生物素过氧化物酶
生物化学三大代谢重点总结
第八章生物氧化1.生物氧化：物质在生物体内进行氧化称生物氧化，主要指糖、脂肪、蛋白质等在体内彻底分解时逐步释放能量，最终生成CO2 和 H2O的过程。
2.生物氧化中的主要氧化方式：加氧、脱氢、失电子3.CO2的生成方式：体内有机酸脱羧4.呼吸链：代谢物脱下的成对氢原子通过位于线粒体内膜上的多种酶和辅酶所催化的连锁反应逐步传递，最终与氧结合生成水，这一系列酶和辅酶称为呼吸链，又称电子传递链。
NADH →复合物I→ CoQ →复合物III →Cyt c →复合物IV →O 产2.5个ATP (2)琥珀酸氧化呼吸链:3-磷酸甘油穿梭琥珀酸→复合物II→ CoQ →复合物III → Cyt c →复合物IV →O 产1.5个ATP 含血红素的辅基：血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、过氧化物酶、过氧化氢酶5.细胞质NADH的氧化:胞液中NADH必须经一定转运机制进入线粒体，再经呼吸链进行氧化磷酸化。
转运机制（1）3-磷酸甘油穿梭：主要存在于脑和骨骼肌的快肌，产生1.5个ATP（2）苹果酸-天冬氨酸穿梭：主要存在于肝、心和肾细胞；产生2.5个ATP6.ATP的合成方式：（1）氧化磷酸化：是指在呼吸链电子传递过程中偶联ADP磷酸化，生成ATP，又称为偶联磷酸化。
偶联部位：复合体Ⅰ、III、IV（2）底物磷酸化：是底物分子内部能量重新分布，通过高能基团转移合成ATP。
磷/氧比：氧化磷酸化过程中每消耗1摩尔氧原子（0.5摩尔氧分子）所消耗磷酸的摩尔数或合成ATP的摩尔数。
7.磷酸肌酸作为肌肉中能量的一种贮存形式第九章糖代谢一、糖的生理功能：（1）氧化供能（2）提供合成体内其它物质的原料（3）作为机体组织细胞的组成成分吸收速率最快的为-半乳糖二、血糖1.血糖：指血液中的葡萄糖正常空腹血糖浓度：3.9~6.1mmol/L2.血糖的来源：（1）食物糖消化吸收（2）肝糖原分解(3)糖异生去路：(1）氧化分解供能（2）合成糖原（3）转化成其它糖类或非糖物质3.血糖调节：肝脏调节、肾脏调节（肾糖阈）、神经调节、激素调节体内主要升血糖激素：胰高血糖素、糖皮质激素、肾上腺素、生长激素、甲状腺素三、糖代谢1.无氧酵解(无氧或缺氧；生成乳酸；释放少量能量)关键酶：己糖激酶、6-磷酸果糖激酶1、丙酮酸激酶反应部位：胞液产能方式：底物磷酸化净生成2ATP⑴葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖 -1ATP⑵ 6-磷酸葡萄糖转变为 6-磷酸果糖⑶ 6-磷酸果糖转变为1,6-二磷酸果糖 -1ATP⑷ 1,6-二磷酸果糖裂解⑸磷酸丙糖的同分异构化⑹ 3-磷酸甘油醛氧化为1,3-二磷酸甘油酸【脱氢反应】⑺ 1,3-二磷酸甘油酸转变成3-磷酸甘油酸【底物磷酸化】 +1*2ATP⑻ 3-磷酸甘油酸转变为2-磷酸甘油酸⑼ 2-磷酸甘油酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸⑽磷酸烯醇式丙酮酸转变成丙酮酸，并通过底物水平磷酸化 +1*2ATP(11)丙酮酸加氢转变为乳酸生理意义：（1）是机体在缺氧情况下获取能量的有效方式。
免疫组化步骤
免疫组化：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法1)将石蜡切片置于烤片机烘烤２－３h,{因为做石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，所以应烤片2-3h,除非组织的抗原性较稳定，则时间可长一点}后可把烤好的组织切片，放在60℃烤箱中过夜，最佳时间控制在14-18h{乳腺病理处省略此步骤}。
取组织切片于切片架，用吹风机吹至产生蜡液，不可靠太近，以免使组织切片局部温度过高，破坏组织切片。
2）常规脱蜡 ({二甲苯脱蜡，在夏天，室温较高，脱蜡试剂也新鲜，则脱蜡时间不需很多，3-5分钟就已足够。
如果在冬天，室温较低，脱蜡试剂也较陈旧，则脱蜡时间需要延长，10-20分钟或更长}二甲苯I 20min →二甲苯II 20min→二甲苯Ⅲ20min →无水乙醇10min（清洗二甲苯）→无水乙醇10min→95%乙醇5min→80%乙醇5min) {梯度酒精用无水酒精与蒸馏水配置}目的：把水渗入组织切片中，给细胞创造一个水溶性环境<以下步骤是为细胞染色做准备>3）捞出，放入铁缸内，用凉清水冲洗3次{如果组织容易脱片，就尽量泡一下，这样脱片可以减少很多}；4）将配好的柠檬酸盐抗原修复液（抗原修复液的量为稍高于横向放倒的切片架的高度）{EDTA配制方法：EDTA修复液使用比例：EDTA:蒸馏水=1:49,每次最好配制1000ml。
EDTA修复液重复使用最好不要超过5次，并且3次之后要测PH值，测PH是否为9.0，如偏离太大则弃用。
枸橼酸修复液只能用一次。
修复的原因：因为常规的石蜡切片标本均用甲醛固定，结果使得抗原性物质形成醛键，羧甲键而被封闭了部分抗原决定簇。
另外，蛋白之间发生交联而使抗原决定簇隐蔽。
在染色时，要先进行抗原修复或暴露，即将固定时分子之间所形成的交联破坏，而恢复抗原的原有空间形态}{用EDTA修复比柠檬酸容易脱片，但是你要用到EDTA的时候也可，因其抗原修复效果比柠檬酸盐的好，可从另外的问题上着手}灌入高压锅中，不旋紧，盖上即可，210℃烧至沸腾后，把切片架放入横向放倒，旋紧锅盖，待喷气时，开始计时2min-2min30s,如果组织不易染色，可延长修复时间，但一般不超过3min，否则容易掉片。
07 生物素-亲和素
特性：每个亚基都可结合1个生物素分子，即1个亲和素分子 可结合4个生物素分子。 亲和素可以和4个生物素分子亲密结合，这虽不属免疫反应， 但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。且由于 多种生物活性物质在生物素化后，其活性不会受到显著影响， 故而二者在结合反应时具有的多级放大作用。
注意事项：
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基 团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；
控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1，IgG应用浓度 0.5~5μg/ml；生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab； 使用交联臂减少空间阻力
概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖 蛋白，可由蛋清中提取。 主要包括：卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素 等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已 深入研究并得到广泛应用。 结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它 是与生物素结合的基团。
分子式：C10H16O3N2S 分子量：244.31 等电点：PH=3.5 溶解特性：难溶于水，易 溶于二甲基甲酰胺(DMF) 两个环状结构： I环（咪唑酮环）为与亲 和素结合的主要部位； II环（噻吩环）为结合抗 体和其它生物大分子的部 位，C2上戊酸侧链的未端 羧基是结合生物大分子的 唯一结构
Ag+B· Ab Ag-Ab· B
亲合素(A)
A
Ag-Ab· B-A
B· E
Ag-Ab· B-A-B· E
底物
酶标生物素
生物素化的抗体
+A
+A
BA法（标记亲和素-生物素法）
FISH技术的基本原理
CISH的原理：
将基因探针用地高辛或生物素标记，利用过氧化物酶或碱性磷酸酶的呈色反应使在光学显微镜下检测组织mRNA的表达水平。
FISH技术的基本原理
利用DNA碱基对的互补性，将直接标记了荧光的单链DNA(探针)和与其互补的目标样本的DNA(玻片上的标本)杂交，通过观察荧光信号在染色体上的位置反映相应染色体的情况。
FISH就是利用这一原理将标记探针同组织、细胞核或染色体DNA进行杂交，经荧光检测体系对待测核酸定性、定位或相对定量分析的一种研究方法。
试剂配制：(1)杂交增强液：取适量100倍杂交增强液与蒸馏水按1:99 配制并放置冰箱备用(2) DAB显色液DAB底物和E和稀释液D按1:50比例混匀。
脱蜡及水化：组织经二甲苯2次，5min ，无水乙醇3min ，95%乙醇3min, 80%乙醇脱蜡，以及水洗2min ，蒸馏水洗2min 2次。
杂交预处理：将切片放入盛有1倍杂交增强液的容器里，微波高
火煮2 次，每15min加杂交增强液，并保证组织始终浸没于溶液中,自然冷却，流水冲洗，蒸馏水洗。
杂交及变性：①加探针②加热变性③放置在杂交仪上培养过夜④浸没于PBS中，使盖玻片脱落⑤用PBS洗涤
信号放大与显色：①小心擦去组织周围液体，加第一抗体②小心擦去组织周围液体，加第二抗体③小心擦去组织周围液体，加聚合物，室温培养，PBS清洗④擦去组织周围液体，加显色液体⑤流水冲洗，PBS返蓝，梯度酒精脱水，中性树胶封固。
结论
是免疫组化表达初步筛查的首选方法检测法建议ICH阳性患者可进一步作显色法检测更有利于临床治疗方案的选择。
生物化学三大代谢重点总结
第八章生物氧化1. 生物氧化：物质在生物体内进行氧化称生物氧化，主要指糖、脂肪、蛋白质等在体内彻底分解时逐步释放能量，最终生成C02和H2O的过程。
2. 生物氧化中的主要氧化方式：加氧、脱氢、失电子3. CO2的生成方式：体内有机酸脱羧4. 呼吸链：代谢物脱下的成对氢原子通过位于线粒体内膜上的多种酶和辅酶所催化的连锁反应逐步传递，最终与氧结合生成水，这一系列酶和辅酶称为呼吸链，又称电子传递链。
组成(1) N ADH 氧化呼吸链：苹果酸-天冬氨酸穿梭NADH —复合物I —CoQ —复合物III —Cyt c —复合物IV f O 产2.5个ATP(2) 琥珀酸氧化呼吸链：3-磷酸甘油穿梭琥珀酸—复合物II —CoQ —复合物III —Cyt c —复合物IV —O 产1.5个ATP含血红素的辅基：血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素、过氧化物酶、过氧化氢酶5. 细胞质NADH 的氧化：胞液中NADH必须经一定转运机制进入线粒体，再经呼吸链进行氧化磷酸化。
转运机制(1 ) 3-磷酸甘油穿梭：主要存在于脑和骨骼肌的快肌，产生 1.5个ATP(2 )苹果酸-天冬氨酸穿梭：主要存在于肝、心和肾细胞；产生2.5个ATP6. ATP的合成方式：(1 )氧化磷酸化：是指在呼吸链电子传递过程中偶联ADP磷酸化，生成ATP，又称为偶联磷酸化。
偶联部位：复合体I、III、IV(2 )底物磷酸化：是底物分子内部能量重新分布，通过高能基团转移合成ATP。
磷/氧比：氧化磷酸化过程中每消耗1摩尔氧原子(0.5摩尔氧分子)所消耗磷酸的摩尔数或合成ATP的摩尔数。
7. 磷酸肌酸作为肌肉中能量的一种贮存形式第九章糖代谢寸一、糖的生理功能：(1 )氧化供能(2 )提供合成体内其它物质的原料(3 )作为机体组织细胞的组成成分吸收速率最快的为-半乳糖二、血糖1. 血糖：指血液中的葡萄糖正常空腹血糖浓度：3.9~6.1mmol/L2. 血糖的来源：（1）食物糖消化吸收（2）肝糖原分解（3）糖异生去路：（1 ）氧化分解供能（2）合成糖原（3）转化成其它糖类或非糖物质3. 血糖调节：肝脏调节、肾脏调节（肾糖阈）、神经调节、激素调节体内主要升血糖激素：胰高血糖素、糖皮质激素、肾上腺素、生长激素、甲状腺素三、糖代谢1. 无氧酵解（无氧或缺氧；生成乳酸；释放少量能量）关键酶：己糖激酶、6- 磷酸果糖激酶1、丙酮酸激酶反应部位：胞液产能方式：底物磷酸化净生成2ATP⑴ 葡萄糖磷酸化为6- 磷酸葡萄糖-1ATP⑵ 6- 磷酸葡萄糖转变为6- 磷酸果糖⑶ 6- 磷酸果糖转变为1,6- 二磷酸果糖-1ATP⑷ 1,6- 二磷酸果糖裂解⑸ 磷酸丙糖的同分异构化⑹ 3- 磷酸甘油醛氧化为1,3- 二磷酸甘油酸【脱氢反应】⑺ 1,3- 二磷酸甘油酸转变成3- 磷酸甘油酸【底物磷酸化】+1*2ATP⑻ 3- 磷酸甘油酸转变为2- 磷酸甘油酸⑼ 2- 磷酸甘油酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸⑽ 磷酸烯醇式丙酮酸转变成丙酮酸，并通过底物水平磷酸化+1*2ATP（11）丙酮酸加氢转变为乳酸生理意义：（1）是机体在缺氧情况下获取能量的有效方式。
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记
几种常见的抗体标记方法-酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记抗体标记主要有酶标记、荧光素标记、同位素标记、生物素标记等，还有一些其他的标记方法例如金标记，本文主要讲述了这些抗体标记的基本原理、操作步骤。
、酶标记1 、辣根过氧化物酶(HRP) 标记辣根过氧化物酶(HRP) 标记单抗和多克隆抗体的常用方法是过碘酸钠法。
其原理是HRP 的糖基用过碘酸钠氧化成醛基，加入抗体IgG后该醛基与IgG 氨基结合，形成Schiff 氏碱。
为了防止HRP中糖的醛基与其自身蛋白氨基发生偶合，在用过碘酸钠氧化前先用二硝基氟苯阻断氨基。
氧化反应末了，用硼氢化钠稳定Schiff 氏碱。
这里介绍两种程序。
程序一：(1)将5mg HRP 溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3 溶液中加0.5ml 10mmol/LNaIO4 溶液，混匀，盖紧瓶塞，室温避光作用2 小时。
(2)加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3 混匀。
(3)加入0.75ml 小鼠已处理的腹水，或纯化单抗等(15mg/ml) ，混匀。
(4)称取SephadexG25 干粉0.3g ，加入一支下口垫玻璃棉的5ml 注射器外筒内;随后将上述交联物移入注射器外套;盖紧，室温作用(避光)3小时或4C过夜。
(5)用少许PBS 将交联物全部洗出，收集洗出液，加1/20V 体积新鲜配制的5mg/mlNaBH4 溶液，混匀，室温作用30 分钟;再加入3/20V NaBH4溶液，混匀，室温作用1小时(或4C过夜)。
(6)将交联物过Sephadex g200 或Sepharose6B(2.6 X 50cm)层析纯化，分管收集第一峰。
(7)酶结合物质量鉴定：克分子比值测定酶量(mg/ml)=OD403 X 0.4IgG 量(mg/ml)=(OD280- OD403X 0.3) X 0.62克分子比值(E/P)=酶量X 4/IgG量，一般在1-2之间。
酶结合率=酶量X体积/抗体，标记率一般为0.3-0.6，即1-2个HRP 分子结合在一个抗体分子上，标记率可大于0.6，0.8，0.9;OD403/OD280 等于0.4 时，E/P 约为1 。
生物素的生化功能
生物素的生化功能生物素是一种重要的维生素，也称为维生素H或辅酶R。
它在人体内起着多种生化功能，对于维持身体健康至关重要。
生物素在体内参与了脂肪、碳水化合物和蛋白质的代谢。
它是许多酶的辅助因子，能够促进这些酶的活性，从而加速代谢过程。
例如，生物素参与了葡萄糖的合成与分解过程，帮助维持血糖水平的稳定。
此外，生物素还参与了脂肪酸的合成与氧化，对于脂肪代谢的平衡起着重要的作用。
它还能够参与氨基酸的代谢，帮助身体合成蛋白质，并维持蛋白质的稳定。
生物素对于维持健康的皮肤、头发和指甲具有重要作用。
皮肤是人体最大的器官之一，生物素能够促进皮肤细胞的正常分裂和生长，从而保持皮肤的健康和光滑。
它还能够促进头发和指甲的生长，预防头发和指甲的脆弱、干燥和脱落。
因此，摄入足够的生物素对于保持健康的皮肤、头发和指甲至关重要。
生物素还对神经系统的正常功能起着重要的调节作用。
它参与了神经递质的合成和传递过程，维持了神经系统的平衡和稳定。
生物素还能够促进脑细胞的正常发育和功能，增强记忆力和注意力。
因此，摄入足够的生物素对于保持健康的神经系统至关重要。
生物素还参与了DNA和RNA的合成过程，对于细胞的生长和分裂具有重要作用。
它能够促进细胞的正常分裂和增殖，帮助维持身体组织的正常生长和修复。
生物素还对免疫系统的正常功能起着重要的调节作用。
它能够促进免疫细胞的活性和功能，增强免疫系统的抵抗力。
生物素还参与了炎症反应的调节，帮助控制炎症反应的过程。
因此，摄入足够的生物素对于维持健康的免疫系统至关重要。
生物素在人体内具有多种生化功能，对于维持身体健康至关重要。
它参与了脂肪、碳水化合物和蛋白质的代谢，维持健康的皮肤、头发和指甲，调节神经系统的正常功能，参与DNA和RNA的合成，以及调节免疫系统的正常功能。
因此，我们应该保证摄入足够的生物素，以维持身体的正常功能和健康。
生物素-亲和素标记技术完整讲解
4 .4 在分离纯化中的应用（亲和层析）
1.平衡 2.上样 3.洗杂 4.洗脱
五 反应特点
1. BAS具有高灵敏度、高特异性、高稳定性和适用性等特点。
1包被抗原2洗涤3待测抗体4洗涤5生物素标二抗6洗涤7加亲和素8洗涤9加酶标生物素10洗涤11加底物12显色后加终止液直接法步骤2亲和素生物素过氧化物酶法abc法即亲和素生物素过氧化物酶法avidinbiotincomplextechnologyabc其原理是预先按一定比例将亲和素或链霉亲和素与酶标生物素结合形成可溶性的亲和素或链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物当其与检测反应体系中的生物素化一抗直接法或生物素化二抗间接法相遇时复合物中未饱和的亲和素或链霉亲和素结合部位即可与抗体上的生物素结合
磁微粒和氨基末端磁性微粒为载体分别通过物理吸附和共 价作用制备两种链亲和素-磁性微粒，其具有较高的游离 生物素结合容量以及较高的生物素标记寡核苷酸的结合能 力。
4.1.4 在免疫酶技术中的应用
BAS应用于免疫酶技术，通过生物素-亲和素将免疫复 合物与辣根过氧化物酶连接起来，形成免疫酶-生物素-亲 和素法。赵金富等用合成的雌三醇-生物素复合物(E3Biotin)结合辣根过氧化物酶标记的亲合素(HRP-Avidin)作
BAS与免疫放射分析(immunoradiometric analysis，IRMA)方法偶联， 先将针对不同抗原决定簇的固相抗体和生物素化抗体与 抗原(标准抗原和待测抗体)同时反应，在固相载体表面形成双抗体夹心免疫复合物， 再用放射性同位素标记的亲和素(或链霉亲和素)与复合物中的生物素结合， 最终使反应信号放大。 李贵平等用153Sm标记BAS，再标记抗CEA 单抗， 最后在结肠癌裸鼠模型中进行γ显像和体内分布测定， 结果肿瘤显像时间大大缩短。郝君等采用生物素-磁珠富集微卫星， 与传统放射性同
免疫组化试题参考答案
免疫组化试题参考答案免疫组织化学试题参考答案一、名词解释：1.PAS反应：即过碘酸--雪夫反应显示糖原，简称PAS反应。
其原理是通过利用过碘酸的氧化作用，使糖分子中的二醇基氧化为二醛基，释放出醛基，与碱性品红反应，生成紫红色化合物沉淀。
2.Feulgen法：即福尔根反应显示DNA法。
其原理是组织用1NHCl 60℃水解，将DNA分子中脱氧核糖核酸与嘌呤间的连链打开，使之释放出醛基与碱性品红发生反应，生成紫红色化合物沉淀。
3.PAP法：即过氧化物酶一抗过氧化物酶法，该技术原理与其他免疫定位技术相同，即通过抗体使标记分子（抗辣根过氧化物酶）定位于抗原附件。
其不同点为三步法，且有放大作用，反应彻低依靠于免疫学结合，不需要标记任何抗体，反应敏捷度高，背景低。
注重一抗与复合物中的抗体必需来源于同一种动物，且二抗必需过剩。
4.核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异性互补的已知标记的核酸片段，可检测待测样品中特定的基因序列。
无标记的探针称裸探针。
5.核酸分子杂交：指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。
杂交的双方分离为待测的核酸序列和已知核酸序列，后者通常用核素或非核素示踪标记，称为探针（probe），杂交后形成的异源双链分子称为杂交分子。
6.质量控制：指组织化学反应各环节中获得最佳效果的技术掌握，是组织化学的关键环节，是取得惬意效果的须要条件，是提高结果可信度的根本保证。
7.诱发荧光：组织细胞中的某些物质本身不发荧光，但在经过一定的化学反应后可以改变成荧光分子。
此技术目前主要应用在生物胺的显示中。
其中最重要的是甲醛和乙醛酸诱发多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素和5—羟色胺荧光，以及邻苯二醛诱发组织胺荧光的反应。
8.定量分析：定量推断是结果推断中最重要也是具故意义的推断，其推断结果有助于统计学的分析处理。
组织细胞化学结果的定量分析又称定量组织细胞化学，指在组织细胞化学阳性结果的基础上，对阳性结果（终于阳性产物）举行测量，以数值反应被检测物质的含量。
免疫组化试题(有答案)
免疫组织化学试题参考答案一、名词解释：1.PAS 反应：即过碘酸--雪夫反应显示糖原，简称证。
PAS 反应。
其原理是通过利用过碘酸的氧化作用，7.诱发荧光：组织细胞中的某些物质本身不发荧使糖分子中的二醇基氧化为二醛基，释放出醛基，光，但在经过一定的化学反应后可以转变成荧光分与碱性品红反应，生成紫红色化合物沉淀。
子。
此技术目前主要应用在生物胺的显示中。
其中2.Feulgen 法：即福尔根反应显示DNA 法。
其原最重要的是甲醛和乙醛酸诱发多巴胺、去甲肾上腺理是组织用1NHCl 60℃水解，将DNA分子中脱氧素、肾上腺素和5—羟色胺荧光，以及邻苯二醛诱核糖核酸与嘌呤间的连链打开，使之释放出醛基与发组织胺荧光的反应。
碱性品红发生反应，生成紫红色化合物沉淀。
8.定量分析：定量判断是结果判断中最重要也是具3.PAP 法：即过氧化物酶一抗过氧化物酶法，该技有意义的判断，其判断结果有助于统计学的分析处术原理与其他免疫定位技术相同，即通过抗体使标理。
组织细胞化学结果的定量分析又称定量组织细记分子（抗辣根过氧化物酶）定位于抗原附件。
其胞化学，指在组织细胞化学阳性结果的基础上，对不同点为三步法，且有放大作用，反应完全依赖于阳性结果（最终阳性产物）进行测量，以数值反应免疫学结合，不需要标记任何抗体，反应灵敏度高，被检测物质的含量。
此法是阳性结果的进一步检测背景低。
注意一抗与复合物中的抗体必须来源于同和分析，更加直观地反应实验结果，更有力地说明一种动物，且二抗必须过剩。
实验结果。
常用有人工定量分析与仪器定量分析两4.核酸探针：指能与特定核酸序列发生特异性互补类。
的已知标记的核酸片段，可检测待测样品中特定的9.固定：为了更好的保持细胞和组织原有的形态结基因序列。
无标记的探针称裸探针。
构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定，5.核酸分子杂交：指具有互补序列的两条核酸单链其作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抵制外在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。
生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒使用说明
生物素-链霉卵白素免疫组化检测试剂盒使用说明Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems规格:1kit保存:2-8℃避光保存产品简介：SP试剂盒，全称为过氧化物酶标记的链霉卵白素（Streptavidin/Peroxidase）检测试剂盒。
由于链霉卵白素的分子量是60kDa，有四个亚基可和生物素结合，等电点为6.5，所以该方法具有灵敏度高、特异性强、背景清晰、成本低廉的优点，但是由于使用了生物素，所以在某些内源性生物素含量比价高的组织中应慎用。
该系列检测试剂盒是性价比较高的免疫组化检测试剂。
试剂盒内容：试剂（无色液体）：3%H2O2去离子水3ml、6ml或18ml 试剂A（蓝色液体）：封闭用正常山羊血清工作液3ml、6ml或18ml 试剂B（黄色液体）：生物素标记山羊抗兔\小鼠IgG3ml、6ml或18ml 试剂C（橙色液体）：辣根酶标记链霉卵白素工作液（S-A/HRP）3ml、6ml或18ml 操作步骤:仅供参考1、石蜡切片，常规脱蜡至水。
2、如需采用抗原修复，在此步骤后进行。
3、3%H2O2去离子水（无色液体）孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性。
PBS 冲洗，3分钟×3次。
4、滴加试剂A（蓝色液体）室温孵育10~15分钟，倾去，勿洗。
5、滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2~3小时或4℃过夜。
6、PBS冲洗，3分钟×3次。
7、滴加试剂B（黄色液体），室温或37℃孵育10~15分钟。
8、PBS冲洗，3分钟×3次。
9、滴加试剂C（橙色液体），室温或37℃孵育10~15分钟。
10、PBS冲洗，3分钟×3次。
11、显色剂显色（DAB或AEC）。
12、自来水充分冲洗。
13、如果需要，可进行复染，脱水，透明。
14、选择适当的封片剂封片。
生物素-亲和素标记技术完整讲解剖析
4.2 在分子生物学中的应用
不对称PCR
低浓度引物 高浓度引物
4.2 在分子生物学中的应用 Southern 印迹杂交
4.2 在分子生物学中的应用
分子分子杂交的基本类型
固相杂交 液相杂交 原位杂交 基因芯片
4.2 在分子生物学中的应用
分子杂交的基本类型
液相杂交 将参加液相杂交的两条核酸链都游离在 溶液中，在一定条件下（溶液的离子强度 、温度、时间等）进行杂交，然后再将未 杂交的探针除去，即得到杂交后的核酸分 子。
三 实验方法及步骤
生物素-亲和素标记技术的主要方法 ：
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法） （2）亲和素-生物素-过氧化物酶法（ABC法） （3）标记生物素-抗生物素法 （ LAB法）
（1）桥-亲和素-生物素标记法（BAB法）
桥-亲和素-生物素标记法(bridged avidin-biotin technique，BAB)分为直
生物素-亲和素标记技术
第一组
一 背景 二 原理 三 实验方法及步骤 四 应用 五 反应特点 六 应用前景
一 背景
生物素：
又称维生素H 、辅酶R，是水溶性维生素，也属于维生素B族。
1936年，两位德国科学家Kogl和Tonnis从煮熟的鸭蛋黄中 分离提取出一种结晶物质，是酵母生长所必需的，称之为 “生物素”。生物素厂泛存在于自然界的各种生物中,是人类 和动物维持健康不可缺少的要素，并因而得名。因其在食物 中的分布很广，几乎每种食物中都含有少量的生物素，加之 人体每日的所需量又很少,所以，人们一般都不缺乏这种维生 素。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。
SP(streptavidin-perosidase)法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。
SP（streptavidin-perosidase）法，即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。
按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。
按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。
一般的sp法步骤啊，具体如下：
1、烤片，68℃，20分钟，
2、常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I20min⇒二甲苯II20min⇒100%酒精10min⇒100%酒精10min⇒95%酒精5min⇒80%酒精5min⇒70%酒精5min
3、阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O237℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；
4、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。
5、正常羊血清工作液封闭，37℃10min，倾去勿洗。
6、滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；
滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min，PBS冲洗3X5min；
7、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS冲洗3X5min；
8、DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，
苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。
过氧化物酶体 功能
过氧化物酶体功能
过氧化物酶体（peroxisome）又称微体（microbody），过氧化物酶体在1954年被发现时, 由于不知道这种颗粒的功能，将它称为微体(microbody)。
过氧化物酶体（peroxisome）是一种细胞器，存在于一切真核细胞内，含有约40余种氧化酶和触酶，主要功能是催化脂肪酸的β-氧化，将极长链脂肪酸（very long chain fattyacid，VLCFA）分解为短链脂肪酸。
过氧化物酶体是由一层单位膜包裹的囊泡, 直径约为0.5～1.0μm, 通常比线粒体小。
过氧化物酶体普遍存在于真核生物的各类细胞中，但在肝细胞和肾细胞中数量特别多。
过氧化物酶体含有丰富的酶类，主要是氧化酶，过氧化氢酶和过氧化物酶。
氧化酶可作用于不同的底物，其共同特征是氧化底物的同时，将氧还原成过氧化氢。
过氧化物酶体的标志酶是过氧化氢酶，它的作用主要是将过氧化氢(H2O2, Hydrogen Peroxide)水解。
过氧化氢(H2O2)是氧化酶催化的氧化还原反应中产生的细胞毒性物质，氧化酶和过氧化氢酶都存在于过氧化物酶体中，从而对细胞起保护作用。
生物素-亲和素标记技术完整讲解
直接法：
+ B-E + A
ABC
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
直接法 间接法
（3）标记生物素-抗生物素法
标记亲和素-生物素法(labeled avidin-biotin， LAB)直接法是以标记亲和素(或链霉亲和素)直接 与免疫复合物中的生物素化一抗连接进行酶呈色 反应，间接法是采用生物素化的二抗和抗原结合， 由于加入了二抗，较直接法检测灵敏度要高，对 免疫细胞中免疫球蛋白的定位具有特异性。LAB 法需以生物素标记一抗，应用不如ABC法普遍， 与ABC法相比，LAB法操作较简单，但灵敏度较 低
亲和素：
亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD， 每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。 亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大， 两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的 结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。 因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。
直接法步骤
（2）亲和素-生物素-过氧化物酶法 （ABC法）
即亲和素-生物素-过氧化物酶法(avidin-biotin complex technology，ABC)，其原理是预先按一定比例将亲和素(或链霉亲和 素)与酶标生物素结合，形成可溶性的亲和素(或链霉亲和素)-生物素 -过氧化物酶复合物，当其与检测反应体系中的生物素化一抗（直接 法）或生物素化二抗（间接法）相遇时，复合物中未饱和的亲和素 (或链霉亲和素)结合部位即可与抗体上的生物素结合。在亲和素-生 物素-过氧化物酶复合物形成时，一个标记了生物素的酶分子可通过 其生物素连接多个亲和素(或链霉亲和素)分子，一个亲和素(或链霉 亲和素)分子又可桥联多个酶标生物素分子，这样就形成具多级放大 作用的晶格样网状结构，其中网络了大量酶分子。ABC法背景染色淡， 方法简单，节约时间，可用于双重或多重免疫染色，尤其在组织切片 和细胞悬液中抗原的检测和亚细胞水平定位分析中应用较广。
医学生化各种酶汇总
磷酸甘油酸激酶
糖酵解途径
1,3-二磷酸甘油酸、ADP
3-磷酸甘油酸、ATP
Mg2+
磷酸甘油酸变位酶
糖酵解途径
3-磷酸甘油酸
2-磷酸甘油酸
Mg2+
烯醇化酶
糖酵解途径
2-磷酸甘油酸
磷酸烯醇式丙酮酸、H2O
丙酮酸激酶
糖酵解途径
磷酸烯醇式丙酮酸、ADP
丙酮酸、ATP
K+、Mg2+
关键酶
乳酸脱氢酶（LDHⅠ）
名称
功能
反应物
生成物
辅酶/辅基
其他
GSH过氧化物酶
谷胱甘肽的还原作用
谷胱甘肽(GSH)、H2O2
GSSG、H2O
GSH还原酶
谷胱甘肽的还原作用
GSSG
GSH
NADP+
己糖激酶
糖酵解途径
葡萄糖、ATP
6-磷酸葡萄糖、ADP
Mg2+
关键酶
葡萄糖激酶
糖酵解途径
葡萄糖、ATP
6-磷酸葡萄糖、ADP
Mg2+
关键酶
ALA
卟胆原（PBG）
卟胆原脱氨酶
血红素合成
卟胆原（PBG）
线状四吡咯、NH3
尿卟啉原Ⅲ同合酶
血红素合成
线状四吡咯
尿卟啉原Ⅲ、NH3
尿卟啉原Ⅲ脱羧酶
血红素合成
尿卟啉原Ⅲ
粪卟啉原Ⅲ、CO2
粪卟啉原Ⅲ氧化脱羧酶
血红素合成
粪卟啉原Ⅲ
原卟啉原Ⅸ
原卟啉原Ⅸ氧化酶
血红素合成
原卟啉原Ⅸ
原卟啉Ⅸ
亚铁螯合酶
血红素合成
果糖二磷酸酶-1
生物素亲和素放大系统
生物素亲和素放大系统
生物素亲和素放大系统（Biotin-Avidin Amplification System）是免疫组织化学技术中常用的增强方法。
其原理是生物素与链霉亲和素（Avidin）结合后形成生物素-链霉亲和素复合物，生物素-链霉亲和素复合物与连接荧光素等物质的新化学实体进一步增强了检测灵敏度。
在该系统中，样品经过初级抗体与标记试剂（如酶标记抗体或荧光标记抗体）结合后，再加上与标记试剂相称的生物素化二抗，使生物素化二抗与标记试剂结合。
最后，加入与生物素结合的标记试剂（如辣根过氧化物酶（HRP）偶联的荧光素）来检测目标分子。
这种方法在检测抗原、蛋白质、核酸等方面具有广泛应用。
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（二）标记生物素-抗生物素技术 （Labelled Avidin-Biotin Technique, LAB技术）
1、基本原理
以生物素标 记抗体作第一抗 体，酶标记抗生 物素作为第二抗 体，同S-P技术
LAB法示意图
2、操作步骤
（1）①-④ 步骤与ABC法相同 ； （5）PBS洗后加生物素标记第一抗体37℃ 30min ； （6）PBS洗后加酶标亲和素 （如HRP-Avidin） 37℃ 30min： （7）以下步骤同ABC法。
（一）亲和素-生物素-过氧化物酶 （Avidin Biotin-peroxidase Complex，ABC）技术
1．基本原理
2、操作步骤
（1）石蜡切片常规脱蜡至水，冰冻切片经冷丙酮固定，用PBS洗； （2）用3% H2O2甲醇液室温作用20min后，充分水洗 ； （3）PBS洗，加牛血清白蛋白或二抗动物种属正常血清15min ； （4） 加第一抗体（即用型或浓缩型）4℃过夜或37℃ 1h ； （5）PBS洗，加生物素化第二抗体37℃ 30min ； （6）PBS洗，加ABC复合物（1∶100,使用前30min将等量的亲和素
第一步
第二步
第三步 第四步
第五步
2、操作步骤
（1） 常规脱蜡至水， 必要时用抗原修复处理； （2） 3% H2Ｏ2甲醇液15min； （3） 正常封闭血清，室温20min，甩干； （4） 滴加特异性一抗4℃过夜或37℃ 孵育1h； （5） PBS洗后，滴加生物素化二抗37℃ 30min； （6） PBS洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37℃孵育 20min； （7） PBS洗，滴加生物素化酪胺基团分子，37℃孵育 20min； （8） PBS洗（一定要充分），滴加Streptavidin-HRP，37℃孵育 20min； （9） PBS洗后，DAB/H2Ｏ2显色； （10）苏木素衬染细胞核，脱水、透明、封片，显微镜观察。
S-P（ streptavidin －peroxidase）技术 SABC （streptavidin-biotin complex） 技术 （四）BRAB（Bridged Avidin-Biotin ）技术 （五）CSA（Catalyzed signal amplification）法 （六） Envision技术
一、基本原理
（一）生物素（Biotin）与亲和素/卵白素/抗生物素 （Avidin/anti-Biotin）之间有很强的亲和力 ；
（二）生物素和亲和素具有与其它示踪物质如荧光素和过 氧化物酶等相结合的能力 。
二、几种经典的抗生物素－生物素染色法
（一） ABC（Avidin Biotin-peroxidase Complex ）技术 （二）LAB（Labelled Avidin-Biotin ）技术 （三） LSAB（labeled streptavidin biotin method ）：
（五） CSA（Catalyzed signal amplification）法
1、原理
根据两次生物素-Streptavidin-HRP反应，聚合示踪物质（HRP催化底物生物 素化酪胺成不溶性生物素化酪胺，沉淀在局部），使原始信号得到几何级放大 ， 敏感性更高，尤其适合原始信号较弱的信号检测，但操作较复杂。
（四）BRAB（Bridged Avidin-Biotin ）技术
1、原理
以生物素标记抗 体作第一抗体，抗生 物素作为第二抗体， 桥接酶标生物素。
2、操作步骤
（1）①-③ 步骤与ABC法操作相同； （2） 加一抗4℃过夜或37℃ 1h； （3） PBS洗后加生物素标记的第二抗体 37℃ 30min； （4） PBS洗后加亲和素 37℃ 孵育30min； （5） PBS洗后加HRP酶标记生物素37℃ 30min； （6） PBS洗后用DAB/H2Ｏ2显色； （7） 常规脱水、透明、中性树胶封固。
亲和免疫组化技术
(Affinity cytochemistry﹠histochemistry technique)
亲和的概念
物质之间具有的高度结合力，包括抗原与抗体、 生物素与抗生物素（又称亲和素）、葡萄球菌A蛋白 与IgG、植物凝集素与糖类、阳离子与阴离子、激素 与受体之间的结合反应等。
第一节 生物素－亲和素免疫细胞化学技术
（三） LSAB（labeled streptavidin biotin ）技术： S-P （ streptavidin －peroxidase）技术 SABC （streptavidin-biotin complex）技术
1、基本原理
2、操作步骤
（1）常规切片脱蜡至水 ； （2）必要时抗原修复：如高温高压修复； （3）3% H2Ｏ2甲醇液阻断内源性过氧化物酶15min ； （4）水洗，PBS洗， 10%牛血清白蛋白20min ； （5）加一抗 4℃过夜或37℃孵育1h ； （6）PBS洗，RP标记链霉亲和素（S-P复合物）或链霉亲和素－生物素 （SABC），37℃ 孵育20min ； （8）DAB/H2Ｏ2显色， 常规脱水、透明、中性树胶封固。
和酶标生物素 混合，稀释配制成 ABC复合物 ), 37℃ 20min ； （7）PBS洗，经DAB/H2O2显色 ； （8）常规脱水，透明，中性树胶封固。
3、ABC法的优点
（1）敏感性高 :结合力强,分子量小; （2）特异性强，背景染色淡 ； （3）方法简便，节约时间 ； （4）由于生物素与抗生物素具有与多种标记物结合的能力，可用于 双重或多重免疫染色 。
（六） Envision技术
１、原理
用高分子的葡聚糖作为载体，将大量的二抗分子和HRP结合成多聚体 ， 具有很强的信号放大功能，对膜和浆表达的抗体特别敏感 。敏感，简便。
2、操作步骤
（1）组织切片常规脱蜡至水，PBS洗； （2）用3% H2Ｏ2甲醇液阻断15min，水洗，PBS洗； （3）抗原修复处理，PBS洗； （4）正常山羊血清封闭 15min； （5）滴加第一抗体，37℃ 孵育1h； （6）PBS洗（一定要充分），滴加HRP-聚合物-抗体复合物 37℃，60min； （7）PBS洗（一定要充分），DAB显色； （8）苏木素衬染，脱水、透明、封固。