聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析(实验报告)
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶生物111班杨明轩1102040128一、研究背景及目的过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 -1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。
这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。
而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。
它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。
在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。
品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。
育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。
在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。
要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。
基于“差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。
但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。
因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。
同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。
过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳之欧阳引擎创编
过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳欧阳引擎（2021.01.01）一、目的1、了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理2、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程3、了解过氧化物酶同工酶电泳过程二、实验原理：1、电泳原理及影响电泳的主要因素带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。
带电离子在电场中的泳动速度（1）和迁移率（泳动度）（2）V= E·q·a/6πrη (1) u= q·a/6πrη (2)由（2）式可以看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对迁移率产生影响。
因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。
并选用一定pH的缓冲液。
同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。
迁移率与粒子的大小（r）有关，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。
另外，迁移率还受电渗现象的影响。
所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。
例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。
因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。
聚丙烯酰胺凝胶结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。
这些特点，使得聚丙烯酰胺凝胶适合作区带电泳的支持介质。
最后，要考虑选用离子强度适宜的溶液。
一般低离子强度比较合适，因为此时导电性低，产生的热量较少。
同时可使被分离的带电离子对电流贡献最大从而加快电泳速度。
但也不能过低，它必须可以缓冲被分离样品中带电离子对凝胶pH的影响，且过低的离子强度易导致蛋白质凝聚。
一般最适的离子强度在0.01～0.1mol/L之间。
最常见的为0.05。
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
实验八聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
２掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。
３掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。
４掌握过氧化物酶的活性的测定。
二实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂（即共聚体的N,N－甲叉双丙烯酰胺Bis）在加速剂（N,N,N',N'－四甲基乙二胺TEMED）和催化剂（过硫酸胺(NH4)4S2O8 简称AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化剂（AP）或核黄素（C17H20O6N4）和加速剂（TEMDA）的作用下聚合而成的三维网状结构。
催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：①AP-TEMED 属化学聚合作用②核黄素－TEMED 属光聚合作用２凝胶孔径的可调性及其相关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比：a:b<10 脆硬乳白交联度：a:b>100糊状易断②凝胶浓度与孔径的关系T（Acr和Bis总浓度）增加孔径减小移动颗粒穿过网孔阻力增加③凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加阻力增加移动速度减慢。
同时还与分子形状及分子电荷有关系。
在操作时，可以选用凝胶。
因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。
３试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。
不连续系统：电泳体系中由于缓冲液离子成分、PH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还有浓缩效应。
实验五过氧化物同工酶PAGE分析
成分
含量
作用
A液（30%Acr-0.8%Bis） 2.65mL
交联剂
B液（Tris+EDTA） 4.75mL
缓冲液
C液（TEMED）
10μL
加速剂
D液（10% AP）
50μL
催化剂
四、操作步骤
样品制备 称取小麦幼苗叶片0.5 克，放入研钵内，
加 pH8.0 样品提取液1mL，于冰浴中研 成匀浆，转入离心管，在高速离心机上以 8000rpm 离心 10 分钟，倒出上清液， 以等量 40%蔗糖混合，并加2滴溴酚蓝， 即为样品液。
同功酶是机体调节酶活性的一种方式，在各种生物体中 广泛存在。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。 它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。 在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此， 测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某 一时期植物体内代谢的变化。
（二）过氧化物同工酶及其活性染色（P98）
三、材料、仪器和试剂
试剂：
A液：30%Acr-0.8%Bis B液：Tris+EDTA C液：TEMED D液：10%AP 电极缓冲液：硼酸钠-硼酸（pH8.3） 0.5%溴酚蓝 染色液：0.1%联苯胺 样品提取液：pH8.0Tris-HCl缓冲液 40%蔗糖溶液
四、操作步骤
凝胶制备
四、操作步骤
装槽、上样
30-50μL
四、操作步骤
电泳 接好电源线(上槽接负极，下槽接正极)。
打开电源开关，调节电压，以10V/cm稳 定电压电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行 至距胶板末端1-2 厘米处，即可停止电泳。
四、操作步骤
剥胶、染色
实验9-10 植物过氧化物酶同工酶的测定(凝胶圆盘电泳)
（五）记录并计算： 记录并计算： 观察、记录酶谱， 观察、记录酶谱，并 计算各同工酶的相对 迁移率。 迁移率。
【要点提示】 要点提示】
1. 分离胶聚合时间应控制在 ～60min，聚合过 分离胶聚合时间应控制在30～ ， 快使凝胶太脆易断裂，主要是AP或 快使凝胶太脆易断裂，主要是 或TEMED过 过 量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是AP或 量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是 或 TEMED用量不足或已失效。 用量不足或已失效。 用量不足或已失效 2. 电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水，则表示电压 电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水， 或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、 或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、 凝胶底部断裂等，应注意调整。 凝胶底部断裂等，应注意调整。特别是进入分 离胶后应通过控制电压，调节电流不超过5mA/ 离胶后应通过控制电压，调节电流不超过 管。
（四）染色： 染色： 临用时配制染色液：（ ml ） 临用时配制染色液：（10 ：（ 联苯胺母液 H2O 3% H2O2 0.5 ml 9.3 ml 0.2 ml
将染液倒入盛有凝胶条的试管中（ 将染液倒入盛有凝胶条的试管中（没过 胶条）。约10min后用自来水冲洗。 胶条）。约 后用自来水冲洗。 ）。 后用自来水冲洗
【实验步骤】 实验步骤】
（一）过氧化物酶的提取：取8~12粒发芽 过氧化物酶的提取： 粒发芽 的麦粒，加入1ml H2O 或0.5mol/L Tris的麦粒，加入 HCl缓冲液（pH 6.8），冰浴上研成匀浆。 缓冲液（ ），冰浴上研成匀浆。 缓冲液 ），冰浴上研成匀浆 转入离心管，再用2ml上述溶液冲洗研钵 转入离心管，再用 上述溶液冲洗研钵 壁并全部转入离心管，4000r/min离心 壁并全部转入离心管， 离心10 离心 min，上清液供电泳分析用。 ，上清液供电泳分析用。
实验二 过氧化物酶同工酶的提取、分离
实验二过氧化物酶同工酶的提取、分离苟亚峰摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定玉米幼苗过氧化物酶同工酶，实验结果显示玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。
关键词：过氧化物同工酶；PAGE；电泳分离引言同工酶是指催化同一种化学反应，但酶的分子结构组成却有所不同的一组酶。
同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。
电泳(electrophoresis，简称EP ) 指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
1937年瑞典科学家Tiselius 成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖。
50年代，先后出现了以滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物的电泳技术。
60年代，出现了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。
这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。
化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。
实验六：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶实验报告
班级：植物142 姓名：刘国强学号：1401080229实验六：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工一、研究背景及目的同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
它们是DNA 编码的遗传信息表达的结果。
研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。
因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼叶叶片和根部的过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配制等问题，熟悉所有的操作过程二、实验原理本实验采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，分离小麦幼叶叶片和根部的过氧化物酶同工酶。
利用过氧化物酶在分解过氧化氢的过程中产生自由氧基，从而将联大茴香胺连接到过氧化物酶分子上，使之呈现棕褐色，将电泳后的凝胶置于含有过氧化氢的联大茴香胺染色液中浸泡，有过氧化酶同工酶蛋白的部位便可以观察到褐色的谱带。
通过这些谱带的数量、位置等获得相关信息。
三、仪器试剂1．实验材料小麦幼苗2．仪器:垂直板电泳槽(型号：DYY-III28A型电泳槽厂家：北京市六一仪器厂) 电泳仪（型号：DYY-III2稳压稳流电泳仪厂家：北京市六一仪器厂）主要器具：移液器、微量进样器、培养皿一套（直径15cm）、小烧杯3.试剂（1）分离胶缓冲液(pH8.9 Tris-HCl缓冲液)：称取48 mL 1mol/L HCl，Tris36.8g，用无离子水溶解后定容至100 mL。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分析过氧化物酶同工酶
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶一、目的同工酶是指能催化同一种化学反应， 但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组 酶。
它们是 DNA 编码的遗传信息表达的结果。
最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生 长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的 意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于 观察、记录和保存。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生 长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。
因此，测定这种酶 的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶 的生物化学反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配制等问题，熟悉所有 的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。
二、原理1．电泳现象带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
由于带电胶粒或分子中各种成份，所具有的电荷和分子量不同，在电场中将以不同的速 度移动，因而在电泳进行过程中，不同的成份将按照各自的迁移速度得到有效的分离。
2．影响电泳的主要因素若将带净电荷 q 的粒子放入电场，则该粒子所受到的引力 F 引可用数学式表示如下：F 引 =E × q (1)式中 E 为电场强度，单位为“伏特／厘米” ，表示电场中单位距离上的电位差。
如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。
但 在溶液中，由于电场的牵引力 F 引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力（即摩擦力）F 阻 相对抗，故上述现象不会发生。
根本 Stokes 公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以 及所在介质的粘度：F 阻 = 6pghn(2) 式中 F 阻是球形粒子所受的阻力，g 是球形粒子的半径，h 是溶液的粘度，n 是粒子移动的速度。
植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳实验指导
植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳【目的】1．掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作过程。
2．了解聚丙烯酰胺圆盘电泳的实际应用，利用此法分离植物过氧化物同工酶。
【概述】1．聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支承物的一种电泳技术。
其凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构。
凝胶网孔的大小可通过改变单体浓度和交联剂浓度的比例加以调节，常用的所谓标准凝胶是指含丙烯酰胺7%～7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能达到满意的结果。
聚丙烯酰凝胶电泳过程中除了一种电泳所具有的电荷效应外，还具有“分子筛”效应；不连续的凝胶电泳过程中具有电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
不连续凝胶电泳体系的不连续性体现在：（1）凝胶由上、下两层组成，两层胶孔孔径不同。
上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH 值不同。
如常用的碱性系统中，电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl 缓冲液，分离胶为pH8.9的Tris-HCl 缓冲液。
（3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这种不连续的系统中有三种物理效应起作用，使样品分离效果好、分辨率高。
这三种效应是电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
① 电荷效应 由于各种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而在一定电场作用下迁移率不同。
承载有并效电荷多的，泳动的快，反之则慢。
CH 2CH C=O NH 3CH 2=CH C=O NH CH 2NH C=O CH 2+CH 2CH C=O NH 3CH 2CH C=O NH 3C=O NH CH 2NH C=O CH 2CH 2CH [[]]nn 催化剂② 分子筛效应 因为聚丙烯酰胺具有网孔结构，所以直径大，形状不规则的分子，电泳时通过凝胶受到的阻力大，移动较慢；分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到的阻力小移动较快。
聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE
过氧化物酶染色原理
过氧化物酶能催化过氧化氢把联苯胺氧化 为蓝色或棕色产物
电泳装置
本实验采用不连续系统凝胶电泳，
整个电泳系统包括DYY型常压电泳
仪、夹心式垂直板电泳槽。
试剂
（1）1.5％琼脂 （3）分离胶缓冲液，pH8.9 (pH8.9 Tris-HCl缓冲液) （5）浓缩胶缓冲液，pH6.7 (pH6.7 Tris-HCl缓冲液) （2）核黄素溶液 （4）电极缓冲液，pH8.3 (pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液) （6）40％蔗糖溶液
实验4、聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析过氧化物酶同工酶
同工酶
• 电泳 是指带电粒子在电场中向与其自
身带相反电荷的电极移动的现象。
带负电粒子
正极
带正电粒子
负极
影响电泳速度的外界因素
1.电场强度
电场强度也称电位梯度，是指单位长度 （每一厘米）支持物体上的电位降 一般，电场强度越高，带电颗粒移动速 度越快。 过高、过低均不宜 当需要增大电场强度以缩短电泳时间时， 需附有冷却装置
2．缓冲液的pH值和离子强度
pH 值距离其等电点愈远，其所带 净电荷量就越大，电泳的速度也 就越大
缓冲液通常要保持一定的离子强 度，一般所用离子强度为 0.020.2之间。
3.电渗现象
液体在电场中对于一个固体支 持物的相对移动，称为电渗现 象。
电渗方向影响泳动速率
4、温度的影响
温度每升高 1 ℃，迁移率约增加 2.4%。为降低热效应对电泳的影 响，可控制电压或电流，或在电 泳系统中安装冷却散热装置。
pH8.9
(a)
１、电荷效应：各种蛋白质按其所带电 荷的种类及数量，在电场向一定电极， 以一定速度泳动。
同工酶分析自材料
一、植物过氧化物酶同工酶的测定：
【实验原理】
以聚丙烯酰胺为支持介质的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。
PAGE 兼有电荷效应和分子筛效应。
被分离物质由于所载电荷数量、分子大小和形状的差异，在电泳时产生不同的泳动速率而相互分离。
过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。
利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯氨氧化成蓝色或棕褐色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于有H2O2联苯胺的溶液染色，出现蓝色或褐色的部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多余有色带即构成过氧化物酶同工酶谱。
二、
三/
，过氧化氢酶（CAT）是由一条肽链组成的同四聚体酶。
同工酶的分析是根据同工酶分子结构的
差异，通常用电泳技术加以分离后，再根据
它们的催化作用相同因而可能使用同一显色
法测定其酶活性的原理获得同工酶谱。
一个基因的产物也可能形成一个
以上的同工酶带。
这可能是由于多肤合成之
后的分解(形成大小不同的酶分子)或极性修
饰或分子构型发生改变而产生多条酶带。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
TEMED 丙烯酰胺 + 甲叉双丙烯酰胺------------------聚丙烯酰胺凝胶 Ap (三维网状结构)
AP-TMTED催化体系
TEMED催化AP生成硫酸自由基：
S2O82－
¯ 2SO4·
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
Bis将单体长链间连成网状结构：
通过改变凝 胶浓度及交 联度来调节 凝胶的孔径， 具有良好的 分子筛效应。
试剂贮备液瓶号 ①分离胶缓冲液 吸取毫升数
②分离胶贮液 ③过硫酸铵 蒸馏水 4ml 8ml 2ml
2ml
混匀，立即用装有针头的注射器将凝胶液缓缓注入已准 备好的干洁胶室中。胶室两侧和底部要防止渗漏，注胶 过程中要防止气泡产生。胶液加至离玻璃板顶部约 0.8cm处，此时将电泳槽垂直放置；立即注入蒸馏水使 胶的表面覆盖少量水层。约30min后，胶和水层之间出 现清晰的界面，表明聚合完成。
3、样品的制备
过氧化物酶的提取：称 取1g甘薯叶柄置于冰浴 上的研钵内，加入1ml样 品提取液(内含 pH6.8 、 0.05mol/L Tris－HCl， 20%蔗糖)研成匀浆后， 再加2ml提取液研磨均匀， 转入离心管，于3500rpm 离心15min，其上清液即 为酶的提取液，供电泳 分析用。
7、绘制酶谱条带，并计算各同工酶的迁移率
[结果计算]： a Rf值 = ----b
a
b
四、注意事项
安装玻璃夹心槽时，两片玻璃要干燥，有机玻璃条要夹平并用 胶布密封好。 分离胶或浓缩胶配制好的混合液要马上进行灌胶，以免溶液聚 合成胶。 过硫酸铵要现用现配。 分离胶灌好，上层要覆盖一层水层，避免胶氧化，同时使分离 胶胶面平整。 电泳仪连接电泳槽后，通电要严格控制电泳，每个电泳槽的电 流不能超过10mA,电压不能超过170V，电压过高会导致玻璃板 裂开。 染料必须现用现配。
过氧化物酶同工酶的提取、分离
反之越快； ⑤电场强度：
电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快； ⑥离子强度：
离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快； ⑦电渗现象：
电场中，液体相对于固体支持物的相对移动； ⑧支持物筛孔大小：
孔径小，电泳速度慢，反之则快。
6
4、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作 为载体的一种区带电泳。
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(1)聚丙烯胺凝胶的生成：
聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲 叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。在具 有自由基时，Acr和Bis就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：
①化学法 ②光聚合法
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①化学聚合：
引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’－ 四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生氧自由 基，激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝 胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；
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4.2 点样：
轻拔电泳梳子→用微量进样器点样→每孔约30μl。
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5、电泳：
接通电源→稳流→调节电流到每孔 1mA左右→当溴酚蓝前沿进入分离胶后，可 适当加大电流→待前沿下行到距胶末1cm处，
停止电泳。
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6、剥胶、固定、染色：
将凝胶板取下→放入装水瓷盘中→剥 下胶片→并浸洗二次→倒去水→加入固定 液10分钟→倒去固定液→加显色液（联苯 胺），显色→观察记录。
a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a 与b的重量比应在30左右。常用29 ： 1
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(4)不连续PAGE的原理：
第一、三个不连续性： ①凝胶孔径的不连续； ②缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续； ③在电场中形成的电位梯度的不连续。
过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳之欧阳治创编
过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳一、目的1、了解聚丙烯酰胺凝胶电泳原理2、了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程3、了解过氧化物酶同工酶电泳过程二、实验原理：1、电泳原理及影响电泳的主要因素带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。
带电离子在电场中的泳动速度（1）和迁移率（泳动度）（2）V= E·q·a/6πrη (1) u= q·a/6πrη (2)由（2）式可以看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量q及解离度a的因素如pH的改变，都会对迁移率产生影响。
因此，电泳应尽可能在恒温条件下进行。
并选用一定pH的缓冲液。
同时，所选用的pH以能扩大各种被分离物质所带电荷量的差异为好，以利于分离各种成分。
迁移率与粒子的大小（r）有关，非球形粒子（如DNA）在电泳过程中会受到更大的阻力，即粒子的移动速度还与粒子形状有关。
另外，迁移率还受电渗现象的影响。
所谓电渗是指在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。
例如在纸电泳中，由于滤纸（纤维素）上带有负电荷，因感应相吸而使与滤纸相接触的水溶液带正电荷，从而使液体向负极移动，带动着本来是向负极泳动的物质以更快的速度移动。
因此，电泳时应避免用高电渗物质作支持介质。
聚丙烯酰胺凝胶结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。
这些特点，使得聚丙烯酰胺凝胶适合作区带电泳的支持介质。
最后，要考虑选用离子强度适宜的溶液。
一般低离子强度比较合适，因为此时导电性低，产生的热量较少。
同时可使被分离的带电离子对电流贡献最大从而加快电泳速度。
但也不能过低，它必须可以缓冲被分离样品中带电离子对凝胶pH 的影响，且过低的离子强度易导致蛋白质凝聚。
一般最适的离子强度在0.01～0.1mol/L 之间。
最常见的为0.05。
在稀溶液中，离子强度Ⅰ可用下式计算： Ⅰ＝1/2ΣmiZi 2 (3) （3)式中，mi 为离子的摩尔浓度，Zi 为离子的价数。
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6、剥胶、染色
剥胶：电泳完毕，将电泳 槽取出，倒去缓冲液，取 下玻璃夹心板，剥出胶片， 放入培养皿中。 染色：取0.5ml联苯胺母液 ＋H2O 9.3ml＋0.2ml 3%H2O2，混匀后倒入盛 有凝胶片的培养皿。很快 就可以看到胶片上出现蓝 色或棕褐色条带，即过氧 化物酶带，约5-6min后用 自来水冲洗，这时蓝色带 也慢慢变成棕褐色。
试剂贮备液瓶号 ①分离胶缓冲液 吸取毫升数
②分离胶贮液 ③过硫酸铵 蒸馏水 4ml 8ml 2ml
2ml
混匀，立即用装有针头的注射器将凝胶液缓缓注入已准 备好的干洁胶室中。胶室两侧和底部要防止渗漏，注胶 过程中要防止气泡产生。胶液加至离玻璃板顶部约 0.8cm处，此时将电泳槽垂直放置；立即注入蒸馏水使 胶的表面覆盖少量水层。约30min后，胶和水层之间出 现清晰的界面，表明聚合完成。
三维网状结构的凝胶
2、垂直板电泳
将配制好的凝胶 溶液注入到两块垂 直放置的玻璃板之 间聚胶，然后加样 进行电泳。
圆盘电泳
3、采用不连续垂直板状聚丙烯酰胺凝胶电泳 (缓冲液、pH值和凝胶孔径不同)
不连续系统
浓缩效应
4、蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶 电泳中的分离因素
电荷因素
分子大小 分子形状
4、点样
点样：用微量注射器吸 取上清液，每样品槽加 样15μl，用注射器将电极 缓冲液慢慢加入每槽至 淹没顶部为止。最后向 上、下电泳槽倒入电极 缓冲液（上槽必须淹没 管顶，下槽液要能浸泡 着凝胶板），最后在上 槽液中滴入1滴溴酚蓝溶 液。
5、电泳
将电泳槽放至低温处， 最 好 在 4℃ 一”下槽接“＋” 接好导线，通电，电泳开 始电流应低，每槽1mA， 10min 后 ， 再 加 大 电 流 ， 使每槽样品达到2mA，当 溴酚蓝指示剂达到距管底 约 0.5cm 处 时 ， 切 断 电 流 ， 停止电泳。
TEMED 丙烯酰胺 + 甲叉双丙烯酰胺------------------聚丙烯酰胺凝胶 Ap (三维网状结构)
AP-TMTED催化体系
TEMED催化AP生成硫酸自由基：
S2O82－
¯ 2SO4·
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
Bis将单体长链间连成网状结构：
通过改变凝 胶浓度及交 联度来调节 凝胶的孔径， 具有良好的 分子筛效应。
5、染色：电泳后根据酶的生物化学反应，通过活性染色
方法迅速显示出酶的不同区带，即酶谱。
三、实验操作
流程图
电泳槽安装
分离胶制备
注分离胶
染
色
浓缩胶制备
电
泳
上
样
注浓缩胶
1、电泳槽的安装
本实验使用夹芯式垂直板电泳槽：将两片干燥
的玻璃板用有机玻璃条间隔开并用胶布密封好。
2、凝胶的制备
(1) 分离胶配制方法：
实验六 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离过氧化物同工酶
（垂直板状）
福建农林大学生命科学院 植物生理生化实验室
一、目的意义
同工酶
凡能催化同一种化学反应，但其分子结构和带电性质不同 的一组酶称同工酶（isoenzyme）
电泳
各种生物大分子在一定pH条件下，可以解离成带电荷的 颗粒，这种带电颗粒在电场的作用下向相反电极移动的现 象称为电泳（electrophoresis）。
3、样品的制备
过氧化物酶的提取：称 取1g甘薯叶柄置于冰浴 上的研钵内，加入1ml样 品提取液(内含 pH6.8 、 0.05mol/L Tris－HCl， 20%蔗糖)研成匀浆后， 再加2ml提取液研磨均匀， 转入离心管，于3500rpm 离心15min，其上清液即 为酶的提取液，供电泳 分析用。
(2) 浓缩胶的配制：
试剂贮备液瓶号 ①浓缩胶缓冲液 ②浓缩胶贮液 ③过硫酸铵 蒸馏水
吸取毫升数
1ml
2ml
4ml
1ml
将水倒掉，用少量浓缩胶 润洗。再将配好的浓缩胶 注入已凝固的分离胶上， 胶液加到胶室的顶部,插 入样品梳，静止聚合。胶 聚合好后，小心地取出梳 子，用吸水纸吸去样品槽 内的水分，点样。
电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同
聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应: 1) 浓缩效应、2) 电荷效应、3) 分子筛效应
电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺。B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢 离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
五、思考题
简述“过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶 电泳”实验中所用的过硫酸铵、四甲基乙 二胺、蔗糖、溴酚蓝、H2O2等试剂的作用 是什么？
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶 垂直板电泳 不连续系统 分离因素
1、聚丙烯酰胺凝胶 作为电泳的支持物
•聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉 双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂 N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成 的三维网状结构的凝胶。
7、绘制酶谱条带，并计算各同工酶的迁移率
[结果计算]： a Rf值 = ----b
a
b
四、注意事项
安装玻璃夹心槽时，两片玻璃要干燥，有机玻璃条要夹平并用 胶布密封好。 分离胶或浓缩胶配制好的混合液要马上进行灌胶，以免溶液聚 合成胶。 过硫酸铵要现用现配。 分离胶灌好，上层要覆盖一层水层，避免胶氧化，同时使分离 胶胶面平整。 电泳仪连接电泳槽后，通电要严格控制电泳，每个电泳槽的电 流不能超过10mA,电压不能超过170V，电压过高会导致玻璃板 裂开。 染料必须现用现配。