过氧化物酶同工酶提取、分离
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析(实验报告)
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶生物111班杨明轩1102040128一、研究背景及目的过氧化物酶是以过氧化氢为电子受体催化底物氧化的酶，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系，在种子萌动以前,它们的过氧化物酶同工酶很少,待幼芽长到0.5 -1 厘米以后,它们的过氧化物酶才得到充分的表达。
这说明植物过氧化物酶同工酶的多寡和有无,与植物不同发育时期,与植物的不同组织、器官的分化形成及特定的生理状态等均有密切关系。
而同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
大多数基因性同工酶由于对底物亲和力不同和受不同因素的调节，常表现不同的生理功能。
它们存在于生物的同一种属或同一个体的不同发育阶段，或同一发育阶段的不同组织，在细胞发育和代谢调解中起重要作用。
在动、植物中，一种酶的同工酶在各组织、器官中的分布和含量不同，形成各组织特异的同工酶谱，体现各组织的特异功能，这一特点可用于研究物种进化、遗传变异、杂交育种和个体发育、组织分化等。
品种资源工作者借助同工酶分析品种的地理分布与亲缘关系来指导品种资源的收集与鉴定工作。
育种工作者常用同工酶来作为鉴定植物的种间杂交, 特别是远缘杂交的生化指标。
在医学方面，同工酶是研究癌瘤发生的重要手段。
要对同工酶展开研究，首先要实现对它的分离，因此要选择合适的分离技术。
基于“差异转化”的思路，层析和电泳是两种最为常见的大分子分离方法。
但由于二者技术细节上的差异，层析更常用于大分子的分离纯化，而电泳则主要用于大分子的分离检测。
因此在本次实验中，我们采用不连续的聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗中的过氧化物酶同工酶。
同时本实验利用电泳现象对过氧化物同工酶进行分离纯化和分析鉴定，通过电泳技术的实际操作体会电泳技术的原理和特点，比较分析电泳技术和其它分离技术如层析技术的不同，进一步学习应用更为广泛和纯化水平更高的分离技术。
几种植物中的过氧化物酶同工酶分析1)
将胶浸入染 色液 中 ５ ０ 神，取 出置 一１ 分
于 永 中＾ 沈 ， 止染 色。 ｀ ＇ 停
将胶 置于醋酸 缓冲液中沁 ２ 分钟， 。 再浸 入染色液中，２℃ 保佩染色 ２ ６ ０ ５ ０分钟 － 后， 取出 ， 水漂洗。
１ 酷酸联苯 ） 胺炸液：２ 克联茉胺溶于 １ 毫升醋酸中， ７ 毫升水。 ８ 加 ２
电泳在冰箱或低于 １ ℃ 的 室 温 下 进 行。 ５
力水至 １０ ｉ 」 ０ｎ１ １ ． 斗 ％ Ｆ 过硫酸 按（ ． 用前配划 、Ｆ Ｔｒ－ ． ｉ 泞檬酸缓冲 液忿 ｓ
１． 呢 ， ４ Ｉｒｓ ５． ８ ＋ 柠 檬 酸 ｉ １ ５
１０ ； ．ｇ
加水至 １ ０ １Ｐ Ｒ９ ０ ｍ， ． ０ Ｈ
＇ｒｓ ．ｑ ｒ ３ ０ ； ｉ ０
Ｔｒｓ ２ ； ｉ６ ｇ ．
甘氨ｌ １・ ； ， 斗斗 ｎ ： ９
甘氨酸 ２０； ． ｋ
至凝胶下端 ０ －１厘米处停止电泳。 电泳 时 ． ５
间约 ９－ １０分钟。 ０ ０ 过氧化物Ｒ 同工醉 的染色鉴定方 法 很 多，
染 色 方 法 染 色
加水至 １０ｒ ，爪 ｝３ 加水至 １０ｍｌ Ｈ ．； ０ ０ ｌ １ ． ： ｎ ００ ， ｈ７ ｐ 使用时杯释 １ 信－ ０ 随用时稀释 ５倍
个过氧化物酶同工酶相对活性的维生素 Ｃ 一联 苯胺染色法阁。 近些年来又较多地采用了丁子
香酚 （ｕｅ ｌ Ｅｇ ｏ ｎ ）一类夭然物作底物的新染
色法［ ９ １ ｃ 近年来， 由于同工酶测定、 分析技术在遗传
１ ）本工 作曾得到龚葵 同志的指导， 特致谢意 ， ２ 黄寿松：西北植物研究所进修人员。 ）
离心（５０．． １ 分钟， ３０ ：ｐｍ）５ ． 取上清液， 混人等
果蔬过氧化物酶酶学特性进展
· 62 ·过氧化物酶(peroxidase，POD，EC1.11.1.7)收稿日期：2012-03-30 *通讯作者基金项目：国家自然科学基金项目(31071625)。
作者简介：丁薪源(1989—)，女，吉林德惠人，硕士研究生，研究方向为食品质量与安全。
是广泛存在于各种动物、植物和微生物体内的一丁薪源，曹建康*(中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083)摘要：综述了过氧化物酶在植物抗性方面的作用及研究意义，并对抗性相关酶POD 的分离纯化、同工酶谱、酶结构及分布等酶学特性进行了综述。
分析得到，果蔬中过氧化物酶的最适pH 范围大部分集中在5.0~7.0之间，最适温度集中在30~60 ℃，对于大部分果蔬的过氧化物酶，Fe 2+、Fe 3+、Ca 2+、Mg 2+等金属离子有不同程度的激活作用，表面活性剂PEG 、SDS 和DETA 的激活作用不明显，甲醇、乙醇、丙酮、抗坏血酸、柠檬酸、L-半胱氨酸也有不同程度的抑制作用。
研究表明，大多数植物的过氧化物酶分子量在30~60 ku 范围内，不同品种、不同发育期、不同器官之间的同工酶种类有所差异。
同时，对过氧化物酶的发展前景进行了展望。
关键词：植物抗性；过氧化物酶；酶学特性；同工酶；果蔬中图分类号：TS 201.2+5 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2012)10-0062-05Characteristics of peroxidase from fruit and vegetable researchprogressDING Xin-yuan, CAO Jian-kang *(College of Food Science & Nutritional Engineering, Chinese Agricultural University,Beijing 100083)Abstract: This paper described the peroxidase’s role in plant resistance and research significance, and summarized the characteristic of peroxidase, such as purification, isozymes, structure and distribution of POD. The result showed that, the optimum pH of the peroxidase in many fruits and vegetables concentrated in 5.0~7.0, the optimum temperature concentrated in 30~60 ℃. For many fruits and vegetables, peroxidase activities were stimulated in different degrees by some metal ions like Fe 2+, Fe 3+, Ca 2+, Mg 2+, and almost weren’t stimulated by surfactant like PEG, SDS, DETA. Methanol, ethanol, acetone, ascorbic acid, citric acid, L-cysteine have different degrees of inhibition to the peroxidase. Molecular weights of most of the PODs vary from 30 ku to 60 ku, and isoenzyme types are different between the different varieties, different developmental stages and different organs. This paper gave an overview of peroxidase development prospects.Key words : plant resistance; peroxidase; enzymatic characteristics; isozymes; fruits and vegetables果蔬过氧化物酶酶学特性研究进展· 63 ·2012年 第37卷 第10期类氧化酶，可催化由过氧化氢参与的各种氧化反应，如催化酚类和胺类化合物的氧化反应。
实验9-10 植物过氧化物酶同工酶的测定(凝胶圆盘电泳)
（五）记录并计算： 记录并计算： 观察、记录酶谱， 观察、记录酶谱，并 计算各同工酶的相对 迁移率。 迁移率。
【要点提示】 要点提示】
1. 分离胶聚合时间应控制在 ～60min，聚合过 分离胶聚合时间应控制在30～ ， 快使凝胶太脆易断裂，主要是AP或 快使凝胶太脆易断裂，主要是 或TEMED过 过 量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是AP或 量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是 或 TEMED用量不足或已失效。 用量不足或已失效。 用量不足或已失效 2. 电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水，则表示电压 电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水， 或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、 或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、 凝胶底部断裂等，应注意调整。 凝胶底部断裂等，应注意调整。特别是进入分 离胶后应通过控制电压，调节电流不超过5mA/ 离胶后应通过控制电压，调节电流不超过 管。
（四）染色： 染色： 临用时配制染色液：（ ml ） 临用时配制染色液：（10 ：（ 联苯胺母液 H2O 3% H2O2 0.5 ml 9.3 ml 0.2 ml
将染液倒入盛有凝胶条的试管中（ 将染液倒入盛有凝胶条的试管中（没过 胶条）。约10min后用自来水冲洗。 胶条）。约 后用自来水冲洗。 ）。 后用自来水冲洗
【实验步骤】 实验步骤】
（一）过氧化物酶的提取：取8~12粒发芽 过氧化物酶的提取： 粒发芽 的麦粒，加入1ml H2O 或0.5mol/L Tris的麦粒，加入 HCl缓冲液（pH 6.8），冰浴上研成匀浆。 缓冲液（ ），冰浴上研成匀浆。 缓冲液 ），冰浴上研成匀浆 转入离心管，再用2ml上述溶液冲洗研钵 转入离心管，再用 上述溶液冲洗研钵 壁并全部转入离心管，4000r/min离心 壁并全部转入离心管， 离心10 离心 min，上清液供电泳分析用。 ，上清液供电泳分析用。
过氧化物酶同工酶电泳分析(经典有用)
过氧化物酶同工酶电泳分析实验原理（1）凝胶板由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。
上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。
本实验采用碱性系统。
电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液。
而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。
（3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
在这三种效应的共同作用下，待测物质被很好地分离开来。
下面以本实验要分离的小麦苗过氧化物酶同工酶为例，分别说明三种效应的作用：（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。
（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快；反之，分子量大、形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。
这种效应与凝胶过滤过程中的情况不同。
（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。
其原因如下：①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。
使得在该界面处的待分离酶蛋白区带变窄，浓度升高。
②在聚丙烯酰胺凝胶中，虽然浓缩胶和分离胶用的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶为pH 6.7，下层分离胶为pH 8.9。
HCl是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl－布满整个胶板。
待分离的酶蛋白样品加在样品槽中，浸在pH8.3和Tris-甘氨酸缓冲液中。
电泳一开始，有效泳动率最大的Cl－迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。
在pH6.7条件下解离度仅有0.1～1％的甘氨酸（pI = 6.0 ）有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。
这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。
在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。
生化实验四--果蔬中过氧化物酶分析
五,操作
1,贮液配制(已完成) ,贮液配制(已完成) 2,安装电泳槽(安装,封底) ,安装电泳槽(安装,封底)
3,制胶(分离胶,光聚合,浓缩胶) ,制胶(分离胶,光聚合,浓缩胶) 拔出梳子,倒入电极缓冲液,备用. 拔出梳子,倒入电极缓冲液,备用. 4,过氧化物酶的提取 , 按下列比例称取果蔬: 按下列比例称取果蔬: 冬 枣 , 柚 子 , 梨 : 1:2 ; 萝 卜 , 盘 菜 : 1:10 ( W:V) , 剪碎 , 放入研钵中 , 加适量石英砂及 ) 剪碎, 放入研钵中, 样品提取液于冰浴上研磨成匀浆, 置于离心管中, 样品提取液于冰浴上研磨成匀浆 , 置于离心管中 , 研钵用少量提取液清洗,洗液并入离心管,以 14000r/min的转速离心 / 的转速离心15min,取上清液贮存于低 的转速离心 , 温冰箱备用. 温冰箱备用.
三,实验步骤
1,取上述样品提取液 , 取上述样品提取液2.5mL,定容至 刻度, , 定容至50mL刻度, 备 刻度 用(仅指萝卜与盘菜,冬枣,柚子与梨不稀释). 仅指萝卜与盘菜,冬枣,柚子与梨不稀释) 2, 取光径 , 取光径1cm比色皿 只 , 于 1只中加入反应混合液 比色皿2只 比色皿 只中加入反应混合液 3mL和磷酸缓冲液 和磷酸缓冲液1mL, 作为对照 , 另 1只中加入反 和磷酸缓冲液 , 作为对照, 只中加入反 应混合液3mL和上述酶液 和上述酶液1mL(如酶活性过高可稀释 应混合液 和上述酶液 ( 立即开启秒表记录时间, 之),立即开启秒表记录时间,于分光光度计上测量 波长470nm下吸光度值 , 每隔 下吸光度值, 每隔1min读数一次 ( 连读 读数一次( 波长 下吸光度值 读数一次 5min,取平均值). ,取平均值)
四,试剂与材料
A(分离胶缓冲液) 1mol/L HCL (分离胶缓冲液) / /100mL Tris TEMED B(浓缩胶缓冲液) 1mol/L HCL (浓缩胶缓冲液) / /100mL C(分离胶贮液) (分离胶贮液) 贮液 /100mL D(浓缩胶贮液) (浓缩胶贮液) 贮液 /100mL Tris TEMED 丙烯酰胺 丙烯酰胺 48mL 36g 24L 48mL 5.9g 48L 30g pH 8.9 pH 6.7 pH 8.9
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
实验八 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１ 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
２ 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。
３ 掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。
４ 掌握过氧化物酶的活性的测定。
二 实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr ）和交联剂（即共聚体的N,N －甲叉双丙烯酰胺 Bis ）在加速剂（N,N,N ’,N ’－四甲基乙二胺 TEMED ）和催化剂（过硫酸胺 (NH 4)4S 2O 8 简称AP ）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１ 聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr 和Bis 在催化剂（AP ）或核黄素（C 17H 20O 6N 4）和加速剂（TEMDA ）的作用下聚合而成的三维网状结构。
催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：① AP-TEMED 属化学聚合作用② 核黄素－TEMED 属光聚合作用２ 凝胶孔径的可调性及其相关性质① 凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr 与Bis 之比： 00100a bT m +=⨯ a:b<10 脆硬乳白交联度： 00100bc a b =⨯+ a:b>100糊状易断② 凝胶浓度与孔径的关系T （Acr 和Bis 总浓度）增加 孔径减小 移动颗粒穿过网孔阻力增加③ 凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加 阻力增加 移动速度减慢。
同时还与分子形状及分子电荷有关系。
在操作时，可以选用007.5凝胶。
因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。
３ 试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE ）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH 值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。
实验二 过氧化物酶同工酶的提取、分离
实验二过氧化物酶同工酶的提取、分离苟亚峰摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定玉米幼苗过氧化物酶同工酶，实验结果显示玉米幼苗中至少含有5种过氧化物同工酶。
关键词：过氧化物同工酶；PAGE；电泳分离引言同工酶是指催化同一种化学反应，但酶的分子结构组成却有所不同的一组酶。
同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如过氧化物酶在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。
电泳(electrophoresis，简称EP ) 指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
1937年瑞典科学家Tiselius 成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖。
50年代，先后出现了以滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物的电泳技术。
60年代，出现了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。
这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acr）和交联剂N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成的，Acr和Bis在具有自由基团体系时，就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：（1）化学法：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’-四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生自由硫酸基，其氧原子激活丙烯酰胺单体形成单体长链。
化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；（2）光聚合法：光聚合法的催化剂是核黄素（VB2），光聚合形成的凝胶孔径较大，且不稳定，适于制备大孔径的浓缩胶。
生化期考复习提要
期考复习提要名词解释：蛋白质四级结构Protein tertiary structure：蛋白质的变性作用protein denaturation分子病molecular disease核酸杂交The molecule hybridizationDNA双螺旋结构DNA double helex同工酶Isoenzymes糖酵解Glycolysis：糖异生glyconeogenesis酮体Ketone bodies：氧化磷酸化oxidative phosphorylation生酮氨基酸ketogenesis amino acid转氨基作用transamination盐析作用salfate precipitation必需氨基酸Essential amino acids：遗传密码genetic code转录Transcription：简答题：1.为什么DNA不易被水解？而RNA容易被碱水解？2.何为解链温度?影响某种核酸分子Tm值大小的因素是什么?为什么?3.何为必需脂肪酸？哺乳动物体内所需的必需脂肪酸都有哪些？4.激烈运动后人们感到肌肉酸痛，几天后酸痛感会消失，利用生化机制解释该现象5.给哺乳动物喂食15N 标记的丙氨酸，能否在动物体内找到15N标记的苏氨酸、赖氨酸、和天冬氨酸？6.假如给因氨中毒导致肝昏迷的病人注射鸟氨酸、谷氨酸和维生素，请解释注射它们的用意何在？7.以磺胺药为例，说明竞争性抑制的特点是什么?8.设纯化制备了一种酶，如何鉴定它是蛋白质?9.从以下几方面比较糖酵解与有氧氧化：(1)代谢部位(2)反应条件(3)ATP生成方式(4)产生ATP的数量(5)终产物(6)主要生理意义10.糖代谢与脂代谢是通过哪些反应联系起来的?11.乙酰CoA是由哪些物质代谢产生的?它有哪些代谢去路?12.若有一球状蛋白质，分子中有一段肽链为：…Ala-Gln-Pro-Trp-Phe-Glu-Tyr-Met…在生理条件下，哪些氨基酸可能定位在分子内部？13.导致蛋白质变性的主要因素有哪些？如何在蛋白质分离纯化中减少其变性机会？14.什么是三羧酸循环？它有些什么生物学意义15. 在DNA复制中为什么使用的是需要被切除的RNA引物？16.类固醇激素的代谢调节机制是如何进行的？在调节过程中，第一信使和第二信使为何种物质？。
植物过氧化物酶的提取、
试剂
考马斯亮蓝试剂； 标准和待测蛋白质溶液
器材
试管及试管架， 移液管（0.1ml及5ml），UV－ 2000型分光光度计。
操作方法：取6支试管，按下表制定标准曲线。
试管编号 0.1mg/ml 标准蛋白溶液/ml 0.15mol/L NaCl/ml 每管中蛋白质浓度μ g/ml 考马斯亮蓝 G250 溶液 A595nm 0 0 1.0 0 1 0.2 0.8 20 2 0.4 0.6 40 5ml 3 0.6 0.4 60 4 0.8 0.2 80 5 1.0 0 100
四、植物过氧化物同工酶电泳技术
实验原理 同工酶（isozymes）是指作用于底物相似或完全相同的 酶的不同分子形式，即催化同一种反应而结构不同的一 族酶。它们是受遗传体系决定的酶的不同分子形式。利 用凝胶电泳技术（PAGE）可以将它们分开，用专一的 作用底物和特殊染料，把需要分析的酶染色，在胶柱上 呈现同工酶谱。 实验目的 通过实验掌握植物同工酶实验技术，了解植物同工酶分 析在遗传学研究中的意义。 着重掌握过氧化物酶的提取，电泳与染色技术和分析方 法。
2010年9月
一、植物过氧化物酶的提取
目的要求 学习制备植物过氧化物酶粗酶液的原理和方法 为后续实验提供酶液。 器材与仪器 电子天平； 冰冻高速离心机； 可见光分光光度计； 电动玻璃匀浆机等。 试剂 20mM KH2PO4， 100mM PBS：取0.2M 的Na2HPO4 12.3ml与0.2M的 NaH2PO4 87.7ml混合。加入100ml水稀释即成。
三、植物过氧化物酶活性的测定（比色法）
原理
生化实验报告
生化实验报告实验一过氧化物酶同工酶的分离提取一、实验目的1、初步掌握蛋白质分离纯化的一般步骤，熟悉离心的使用及蛋白质提取中的注意事项。
2、了解过氧化物酶的作用。
二、原理：过氧化物酶是植物提内普遍存在、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测定这种酶的活性，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
本实验以苜蓿种子为材料，低速离心去除细胞碎片，上清用丙酮或硫酸铵沉淀得过氧化物酶同工酶粗品。
三、实验材料、器材及试剂：（一）材料：苜蓿种子（二）器材：研钵、超声波粉碎仪、高速冷冻离心机酸度计（三）实验试剂：1．丙酮2．提取缓冲液PBS。
四、实验步骤1．精确称取4g左右植物样品（若是苜蓿种子，提前用水溶胀好，）加15ml提取缓冲液匀浆；[先将种子称好研碎，再逐渐加入提取缓冲液，匀浆用去10ml，最后洗涤用5ml]2．13000g离心10min；3．取清液（量体积），沉淀弃去（清液少许低温保存测定酶活和含量样1）；蛋白质浓度范围内（1～1000μg），蛋白质与色素结合后在595nm吸光值的大小与蛋白质的浓度呈正比，故可用于蛋白质的定量测定。
考马斯亮蓝G-250与蛋白质的结合十分迅速，2min左右即可达到平衡，其结合物在室温下1小时内保持稳定。
此法灵敏度高，易于操作，干扰物较少，是一种比较好的定量方法。
其缺点是在蛋白质浓度太高时线形偏低，且不同来源蛋白质与色素的结合状况有一定差别。
三、实验材料、试剂和仪器设备（一）材料苜蓿种子（二）仪器设备722分光光度计烧杯量筒移液管具塞刻度试管（三）试剂1．标准牛血清白蛋白溶液（100μg/ ml）。
2．考马斯亮蓝G-250：四、实验步骤（一）标准曲线的绘制取6支具塞刻度试管，按下表依次加入标准蛋白，向各管中加入考马斯亮蓝G-250溶液5ml，摇匀，放置5min 左右，用1cm 的比色皿在595nm 处测定吸光值，以蛋白的μg 作纵坐标，吸光值为横坐标绘制标准曲线。
实验五 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
实验五聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、目的同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
研究表明，植物在发育过程中，所含同工酶的种类和比例都不相同，它们与植物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等都有一定关系，因此作为基因表达的产物，测定同工酶谱是认识基因存在和表达的一种工具，在植物的种群、发育及杂交遗传的研究中有重要的意义。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化，测定这种酶的活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便，灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验要掌握电泳技术的原理、方法、装置、凝胶配制等知识，熟悉主要的操作过程，同时对同工酶有一个感性的认识。
二、原理1．电泳带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
近几十年来，电泳作为一项有效的分析、分离和制备技术发展很快，在生产、科研和医疗工作中得到了广泛应用。
用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分辨率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。
2．影响电泳的主要因素若将带净电荷q的粒子放入电场，则该粒子所受到的引力F引可用数学式表示如下：F引＝E·q（1）式中E为电场强度，单位为“v/cm”，表示电场中单位距离上的电位差。
如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。
但在溶液中，由于电场的牵引力F引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力（即摩擦力）F阻相对抗。
故上述现象不会发生。
根据Stokes公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以及所在介质的粘度：F阻＝6πrηv (2)式中F阻是球形粒子所受的阻力，r是球形粒子的半径，η是溶液的粘度，v是粒子移动的速度。
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析小麦幼苗过氧化物酶同工酶（实验报告）
实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析⼩麦幼苗过氧化物酶同⼯酶（实验报告）⽣物化学实验报告实验五聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析⼩麦幼苗过氧化物酶同⼯酶⼀、研究背景及⽬的电泳现象就是带电粒⼦在电场中向与其⾃⾝带相反电荷的电极泳动。
电泳技术最初是由瑞典的著名科学家Tisellius所奠基，⾃此⽣物⼤分⼦的分离纯化便进⼊了电泳技术的新纪元。
电泳技术的发明是⼈们在分离纯化技术中的“差异转换”思路上⼜⼀次伟⼤的飞跃。
⼈们清楚地意识到，要想使⽬标物得到分离，⽬标物与杂质之间的性质差异必须⾜够⼤，这⼜与某些性质差异⼩的物质的分离相⽭盾，⽽⼈为放⼤这些差异⼩的性质必然会破坏⽬标物的原有结构，因此需要借助第三者进⾏差异转化，即以其⾃⾝的性质为基础，转化为其他⽅⾯差异⼤的性质。
电泳技术就是利⽤⼀些⽣物⼤分⼦的电性特点，在⼀定的条件下使被分离物之间很⼩的差异转化为⾃⾝所带电荷性质与数量的差异，在外加电场的作⽤下便会体现出迁移⽅向及速度上的差异，通过时间上的积累进⽽体现为迁移距离的差异。
最初的电泳技术是在溶液中进⾏的⾃由电泳，后来⼈们想到，由于待分离物的⼤⼩、形状也存在差异，那么它们在电场中泳动的过程中必然会受到不同的阻⼒，这种阻⼒的差异⼜转化为了电场中迁移速度的差异，所以⼈们便发明了各种⽤于电泳的载体（⽀持介质），使分⼦的⼤⼩及形状差异得以转化和体现，⼤⼤提⾼了分辨率。
⾄此，电泳技术的基本理论就建⽴了。
此后，在实际操作中，⼈们不断进⾏探索、改进与完善，发明了诸多的电泳新技术，使电泳成为⼀项⽣物⼤分⼦分离纯化中令⼈瞩⽬的研究技术。
本实验基于电泳的基本原理对⼩麦过氧化物酶同⼯酶进⾏分离，旨在学习并掌握电泳技术的发明历程以及操作过程中的相关细节，同时更为深刻地理解⼀项新技术在实际应⽤中不断修正与完善的过程，体会电泳和层析两⼤技术各⾃的特点和优势。
⼆、原理[1]1.过氧化物酶同⼯酶同⼯酶是催化同⼀种化学反应，但其酶蛋⽩本⾝的分⼦结构组成却有所不同的⼀组酶。
植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳实验指导
植物过氧化物同工酶的聚丙烯酰胺凝胶电泳【目的】1．掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作过程。
2．了解聚丙烯酰胺圆盘电泳的实际应用，利用此法分离植物过氧化物同工酶。
【概述】1．聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支承物的一种电泳技术。
其凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构。
凝胶网孔的大小可通过改变单体浓度和交联剂浓度的比例加以调节，常用的所谓标准凝胶是指含丙烯酰胺7%～7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能达到满意的结果。
聚丙烯酰凝胶电泳过程中除了一种电泳所具有的电荷效应外，还具有“分子筛”效应；不连续的凝胶电泳过程中具有电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
不连续凝胶电泳体系的不连续性体现在：（1）凝胶由上、下两层组成，两层胶孔孔径不同。
上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。
（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH 值不同。
如常用的碱性系统中，电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl 缓冲液，分离胶为pH8.9的Tris-HCl 缓冲液。
（3）在电场中形成不连续的电位梯度。
在这种不连续的系统中有三种物理效应起作用，使样品分离效果好、分辨率高。
这三种效应是电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。
① 电荷效应 由于各种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而在一定电场作用下迁移率不同。
承载有并效电荷多的，泳动的快，反之则慢。
CH 2CH C=O NH 3CH 2=CH C=O NH CH 2NH C=O CH 2+CH 2CH C=O NH 3CH 2CH C=O NH 3C=O NH CH 2NH C=O CH 2CH 2CH [[]]nn 催化剂② 分子筛效应 因为聚丙烯酰胺具有网孔结构，所以直径大，形状不规则的分子，电泳时通过凝胶受到的阻力大，移动较慢；分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到的阻力小移动较快。
植物过氧化物酶提取及电泳
菜心的花和叶的过氧化物酶的提取、活性测定及同工酶的凝胶电泳分析广州大学生命科学学院洪韬文生物工程1121114200044摘要：本实验分两部分，1：过氧化物酶的提取，:用考马斯亮蓝试剂进行酶液蛋白质浓度的测定，根据标准曲线的方程式，计算出样品的蛋白质含量；2：:通过过氧化物酶活性的测定（愈创木酚氧化比色法），测出的OD值计算出酶活性数值，接着对同工酶的凝胶电泳分析，使它在胶柱上呈现同工酶谱，得出最终实验结果，通过数据记录和拍照记录最终结果。
关键字：过氧化物酶蛋白质OD值同工酶凝胶电泳前言：本实验是在完成基础生物化学实验以后，学生综合运用已经学过的生物化学实验理论和已经掌握的生物化学实验技术进行的一项综合性设计性实验，也是对学生实验动手能力的一次较全面的检验。
POD是一种由单一肽链与卟啉构成的血红素蛋白，脱辅基蛋白分子需与血红素结合才构成全酶。
参与植物POD血红素的合成部位可能象动物一样是在线粒体上。
POD 是一种氧化还原酶，它是由微生物或植物所产生的一类氧化还原酶，POD广泛存在于植物体内，是一种活性较高的一种酶，它与植物的呼吸，光合作用以及生长起着很大的作用。
材料和方法：材料：菜叶，菜花方法：1.植物POD的提取分别称取菜心的花和叶各1~2克，然后剪碎，分别放入研钵，向研钵中加入少许石英砂和3ml KH2PO4，快速研磨，后分别加入离心管中进行离心，离心条件为8500rpm，时间为15分钟。
离心完毕后取上清液，并定容至10ml（刻度试管），***此液即为POD提取液，取5ml冷冻保存，作为电泳的POD样品。
2.蛋白浓度的测定—考马斯亮蓝法标准曲线的制定制作标准曲线回归方程：Y(含量)=aX(OD595值) + b，得出相关系数R2。
3.样品蛋白浓度的测定根据标准曲线的方程式，计算出样品的蛋白质含量。
4.过氧化物酶活性的测定（愈创木酚氧化比色法）备好酶液，将分光光度计调到470nm，取光径1厘米的比色杯2只，向对照杯加反应混合液2.0 ml，KH2PO4 0.5ml，校零点。
香椿过氧化物酶同工酶分析
３ ５ Ｃ％ ＝２ ． ％； 离胶 ： 。 ％， ００ 分 Ｔ％ ＝１ ． ％， ％ ＝ ００ Ｃ ４。 ％。电泳起始 电流 为 ５ Ｏ ｍＡ， 指 示 剂 进 入 分 离 待 胶后 ， 压至 ２ Ｏ 稳 流为 ４ ｒＡ， 稳 ５ ｖ， Ｏｎ 电泳 时 间为 ５ｈ ， 电泳 环境 为 ４ 。酯酶 同工 酶用 乙酸 一ａ ℃ 一萘脂 、 乙 酸 ～８ 一萘脂 和 固蓝 Ｒ Ｒ盐染 色 ； 氧化 物酶 同工 酶 过
带 区为香椿 种质 资 源特 征 区 ， ａ ｂ ｃ ｄ带 为香 椿 且 、 、、 种 质资 源的过 氧化物酶 同工酶 特征带 。
子 公 司 Ｂ， 为广西 Ｂ， 为郧西 Ｂ １ ８号 ９号 ，Ｏ号为华 中
农 业大学 ， １ 为 山东 Ｂ，２号 为 郧县 Ｂ ｌ号 １ 。各 采 样
单株均为 移植苗 木 ， 龄为 ３ ， 苗 年 生长 良好 。 １２ 方 法 。 １２ １ 取 样反 制样 。． ２０ ００年 ５月 份取 一年 生香 椿 树冠上部 当年 生枝条 上 生 长 旺盛 的幼 嫩 叶 片 ， 羽 用
得Ｌ 。 目前 ， 同工 酶 酶 谱是 鉴 定 品种 资 源 的 重要
采用联 苯胺方 法 染色 电泳 结 束后 ， 定 酶 带迁 移 测 距离 和指示 剂距 离 ， 计算 Ｒ 值 ｆ
２ 结 果分 析
２ 香椿 过氧化物 酶 同工酶酶 谱分析 １
标志之 一¨ ， 香椿 酶 谱 进行 分 析 ， 以 为 香 椿 品 Ｊ对 可 种分 类提供 依据 。
维普资讯
湖 北农业 科学
ＨＵＢ Ａ ＲＩ ＵＬ ＵＲ ｌ Ｓ Ｉ ＮＣ Ｓ ＥＩ Ｇ Ｃ Ｔ Ａ Ｃ Ｅ Ｅ Ｎｏ １ ２ ０ ．０ ２
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香 椿 过 氧 化 物 酶 同 工 酶 分 析
过氧化物酶同工酶的提取、分离
反之越快； ⑤电场强度：
电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快； ⑥离子强度：
离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快； ⑦电渗现象：
电场中，液体相对于固体支持物的相对移动； ⑧支持物筛孔大小：
孔径小，电泳速度慢，反之则快。
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4、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作 为载体的一种区带电泳。
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(1)聚丙烯胺凝胶的生成：
聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲 叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。在具 有自由基时，Acr和Bis就会聚合。
引发产生自由基的方法有两种：
①化学法 ②光聚合法
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①化学聚合：
引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’－ 四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生氧自由 基，激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝 胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；
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4.2 点样：
轻拔电泳梳子→用微量进样器点样→每孔约30μl。
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5、电泳：
接通电源→稳流→调节电流到每孔 1mA左右→当溴酚蓝前沿进入分离胶后，可 适当加大电流→待前沿下行到距胶末1cm处，
停止电泳。
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6、剥胶、固定、染色：
将凝胶板取下→放入装水瓷盘中→剥 下胶片→并浸洗二次→倒去水→加入固定 液10分钟→倒去固定液→加显色液（联苯 胺），显色→观察记录。
a与b的比例很重要。富有弹性，且完全透明的凝胶，a 与b的重量比应在30左右。常用29 ： 1
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(4)不连续PAGE的原理：
第一、三个不连续性： ①凝胶孔径的不连续； ②缓冲液离子组成及各层凝胶pH的不连续； ③在电场中形成的电位梯度的不连续。