实验二 过氧化物酶同工酶的提取、分离

实验二过氧化物酶同工酶的提取、分离

苟亚峰

摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定玉米幼苗过氧化物酶同工酶，实验结果显示玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。

关键词：过氧化物同工酶；PAGE；电泳分离

引言

同工酶是指催化同一种化学反应，但酶的分子结构组成却有所不同的一组酶。同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。

电泳(electrophoresis，简称EP ) 指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。1937年瑞典科学家Tiselius 成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖。50年代，先后出现了以滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物的电泳技术。60年代，出现了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。

聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。

1.材料与方法

1.1实验材料、实验试剂与仪器

1.1.1实验材料

小麦苗，玉米苗

1.1.2实验仪器与试剂

1.1.

2.1 实验仪器

（1）垂直板电泳装置（电泳槽，玻璃板，胶条，电泳梳子，制胶架等）；

（2）稳流稳压电泳仪；

（3）高速冷冻离心机；

（4）电子天平；

（5）电冰箱；

（6）瓷盘、微量进样器；

1.1.

2.2 实验试剂

（1）1N HCl：用12N的浓盐酸来配制，100ml；

（2）分离胶缓冲液（pH8.9 Tris-HCl缓冲液）：取1N HCl 24ml，Tris（三羟甲基氨基甲烷）18.4g，TEMED（四甲基乙二胺）0.14ml，用蒸馏水溶解后定容至50ml；

（3）浓缩胶缓冲液（pH6.7 Tris-HCl缓冲液）：取1NHCl 24ml，Tris 2.99g，TEMED 0.24ml，用蒸馏水溶解后定容至50ml；

（4）分离胶贮液：Acr（丙烯酰胺）14.0g, Bis（甲叉双丙烯酰胺）0.368g, 用水溶解后定容至50ml；

（5）浓缩胶贮液：Acr 5.0g，Bis 1.25g,用水溶解后定容至50ml。

（6）过硫酸铵溶液(NH4)2S2O8（Ap）：0.3g 过硫酸铵溶于蒸馏水，定容至100ml（当天配制）；

（7）核黄素溶液：核黄素（VB2）2 mg溶于蒸馏水，定容至50ml ；

（8）电极缓冲液：（pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液），Tris 6g，甘氨酸28.8g，溶于蒸馏水后定容至1000ml，用时稀释10倍。

（9）样品提取液（pH8.0 Tris-HCl 缓冲液）：Tris 12.1g溶于蒸馏水定容至1000ml，以1N HCl调节pH=8.0；

（10）40%蔗糖；

（11）0.5%的溴酚蓝：0.5g溶于100ml无离子水；

（12）过氧化物酶同工酶联苯胺染色液：0.5g联苯胺加30ml无水乙醇，再加50ml 1.5M乙酸钠及50ml 1.5M乙酸，加蒸馏水375ml，染色前加25~30滴H2O2原液。联苯胺是致癌物质，称取时应戴手套。

1.2 方法与步骤

1.2.1 凝胶的制备

1.2.1.1 分离胶的制备

按体积比1:2:4:1，分别取分离胶缓冲液，分离胶丙胶贮液，Ap和去离子水混合制备分离胶，灌胶距梳子下端1cm后封上一层水加速聚合，当胶与水出现清晰界限时表明聚合好。

1.2.1.2 浓缩胶的制备

按体积比1:2:1:4，分别取浓缩胶缓冲液，浓缩胶丙胶贮液，核黄素溶液和蔗糖混合制备浓缩胶。灌胶前用滤纸吸干水，灌胶后插入梳子，光照，当胶色由黄色变为白色表明聚合好。

1.2.2 酶液的制备

称取幼苗0.5g ，加样品提取液1ml ，于冰浴中研成匀浆，然后以2ml提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以8000r/min，离心10min 后倒出上清液，加入等量加样缓冲液，低温放置待用。

1.2.3 电泳

取出胶板下端胶条，用滤纸搽净凡士林油，将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内），上下槽装电极缓冲液。轻拔梳子，用微量进样器点样，每孔约30μl。

接通电源，稳流后调节电流到每孔1mA左右，当溴酚蓝前沿进入分离胶后，可适当加大电流，待前沿下行到距离末1cm处，停止电泳。

1.2.4 剥胶、固定、染色

将凝胶板取下，翻入装水瓷盘中，剥下胶片并浸洗两次，倒去水后加入固定液10min，再倒去固定液加入联苯胺显色剂，观察记录。

2. 实验结果

实验结果见下图：

玉米过氧化物同工酶PAEG图谱

由上图可以看出玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。