham[16]等利用定向肽在P.pastoris中成功地将P GAP启动下的 -半乳糖苷酶定向运输到过氧物酶体中.但用P.pastoris表达基因工程产物的另一问题是信号肽加工不完全,其表达的外源基因产物常比设计的多几个氨基酸残基,这可能是酵母自身调节机制对外源基因高表达的应答反应[5].Singh[17]等通过定向缺失诱变MF a1和干扰素基因连接处寡核苷酸导致了含有天然N端的成熟干扰素的正确释放,可以成为解决这一问题的好办法.2 2 增加外源基因整合拷贝数巴氏毕赤酵母载体在宿主染色体上大多数为单拷贝整合,但由于P Aox1在甲醇诱导下的强启动性以及整合后常常稳定,所以即使单拷贝也能获得较高的产量.如乙肝表面抗原在P.pastoris中单拷贝产率可达0 4g/L(酿酒酵因至少需50拷贝才能达到此水平)[18].但在另一些例子中,提高拷贝数可大大增加表达水平,如鼠表皮生长因子(E GF)、人肿瘤坏死因子(TNF)和破伤风毒素片段C[10].目前提高整合拷贝数的方法主要有:(1)通过不同的转化方法提高拷贝数.P.pastoris的转化方法有电激法、原生质体法、氯化锂法等,其中以原生质法转化使细胞群中产生多拷贝转化子频率相对较高.但若使用G418检测拷贝数,则配合电激法转化的效果更好[19].(2)在体外载体上多次插入目的基因片段.但这种多拷贝整合不太稳定且拷贝数有限.(3)将载体中目的基因两端连上来自宿主或其它非必需高重复的基因片段,通过同源重组而达到高拷贝整合的目的.由于rDNA在酵母基因组中有100~200个重复单元,所以这是一种提高拷贝的理想方式.该策略已在酿酒酵母[20]、乳酸克鲁维酵母[21](K lactis)中得到成功应用,可惜在P.pastoris中尚未见实验报道.目前要快速高效地筛选高拷贝的转化子,传统方法有SDS-PAGE、免疫印迹、southern blotting 等,但这些方法费时费力.通过PC R法检测拷贝数既方便又快捷,另外还可通过提高G418的浓度来筛选高拷贝转化子.但是个别情况下,拷贝数增加对产量也会产生负效应[22],这可能是由于分泌效率低的蛋白在过高表达的情况下会对分泌途径形成负反馈抑制,因此基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的.高表达菌株的筛选应以表达蛋白量为唯一标准.Jeffrey[23]等建立了一种双筛选膜筛选方法:首先将菌转至醋酸纤维素膜上,再与硝酸纤维素膜叠放在酵母固体培养基上,经过一段时间培养后分泌蛋白就印在硝酸纤维素膜上,接着用此蛋白的抗体检测,即可挑出最高蛋白量对应的克隆.用这种方法,每套滤膜可筛选出100 ~1000个克隆,从而快速地从大量重组子中筛选出高表达克隆.2 3优化发酵条件1)通过提高菌株的生物量来提高外源蛋白表达量.采用不同的培养基配方和不同的发酵参数,通过提高细胞的绝对总数来提高外源蛋白的产量.影响P.pastoris生长的外界因素主要包括:(1)培养基组成.目前主要有MGY/mm、B MG/Bmm、B MGY/B mmy3种培养基可用于培养P.pastoris.但由于BMGY/Bmmy既含有磷酸缓冲液又含蛋白胨和酵母提取物,因而菌株生长更好,大大增加了生物量,使表达量也相应大大提高.如在表达mEGF时,在B mmy培养基中单拷贝转化子表达量为20 g/L,而在不含蛋白胨和酵母提取物的基本培养基中表达量少于1 g/L[24].蛋白胨和酵母提取物中几乎不含大分子蛋白质,只有分子量低于3000Da的小分子多肽,因此对于大分子外源蛋白的分离纯化不会造成不便.(2)诱导前菌体OD值.P. pastoris中蛋白表达分2个阶段:一是生长阶段,在含甘油的培养基中生长菌体,待OD600达到2~6时再离心收集菌体;二是诱导表达阶段,将收集的菌体转入含甲醇的培养基中诱导表达.理论上而言,OD600值越高,生物量越大,则总的表达量亦应该越高.但是OD600值越高培养基中氧和营养供给越受限制,而且外源蛋白的溶解性、稳定性、毒性都会对菌体产生影响.因此,高密度并不一定意味着高表达.鉴于发酵罐培养较之摇瓶培养在溶解量、pH值、通气量营养补给方面的优越性,有人建议在筛选高表达菌种时,经初筛后的菌株应立即用发酵罐进行发酵条件的研究,从而大大提高表达量.如在表达mEGF时,发酵罐较之摇瓶培养提高10倍,从48mg/L 到447mg/L;在表达破伤风肠毒素C 片段时,发酵罐也提高表达量10~20倍.2)防止目的蛋白降解.外源蛋白的稳定性直接影响到基因表达的产量.几乎没有一种高表达蛋白是特别稳定的,宿主菌内蛋白酶水平决定着表达产物的降解速度.高密度培养酵母固然可以大大提高培养基上清中分泌外源蛋白的含量,但随着重组蛋白的分泌增加,其它一些细胞内物质如蛋白酶亦会分泌增多,在培养基中积累从而造成对重组蛋白的降解.此外酵母细胞膜上有一种KEX-2样蛋白水解酶,能专一性水解 -因子前体中羧基端的肽键,即连续的2个碱性氨基酸(如lysAry,lyslys,Arglys),从而使目的蛋白降解.为了提高外源蛋白在发酵液中的稳定性,免受蛋白酶降解,可采有以下几种方法:一是改造P.pastoris 表达宿主菌株,缺失基因组中主要蛋白水解酶的基因,使目的基因稳定.或使用已有的蛋白酶缺陷菌株如SMD1168(his4pep4)、SMD1165(his4,prb1)和SMD1163(his4,pep4,prb1)亦可避免产物降解的发生[10].二是在培养液中补加一些富含氨基酸的组分和酪蛋白水解物、胃蛋白水解物,提供给酵母细胞蛋白酶过量的底物,以减少目的蛋白的降解.三是由于P.Pastoris 能忍耐较宽的pH 范围(pH 3.0~7.0),因此可调节溶液pH 值抑制蛋白水解酶活性,防止目的蛋白降解.四是降低甲醇诱导表达时的培养温度,Mei M 等[25]通过将诱导表达时的温度由30 降至25 ,半乳糖氧化酶表达量提高4倍.总之,P.pastoris 表达系统由于具有表达量高、本身遗传稳定、具翻译后加工能力、产物可分泌发酵、工艺成熟、分离纯化简单、蛋白质产物糖基化方式更接近高等生物等优点,已成为目前国内外倍受青睐的真核表达系统.目前用该系统表达的外源基因已上百种,很多医药制品如人血清白蛋白、人白介素-2、乙肝表面抗原、水蛭素等在该系统中都已成功表达,有些即将进入市场[26].但影响外源基因在P.pastoris 中表达的因素非常复杂,建立稳定的高效表达外源蛋白的表达体系并非易事.笔者着重探讨了与遗传因素及发酵方面有关的因素,这些策略的灵活运用将不同程度改善外源蛋白在P pastoris 中的表达水平.外源蛋白在P.pastoris 的高效表达是一个涉及多学科的问题,尚需其它研究领域的共同合作探讨.参考文献:[1] CLARE J J,RAYMENT F B,B ALLANTINE S P,et al.Hihg-level Expression of T etanus Toxin Fragment C in Pichia Pastoris StrainsContaining Multiple T andem Integration of the Gene[J].Bio/Technology,1991,(9):455-460.[2] MIC HAEL J D.Over Expressi on in Pichia Pastoris and Crystallization of an Elicitor Protein Secreted by the Phytopathogenic Fungus[J].Protein expression and Purification,1996,(8):254-261.[3] LOEVEN M C.Biosyn thetic Production of Type Fi sh Anti freeze Protein:Fermen tation by Pichia Pastris[J].Appl Microbiol Bi tech -nol,1997,(48):480-486.[4] CLARE J,SCORERC,BUC KHOLZ R E xpression of EGF and HIV Envelope Glycoprotein[J].Methods Mol 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