过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳之令狐文艳创作
过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳之欧阳引擎创编
过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳欧阳引擎（2021.01.01）一、目的1、了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理2、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程3、了解过氧化物酶同工酶电泳过程二、实验原理：1、电泳原理及影响电泳的主要因素带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。
带电离子在电场中的泳动速度（1）和迁移率（泳动度）（2）V= E·q·a/6πrη (1) u= q·a/6πrη (2)由（2）式可以看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对迁移率产生影响。
因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。
并选用一定pH的缓冲液。
同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。
迁移率与粒子的大小（r）有关，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。
另外，迁移率还受电渗现象的影响。
所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。
例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。
因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。
聚丙烯酰胺凝胶结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。
这些特点，使得聚丙烯酰胺凝胶适合作区带电泳的支持介质。
最后，要考虑选用离子强度适宜的溶液。
一般低离子强度比较合适，因为此时导电性低，产生的热量较少。
同时可使被分离的带电离子对电流贡献最大从而加快电泳速度。
但也不能过低，它必须可以缓冲被分离样品中带电离子对凝胶pH的影响，且过低的离子强度易导致蛋白质凝聚。
一般最适的离子强度在0.01～0.1mol/L之间。
最常见的为0.05。
试验四SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质
• 5．加样：取大肠杆菌和BSA蛋白样品加样，每个 加样孔加样不宜过多，一般每孔加样7.5L。
• 6．电泳：先恒压80V，待样品进入分离胶后，调 电压为120V（恒压）。当溴酚蓝移动到离底部约 0.5cm时，停止电泳。
7．翘开玻璃板，将浓缩胶切掉, 剥下凝胶，准备染 色。
8． 凝胶染色：使用考马斯亮蓝R250染色。两块胶 （小盒子）或四块胶（大盒子）同步染色脱色。盖 上盖子用微波炉加热约15-20秒，摇床振荡15分钟， 回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脱色液（25% 乙醇，7.5%乙酸）脱色，用量和步骤与染色相同， 脱色两次，每次10分钟。
上，注意薄玻璃朝向自己，厚 极架（卡在底面的卡口上），注意薄玻璃朝向
玻璃上的箭头向上。按弹簧夹，电极架，厚玻璃的箭头朝上，玻璃与红色橡胶
将玻璃夹卡入制胶架。在玻璃 条必须完全紧贴。（需同时放置两块制好的胶，
的间隙内灌胶，放上梳子，待 如只使用一块则另一面须用提供的塑料板代替，
胶凝固。
注意塑料板上的提示，必须使塑料板与橡胶条
1.将红色玻璃夹子底座朝 下、卡口打开呈直角状， 放入厚薄两片玻璃，薄玻 璃朝向自己。注意厚玻璃 箭头向上，旁边两条小玻 璃条与薄玻璃接触，使之 形成一个间隙。
2.在平整的桌面上放下玻 璃与夹子，使玻璃和夹子 的底面完全对齐，向外扳 动塑料卡口，关紧夹子。
3.将做好的玻璃夹放在制胶架 4.取出制好的玻璃（连带胶），将玻璃放入电
完全紧贴。）正常安装则会形成一个密闭的容
器。
5.将底座的开关打开， 并向外拨动透明的架子， 使中间空隙增大，放入 电极架。
6.如图所示将电极架往下 压（约1~2mm），使底面 完全接触。
7.关上底座开关。
8.放入电泳槽内，加上加样 架加样。注意加样架与刚才 制胶所用的梳子齿数必须一 致。
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法
聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法发布时间：11-06-01 来源：点击量：10032 字段选择：大中小聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及方法聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。
在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。
聚丙烯酰胺凝胶有以下优点：①聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。
凝胶有格子是带有酰胺侧链的碳-碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。
②由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。
一般说来，含丙烯酰胺7-7.5%的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不1万至100万物质，1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15-30%的凝胶，而分子量特别大的可采用含丙烯酰胺4%的凝胶，大孔胶易碎，小孔胶则难从管中取出，因此当丙烯酰胺的浓度增加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。
③在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。
凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。
④丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。
合成聚丙的总克数称凝胶浓度，常用T%表达；凝胶溶液中交联剂占单体和交联体总量的百分数称为交联度，常用C%表示，可用下式计算：公式a：丙烯酰胺克数；b：甲撑双丙烯酰胺克数；m：缓冲液体积（毫升）凝胶浓度过高时，凝胶硬而脆，容易破碎；凝胶浓度太低时，凝胶稀软，不易操作。
交联度过高，胶不透明并缺乏弹性；交联度过低，凝胶呈糊状。
聚丙烯酰胺凝胶具有较高的粘度，它不防止对流减低扩散的能力，而且因为它具有三度空间网状结构，某分子通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大小和形状，这是凝胶的分子筛作用。
由于这种分子筛作用，这里的凝胶并不仅是单纯的支持物，因此，在电泳过程中除了注意电泳的基本原理以外，还必须注意与凝胶本身有关的各种性质（网孔的大小和形状等）。
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶实验八聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
２掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。
３掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。
４掌握过氧化物酶的活性的测定。
二实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂（即共聚体的N,N －甲叉双丙烯酰胺Bis）在加速剂（N,N,N',N'－四甲基乙二胺TEMED）和催化剂（过硫酸胺(NH4)4S2O8 简称AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化剂（AP）或核黄素（C17H20O6N4）和加速剂（TEMDA）的作用下聚合而成的三维网状结构。
催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：①AP-TEMED 属化学聚合作用②核黄素－TEMED 属光聚合作用２凝胶孔径的可调性及其相关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比： a:b<10 脆硬乳白交联度： a:b>100糊状易断②凝胶浓度与孔径的关系T（Acr和Bis总浓度）增加孔径减小移动颗粒穿过网孔阻力增加③凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加阻力增加移动速度减慢。
同时还与分子形状及分子电荷有关系。
在操作时，可以选用凝胶。
因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。
３试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。
不连续系统：电泳体系中由于缓冲液离子成分、PH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还有浓缩效应。
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验
聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、目的要求（1）学习电泳原理和技术（2）学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质技术二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。
具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。
血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。
因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。
聚丙烯酰胺凝胶作为电泳材料的特性人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能：Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸铵——化学催化剂TEMED：四甲基乙二胺——加速剂SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。
在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。
由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。
从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。
三、实验材料（一）试剂1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1）称取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去离子水溶解并稀释至100ml，贮棕色瓶中于4℃保存，可用一个月。
2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液称取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸馏水850ml，调pH至8.3，加蒸馏水到1000ml，4℃贮存。
实验二 过氧化物酶同工酶的提取、分离
实验二过氧化物酶同工酶的提取、分离苟亚峰摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定玉米幼苗过氧化物酶同工酶，实验结果显示玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。
关键词：过氧化物同工酶；PAGE；电泳分离引言同工酶是指催化同一种化学反应，但酶的分子结构组成却有所不同的一组酶。
同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。
电泳(electrophoresis，简称EP ) 指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
1937年瑞典科学家Tiselius 成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖。
50年代，先后出现了以滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物的电泳技术。
60年代，出现了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。
这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。
化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。
DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳实验(详细参考)
Aptamer的稳定性考察—聚丙烯酰胺凝胶电泳Aptamer识别肿瘤细胞若选择4℃识别，则需要提前控温离心机，且样品在上样检测前宜放置于冰中；37℃就不用控温了。
Aptamer浓度：荧光标记的是50μM，没有标记的是100μMDNA提取-----注意实验中戴好橡胶手套，穿好实验服，以防苯酚粘到皮肤上。
1. 取7.3μl aptamer（100μM）于1460μl小鼠血清（无需过滤）中，在37℃细胞培养箱中孵育；2. 于不同时间点（6h, 5h, 4h, 3h, 2h, 1h, 1min）取200μl该小鼠血清到新的EP管中，加入200μl（等体积）的苯酚-氯仿（取苯酚-氯仿之前先将苯酚-氯仿混匀），混匀，管中溶液变浑浊；3. 用15000转/分离心10分钟，管中出现3层：上清、白色变性蛋白层、苯酚层；4. 取上清到新的EP管中。
在原EP管（变性蛋白层和苯酚层）中加入200μlTE溶液，混匀（该步进一步提取残留的DNA）；5. 用15000转/分离心10分钟，收集上清；6. 重复4、5步直到上清澄清；7. 在上清中加入等体积的氯仿（用于去除苯酚），混匀，用15000转/分离心10分钟，取上清到新的EP管中；8. 加入等体积乙醚（用于去除氯仿），混匀后静置10分钟，弃上层乙醚（乙醚比水轻，在上层）；9. 重复步骤8，敞开管盖15分钟，待乙醚挥发；10. 加入1/10体积的3M NaAc、2倍体积的无水乙醇，放置于-20℃冰箱中30分钟（DNA沉淀）；11. 用16500转/分（转速不宜再高，EP管容易破裂！）离心30分钟；12. 将管中溶液吸出，转移至新的EP管中。
原管中保留约30μl溶液，打开管盖，待管中溶液蒸发；（我通常将EP管敞开，封上封口膜，再扎7、8个孔，放在通风橱中过夜。
）（管底看不到沉淀，因为DNA含量太低。
）13. 在管中加入16μL 1*TE溶液；14. 进行电泳分析前，将样品在95℃水浴中加热10分钟（小心管盖冲开或进水），在冰上骤冷（使DNA成单链），上样或保存在-20℃冰箱中。
实验六：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶实验报告
班级：植物142 姓名：刘国强学号：1401080229实验六：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工一、研究背景及目的同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
它们是DNA 编码的遗传信息表达的结果。
研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。
因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼叶叶片和根部的过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配制等问题，熟悉所有的操作过程二、实验原理本实验采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，分离小麦幼叶叶片和根部的过氧化物酶同工酶。
利用过氧化物酶在分解过氧化氢的过程中产生自由氧基，从而将联大茴香胺连接到过氧化物酶分子上，使之呈现棕褐色，将电泳后的凝胶置于含有过氧化氢的联大茴香胺染色液中浸泡，有过氧化酶同工酶蛋白的部位便可以观察到褐色的谱带。
通过这些谱带的数量、位置等获得相关信息。
三、仪器试剂1．实验材料小麦幼苗2．仪器:垂直板电泳槽(型号：DYY-III28A型电泳槽厂家：北京市六一仪器厂) 电泳仪（型号：DYY-III2稳压稳流电泳仪厂家：北京市六一仪器厂）主要器具：移液器、微量进样器、培养皿一套（直径15cm）、小烧杯3.试剂（1）分离胶缓冲液(pH8.9 Tris-HCl缓冲液)：称取48 mL 1mol/L HCl，Tris36.8g，用无离子水溶解后定容至100 mL。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分析过氧化物酶同工酶
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶一、目的同工酶是指能催化同一种化学反应， 但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组 酶。
它们是 DNA 编码的遗传信息表达的结果。
最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生 长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的 意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于 观察、记录和保存。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生 长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。
因此，测定这种酶 的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶 的生物化学反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配制等问题，熟悉所有 的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。
二、原理1．电泳现象带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
由于带电胶粒或分子中各种成份，所具有的电荷和分子量不同，在电场中将以不同的速 度移动，因而在电泳进行过程中，不同的成份将按照各自的迁移速度得到有效的分离。
2．影响电泳的主要因素若将带净电荷 q 的粒子放入电场，则该粒子所受到的引力 F 引可用数学式表示如下：F 引 =E × q (1)式中 E 为电场强度，单位为“伏特／厘米” ，表示电场中单位距离上的电位差。
如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。
但 在溶液中，由于电场的牵引力 F 引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力（即摩擦力）F 阻 相对抗，故上述现象不会发生。
根本 Stokes 公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以 及所在介质的粘度：F 阻 = 6pghn(2) 式中 F 阻是球形粒子所受的阻力，g 是球形粒子的半径，h 是溶液的粘度，n 是粒子移动的速度。
植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳实验指导
植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳【目的】1．掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作过程。
2．了解聚丙烯酰胺圆盘电泳的实际应用，利用此法分离植物过氧化物同工酶。
【概述】1．聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支承物的一种电泳技术。
其凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构。
凝胶网孔的大小可通过改变单体浓度和交联剂浓度的比例加以调节，常用的所谓标准凝胶是指含丙烯酰胺7%～7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能达到满意的结果。
聚丙烯酰凝胶电泳过程中除了一种电泳所具有的电荷效应外，还具有“分子筛”效应；不连续的凝胶电泳过程中具有电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
不连续凝胶电泳体系的不连续性体现在：（1）凝胶由上、下两层组成，两层胶孔孔径不同。
上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH 值不同。
如常用的碱性系统中，电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl 缓冲液，分离胶为pH8.9的Tris-HCl 缓冲液。
（3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这种不连续的系统中有三种物理效应起作用，使样品分离效果好、分辨率高。
这三种效应是电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
① 电荷效应 由于各种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而在一定电场作用下迁移率不同。
承载有并效电荷多的，泳动的快，反之则慢。
CH 2CH C=O NH 3CH 2=CH C=O NH CH 2NH C=O CH 2+CH 2CH C=O NH 3CH 2CH C=O NH 3C=O NH CH 2NH C=O CH 2CH 2CH [[]]nn 催化剂② 分子筛效应 因为聚丙烯酰胺具有网孔结构，所以直径大，形状不规则的分子，电泳时通过凝胶受到的阻力大，移动较慢；分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到的阻力小移动较快。
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析(实验报告)
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶生物111班杨明轩1102040128一、研究背景及目的过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 -1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。
这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。
而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。
它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。
在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。
品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。
育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。
在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。
要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。
基于“差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。
但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。
因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。
同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。
实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳共19页word资料
实验7 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理一聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE），由称盘状电泳。
这种电泳是在区带电泳的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2cm），然后再进行电泳分离。
圆盘电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质的不连续性（discontinuity），凑巧在垂直柱形凝胶上分散出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”和“圆盘状”的英文字头“disc”。
因此英文名称为“disc electrophoresis”，中文直译为盘状电泳。
仪器装置：如图A所示，上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液（图中曲线表示缓冲液面）。
上下槽的缓冲液分别有正负电极通入。
下槽外壳在必要时可通入冷水促使降温，水流方向用箭头表示。
上槽底部有许多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺的玻璃管。
图A在圆盘电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。
由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。
下面就圆盘电泳过程中的三种物理效应的原理加以说明：1.样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。
（1）凝胶层的不连续性：浓缩胶：为大孔凝胶，有防止对流的作用。
分离胶：为小孔凝胶，也有防止对流的作用。
样品在其中进行电泳和分子筛分离。
蛋白质在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。
进入小孔凝胶时遇到的阻力大，速度就减慢了。
由于凝胶的不连续性，在大孔胶与小孔胶的界面处就会使样品浓缩，区带变窄。
（2）缓冲离子成分的不连续性。
(3)电位梯度的不连续性。
(4)pH的不连续性：在浓缩胶和分离胶之间有pH的不连续性，浓缩胶应有的pH应为8.3，分离胶应有的pH为8.9。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
TEMED 丙烯酰胺 + 甲叉双丙烯酰胺------------------聚丙烯酰胺凝胶 Ap (三维网状结构)
AP-TMTED催化体系
TEMED催化AP生成硫酸自由基：
S2O82－
¯ 2SO4·
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
Bis将单体长链间连成网状结构：
通过改变凝 胶浓度及交 联度来调节 凝胶的孔径， 具有良好的 分子筛效应。
试剂贮备液瓶号 ①分离胶缓冲液 吸取毫升数
②分离胶贮液 ③过硫酸铵 蒸馏水 4ml 8ml 2ml
2ml
混匀，立即用装有针头的注射器将凝胶液缓缓注入已准 备好的干洁胶室中。胶室两侧和底部要防止渗漏，注胶 过程中要防止气泡产生。胶液加至离玻璃板顶部约 0.8cm处，此时将电泳槽垂直放置；立即注入蒸馏水使 胶的表面覆盖少量水层。约30min后，胶和水层之间出 现清晰的界面，表明聚合完成。
3、样品的制备
过氧化物酶的提取：称 取1g甘薯叶柄置于冰浴 上的研钵内，加入1ml样 品提取液(内含 pH6.8 、 0.05mol/L Tris－HCl， 20%蔗糖)研成匀浆后， 再加2ml提取液研磨均匀， 转入离心管，于3500rpm 离心15min，其上清液即 为酶的提取液，供电泳 分析用。
7、绘制酶谱条带，并计算各同工酶的迁移率
[结果计算]： a Rf值 = ----b
a
b
四、注意事项
安装玻璃夹心槽时，两片玻璃要干燥，有机玻璃条要夹平并用 胶布密封好。 分离胶或浓缩胶配制好的混合液要马上进行灌胶，以免溶液聚 合成胶。 过硫酸铵要现用现配。 分离胶灌好，上层要覆盖一层水层，避免胶氧化，同时使分离 胶胶面平整。 电泳仪连接电泳槽后，通电要严格控制电泳，每个电泳槽的电 流不能超过10mA,电压不能超过170V，电压过高会导致玻璃板 裂开。 染料必须现用现配。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离LDH同工酶
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离LDH同工酶一、实验目的1.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。
2.学习聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法分离LDH同工酶。
二、实验原理LDH 同工酶是由催化反应相同、分子结构和理化性质不同的一组酶组成，由于分子效应和电荷效应，他们分别以不同的速度在以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳中泳动，可分离出5种同工酶，泳动速度为LDH1> LDH2> LDH3> LDH4> LDH5。
聚丙烯酰胺凝胶电泳有丙烯酰胺单体和交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺在催化剂作用下，形成的三维网状结构称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称PAGE），电泳速度与粒子所带电荷、粒子大小有关外，还与网络的孔径有关。
粒子大于凝胶孔径的，电泳速度慢。
反之则电泳速度快。
三、实验试剂30％凝胶贮存液：丙烯酰胺29g，亚甲双丙烯酰胺1g，加蒸馏水溶至100ml，过滤棕色瓶4度保存。
Tris-甘氨酸电极缓冲液（5X）：Tris碱 15.1g 甘氨酸94g溶解于900ml去离子水中调解为PH8.3用去离子水定容至1000ml。
10％过硫酸铵：将0.5g过硫酸铵溶解于5ml水中。
Tris-Hcl 1.5mol／ml（ PH8.8）：18.165g Tris碱溶解于40ml水中，用1mol/lHCl调节PH至8.8，加水定容至100ml。
Tris-Hcl 0.5mol／ml（ PH6.8）：12.11g Tris碱溶解于40ml水中，用1mol/lHCl调节PH至6.8，加水定容至100ml。
2X样品缓冲液：Tris碱0.76g 蔗糖20g加41.5ml水溶解，然后加蒸馏水定容至50ml。
染色液：甲醇250ml 冰乙酸50ml 考马斯亮R250 0.5g去离子水200ml.脱色液：甲醇250ml 冰乙酸80ml去离子水200ml。
TEMED（四甲基乙二胺）四、实验操作1 PAGE凝胶的制备12%分离胶配方大约注入玻璃板的2/3轻轻在其顶层加入少量去离子水以磨平胶面。
聚丙烯酰氨凝胶电泳
等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。
当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，可使蛋白质分子中的二硫键还原。
由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A(1A=10的负十次方米），这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。
因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW 为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳经常应用于提纯过程中纯度的检测，纯化的蛋白质通常在SDS电泳上应只有一条带，但如果蛋白质是由不同的亚基组成的，它在电泳中可能会形成分别对应于各个亚基的几条带。
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳具有较高的灵敏度，一般只需要不到微克量级的蛋白质，而且通过电泳还可以同时得到关于分子量的情况，这些信息对于了解未知蛋白及设计提纯过程都是非常重要的。
常见问题⒈ 配胶缓冲液系统对电泳的影响？在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。
实验十一 聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验十一聚丙烯酰胺凝胶电泳一：目的1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳技术；2、掌握同工酶遗传标记的分析方法；二：原理电泳(Electrophoresis)是指带电荷的粒子或分子在电场中移动的现象称为电泳。
大分子的蛋白质，多肽，病毒粒子，甚至细胞或小分子的氨基酸,核苷等在电场中都可作定向泳动.1937年Tiselius电泳仪进行血清蛋白电泳，它是在一U型管的自由溶液中进行的，电泳后用光学系统使各种蛋白所形成折光率差别成为曲线图象，将血清蛋白分为白蛋白,α1-球蛋白，α2-球蛋白，β-球蛋白和γ-球蛋白五种，随后，Wielamd 和Kanig 等于1948年采用滤纸条做载体，成功地进行了纸上电泳。
从那时起，电泳技术逐渐被人们所接受并予以重视，继而发展以滤纸，各种纤维素粉，淀粉凝胶，琼脂和琼脂糖凝胶，醋酸纤维素薄膜,聚丙烯酰胺凝胶等为载体，结合增染试剂如银氨染色，考马斯亮蓝等大大提高和促进生物样品着色与分辨能力，此外电泳分离和免疫反应相结合，使分辨率不断朝着微量和超微量(1ng～0.001ng)水平发展，从而使电泳技术获得迅速推广和应用。
电泳的基本原理生物大分子如蛋白质，核酸，多糖等大多都有阳离子和阴离子基团，称为两性离子。
常以颗粒分散在溶液中，它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用.在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即所谓电泳。
如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中，使颗粒具有恒定迁移速率的驱动力来自于颗粒上的有效电荷Q和电位梯度E.它们与介质的摩擦阻力f抗衡。
在自由溶液中这种抗衡服从Stokes定律. F=6πrvη这里v是在介质粘度为η中半径为r的颗粒的移动速度。
但在凝胶中，这种抗衡并不完全符合Stokes 定律.F取决于介质中的其他因子，如凝胶厚度,颗粒大小，甚至介质的内渗等。
电泳迁移率(mbility)m规定为在电位梯度E的影响下，颗粒在时间t中的迁移距离d. m=V / E t·E 迁移率的不同提供了从混合物中分离物质的基础，迁移距离正比于迁移率。
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过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳令狐文艳一、目的1、了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理2、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程3、了解过氧化物酶同工酶电泳过程二、实验原理：1、电泳原理及影响电泳的主要因素带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。
带电离子在电场中的泳动速度（1）和迁移率（泳动度）（2）V= E·q·a/6πrη (1) u= q·a/6πrη (2)由（2）式可以看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对迁移率产生影响。
因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。
并选用一定pH的缓冲液。
同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。
迁移率与粒子的大小（r）有关，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。
另外，迁移率还受电渗现象的影响。
所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。
例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。
因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。
聚丙烯酰胺凝胶结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。
这些特点，使得聚丙烯酰胺凝胶适合作区带电泳的支持介质。
最后，要考虑选用离子强度适宜的溶液。
一般低离子强度比较合适，因为此时导电性低，产生的热量较少。
同时可使被分离的带电离子对电流贡献最大从而加快电泳速度。
但也不能过低，它必须可以缓冲被分离样品中带电离子对凝胶pH的影响，且过低的离子强度易导致蛋白质凝聚。
一般最适的离子强度在0.01～0.1mol/L之间。
最常见的为0.05。
在稀溶液中，离子强度Ⅰ可用下式计算：Ⅰ＝1/2ΣmiZi2 (3) （3)式中，mi为离子的摩尔浓度，Zi为离子的价数。
2、聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
这种凝胶是以丙烯酰胺单体（Acrylamide，简写为Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（N,N’-Methylena Bisacrylamide，简写为Bis）在催化剂的作用下聚合而成的。
Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。
但在具有自由基团体系时，它们聚合。
引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。
化学聚合的引发剂是过硫酸铵 (NH4)2S2O3（Ammonium persulfate，简写为Ap），催化剂是N，N，N’,N’-四甲基乙二胺（Tetramethylenediamine，简写为TEMED）。
在催化剂TEMED的作用下，由过硫酸铵（Ap）形成的自由基又使单体形成自由基，从而引起聚合作用。
冷却可使聚合速度变慢；一些金属抑制聚合；分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。
这些因素在实际操作时都应予以控制。
光聚合以光敏感物核黄素（即VB2）作为催化剂，在痕量氧存在下，核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。
聚丙烯酰胺的基本结构，为丙烯酰胺单位构成的长链，链与链之间通过甲叉桥联结在一起。
链的纵横交错，形成三维网状结构，使凝胶具有分子筛性质。
网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。
此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。
每100ml凝胶溶液中含有的单体（Acr）和交联剂（Bis）总克数称为凝胶浓度，用T％表示。
凝胶溶液中，交联剂（Bis）占单体（Acr）和交联剂（Bis）总量的百分数称为交联度，用C％表示。
改变凝胶浓度以便适应各种样品的分离。
一般常用7.5％浓度的聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质，而用2.4%的分离核酸。
但根据蛋白质与核酸分子量不同，适用的浓度也不同（见表1）。
表1 凝胶浓度选用表3、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理系统的不连续性表现在以下几个方面：1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。
上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
浓缩胶：又称堆积胶。
凝胶浓度较小，孔径相对较大。
把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用二被浓缩在一个狭窄的区带，使样品组分在分离胶中得以高分辨率的分离。
分离胶:又称电泳胶，通常孔径较小，通过选择合适的凝胶浓度，使样品组分得以很好地分离。
分离胶又分为均一胶和梯度胶。
2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。
本实验采用碱性系统。
电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。
而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。
3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。
下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用：（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。
（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。
这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。
（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。
其原因如下：①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。
使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。
②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH8.9。
HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。
待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。
电泳一开始，迁移率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。
在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）迁移率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。
这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。
在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其迁移率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。
由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区。
因为电位梯度V、电流强度I 和电导率S之间有如下关系：V＝I/S (4)所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。
这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。
本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。
这就是所谓的浓缩效应。
当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，迁移率迅速加大，从而赶上并超过所有酶蛋白分子。
此时，快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前，不连续的高电位梯度不再存在。
于是，此后的电泳过程中，酶蛋白在一个均一的电位梯度和pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。
与连续系统相比，不连续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。
4、过氧化物酶同工酶电泳同工酶是指其催化的化学反应相同，而酶的结构、理化性质乃至免疫性质不同的一组酶。
植物在发育过程中，所含同工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，因此作为基因表达的产物，测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具，在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有重要的意义。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，测定这种酶的活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离、鉴定土豆、豆芽过氧化物酶同工酶。
同工酶染色：根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带。
过氧化物酶能催化过氧化氢使联苯胺氧化成蓝色或棕色产物，据此即可将该酶在凝胶中显色定位。
三、实验材料、仪器与试剂1、材料土豆与豆芽2、仪器：DYCZ-24E电泳槽、DYY-11型和DYY-12型三恒多用电泳仪、台式高速离心机、微量进样器、芬兰可调移液器，研钵、50ml烧杯，量筒、大培养皿等玻璃器皿3、试剂：电泳试剂贮存液配置见附表(附表1)染色液成分：抗坏血酸70.4mg,联苯胺溶液(2g联苯胺溶于18ml温热冰醋酸中,再加入蒸馏水72ml)20ml,0.6%(或1.2%)过氧化氢20ml,蒸馏水60ml。
四、实验步骤①安装制胶模具（教师演示，学生安装）注意事项：a、在整个过程中要轻拿轻放，以免将玻璃板弄碎。
②制作分离胶(浓度10%)分离胶配方(浓度10%):pH8.9 Tris-HCl溶液:0.8ml分离胶PAG溶液:1.2ml蒸馏水:1.6ml10%TEMED:40μl%AP: 40μl将上述溶液充分混匀,立即全部倒入安装好的制胶玻板中,为使分离胶界面平整,可在倒入分离胶后约5min后在其表面沿高板缓慢均匀加入0.5ml蒸馏水并将电泳槽轻轻敲击桌面。
再静置40min左右,让分离胶凝聚完全。
③制作浓缩胶(浓度2.4%)浓缩胶配方(浓度2.4%):pH6.7 Tris-HCl溶液:0.42 ml浓缩胶PAG溶液:1.25ml40%蔗糖溶液:1.25ml10%TEMED:30μl10%AP: 30μl将上述溶液充分混匀,在聚合完全的分离胶上,倒入浓缩胶,（注意在倒入浓缩胶前要去掉分离胶表层的水）同时插入梳子,直到溶液装满和梳子插平为止。
再静置40min左右,浓缩胶聚合完全后为乳白色。
（注意事项：A、在整个过程中要将制胶模具垂直方在桌面上，不容许倾斜。
B、充分混匀的（分离胶或浓缩胶）溶液应尽快用移液枪延高板的一侧慢慢加入胶板中C、胶制作完成后，松开卡板取下橡胶皮，然后再用卡板卡紧胶板。
要注意低板在内侧。
）④制样：取适量(2g)的马铃薯于研钵中,加1ml的PBS(磷酸缓冲液,pH7.4),于冰上研磨至匀浆状,收集在1.5ml的离心管中,在台式离心机中以8000rpm离心5min，取上清,即为粗酶提取液,其中含有所需的APX。
另外,豆芽研磨可取4g左右,同样加入1ml的PBS。