聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶

3、样品的制备

过氧化物酶的提取：称 取1g甘薯叶柄置于冰浴 上的研钵内，加入1ml样 品提取液(内含 pH6.8 、 0.05mol/L Tris－HCl， 20%蔗糖)研成匀浆后， 再加2ml提取液研磨均匀， 转入离心管，于3500rpm 离心15min，其上清液即 为酶的提取液，供电泳 分析用。
电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同
聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应: 1) 浓缩效应、2) 电荷效应、3) 分子筛效应
电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺。B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢 离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
TEMED 丙烯酰胺 + 甲叉双丙烯酰胺------------------聚丙烯酰胺凝胶 Ap (三维网状结构)
AP-TMTLeabharlann BaiduD催化体系

TEMED催化AP生成硫酸自由基：
S2O82－
¯ 2SO4·

硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
Bis将单体长链间连成网状结构：
通过改变凝 胶浓度及交 联度来调节 凝胶的孔径， 具有良好的 分子筛效应。
实验六 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离过氧化物同工酶
（垂直板状）
福建农林大学生命科学院 植物生理生化实验室
一、目的意义

同工酶
凡能催化同一种化学反应，但其分子结构和带电性质不同 的一组酶称同工酶（isoenzyme）

电泳
各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的 颗粒，这种带电颗粒在电场的作用下向相反电极移动的现 象称为电泳（electrophoresis）。
(2) 浓缩胶的配制：
试剂贮备液瓶号 ①浓缩胶缓冲液 ②浓缩胶贮液 ③过硫酸铵 蒸馏水
吸取毫升数

1ml
2ml
4ml
1ml
将水倒掉，用少量浓缩胶 润洗。再将配好的浓缩胶 注入已凝固的分离胶上， 胶液加到胶室的顶部,插 入样品梳，静止聚合。胶 聚合好后，小心地取出梳 子，用吸水纸吸去样品槽 内的水分，点样。
6、剥胶、染色


剥胶：电泳完毕，将电泳 槽取出，倒去缓冲液，取 下玻璃夹心板，剥出胶片， 放入培养皿中。 染色：取0.5ml联苯胺母液 ＋H2O 9.3ml＋0.2ml 3%H2O2，混匀后倒入盛 有凝胶片的培养皿。很快 就可以看到胶片上出现蓝 色或棕褐色条带，即过氧 化物酶带，约5-6min后用 自来水冲洗，这时蓝色带 也慢慢变成棕褐色。
试剂贮备液瓶号 ①分离胶缓冲液 吸取毫升数

②分离胶贮液 ③过硫酸铵 蒸馏水 4ml 8ml 2ml
2ml
混匀，立即用装有针头的注射器将凝胶液缓缓注入已准 备好的干洁胶室中。胶室两侧和底部要防止渗漏，注胶 过程中要防止气泡产生。胶液加至离玻璃板顶部约 0.8cm处，此时将电泳槽垂直放置；立即注入蒸馏水使 胶的表面覆盖少量水层。约30min后，胶和水层之间出 现清晰的界面，表明聚合完成。




五、思考题
简述“过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶 电泳”实验中所用的过硫酸铵、四甲基乙 二胺、蔗糖、溴酚蓝、H2O2等试剂的作用 是什么？
二、实验原理

聚丙烯酰胺凝胶 垂直板电泳 不连续系统 分离因素



1、聚丙烯酰胺凝胶 作为电泳的支持物
•聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉 双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂 N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成 的三维网状结构的凝胶。
7、绘制酶谱条带，并计算各同工酶的迁移率

[结果计算]： a Rf值 = ----b
a
b
四、注意事项

安装玻璃夹心槽时，两片玻璃要干燥，有机玻璃条要夹平并用 胶布密封好。 分离胶或浓缩胶配制好的混合液要马上进行灌胶，以免溶液聚 合成胶。 过硫酸铵要现用现配。 分离胶灌好，上层要覆盖一层水层，避免胶氧化，同时使分离 胶胶面平整。 电泳仪连接电泳槽后，通电要严格控制电泳，每个电泳槽的电 流不能超过10mA,电压不能超过170V，电压过高会导致玻璃板 裂开。 染料必须现用现配。
三维网状结构的凝胶
2、垂直板电泳
将配制好的凝胶 溶液注入到两块垂 直放置的玻璃板之 间聚胶，然后加样 进行电泳。
圆盘电泳
3、采用不连续垂直板状聚丙烯酰胺凝胶电泳 (缓冲液、pH值和凝胶孔径不同)

不连续系统

浓缩效应
4、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶 电泳中的分离因素
电荷因素
分子大小 分子形状

5、染色：电泳后根据酶的生物化学反应，通过活性染色
方法迅速显示出酶的不同区带，即酶谱。
三、实验操作
流程图
电泳槽安装
分离胶制备
注分离胶
染
色
浓缩胶制备
电
泳
上
样
注浓缩胶
1、电泳槽的安装
本实验使用夹芯式垂直板电泳槽：将两片干燥
的玻璃板用有机玻璃条间隔开并用胶布密封好。
2、凝胶的制备
(1) 分离胶配制方法：
4、点样

点样：用微量注射器吸 取上清液，每样品槽加 样15μl，用注射器将电极 缓冲液慢慢加入每槽至 淹没顶部为止。最后向 上、下电泳槽倒入电极 缓冲液（上槽必须淹没 管顶，下槽液要能浸泡 着凝胶板），最后在上 槽液中滴入1滴溴酚蓝溶 液。
5、电泳
将电泳槽放至低温处， 最 好 在 4℃ 左 右 ， 或 接 通 电泳槽水冷却系统，按上 槽接“一”下槽接“＋” 接好导线，通电，电泳开 始电流应低，每槽1mA， 10min 后 ， 再 加 大 电 流 ， 使每槽样品达到2mA，当 溴酚蓝指示剂达到距管底 约 0.5cm 处 时 ， 切 断 电 流 ， 停止电泳。