聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶.

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶

【目的要求】

1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。

2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质的操作技术。

【实验内容】

乳酸脱氢酶目前发现有五种同工酶，分别是LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，根据五种同工酶分子结构以及理化性质的不同，pI各不相同，在同一pH条件下带电荷多少不同，在电场中移动速度不同，可用电泳法将其分离。

采用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳可将新鲜血清中的乳酸脱氢酶同工酶进行分离，然后用由乳酸、NAD+、PMS、NBT组成的染色液染色，显示清楚的五条色带，即五种乳酸脱氢酶同工酶，从阳极到阴极分别是LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。最后将分离的乳酸脱氢酶凝胶柱用波层层析扫描仪在560nm波长处扫描，测出光密度，计算出各种LDH同工酶的百分含量。

【实验材料】

1．仪器与材料真空泵、圆盘电泳槽、电泳仪、刻度吸管、微量加样器、长头注射器、烧杯等。

2．试剂30％丙烯酰胺贮存液、催化剂1％过硫酸铵、1％TEMED缓冲液、电泳槽缓冲液、蔗糖、乳酸钠、辅酶I、PMS、NBT、7.5%醋酸溶液

3．样品血清

【基本步骤】

1. 准备玻璃管：准备5×60mm玻璃管若干支，洗净烤干，管下端套一密塞的橡皮套或瓶塞，垂直插入管架上。

2. 配制凝胶：TEMED缓冲液 1.5ml

30%Acr-Bis溶液 4ml

蒸馏水6ml

混匀真空抽气5分钟

0.14%过硫酸铵6ml

轻轻摇匀准备装管

3. 装管：用细长滴管或长头注射器吸取凝胶装入玻璃管中，高度距离管上口8mm为宜，检查管内无气泡后，向胶面缓缓注入蒸馏水约4mm高度，在自然光下聚合约40分钟，见水与胶之间有明显界面出现，为胶已聚合。用滤纸条吸取凝胶上方水层，取下管底部的橡皮套管，将凝胶管垂直插入电泳槽圆孔中并尽量使各管高度一致。

4. 加样：用微量加样器每管加血清—蔗糖稀释液100ul，（血清1份，40%蔗糖6份，

溴酚兰少许混合而成）。用电极缓冲液将胶管顶端注满，小心避免样品混合。在上下槽中加入电极缓冲液，上槽应漫过胶管上口。

5. 电泳：接通电源，负极接上槽，正极接下槽，调电流2.5mA/管或调电压200V，保持电压稳定。等染料迁移到距凝胶下口约5mm处时，停止电泳。时间约2小时。

6. 出胶：用长头注射器吸满水，将针头小心插入凝胶与玻管壁之间，边推水边旋转胶管，凝胶柱即可脱出。将每条胶柱放入小试管内。

7. 染色：管内加染色液，放37℃水浴保温待淡紫色区带出现（约30分钟）。倒出染色液并用水洗去凝胶柱表面染色液，加入醋酸溶液以终止酶促反应。

8. 扫描测百分含量：将分离的LDH同工酶凝胶柱用薄层层析扫描仪在560nm波长处扫描，测出光密度，计算出各种LDH同工酶的百分含量。

计算方法：总光密度：T=OD LDH1+OD LDH2+OD LDH3+OD LDH4+OD LDH5

【结果与分析】

正常人血清LDH各同工酶活力百分比是：LDH l33.4％；LDH242.8％；LDH3

18.5％；LDH43.9％；LDH5l.4％。不同方法测定值略有不同。

【注意事项】

1. 所用器材必须清洁。特别是制备凝胶柱所用的玻璃管每次用后必须用洗液浸泡，再常规清洗，否则凝胶剥离困难。

2. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经性毒剂，对皮肤有刺激作用，应避免直接接触。

3. 电泳完毕后，上下槽电极缓冲液不可混合，因离子强度和pH值都已发生改