维生素D测定方法
维生素D测定法
附录VII K 维生素D测定法本法系用高效液相色谱法(附录V D)测定维生素D(包括维生素D2和D3，下同)及其制剂、维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D经折算成维生素D的总量，以单位表示，每单位相当于维生素D 0.025μg。
测定应在半暗室中及避免氧化的情况下进行。
无维生素A醇及其他杂质干扰的供试品可用第一法测定，否则应按第二法处理后测定；如果按第二法处理后，前维生素D峰仍受杂质干扰，仅有维生素D 峰可以分离时，则可按第三法测定。
第一法对照品贮备溶液的制备根据各制剂中所含维生素D的成分,精密称取相应的维生素D2或D3对照品25mg,置100ml棕色量瓶中，加异辛烷80ml，避免加热，用超声处理助溶1分钟使完全溶解，加异辛烷至刻度，摇匀，作为贮备溶液（1）；精密量取5.0ml至50mL棕色量瓶中，加异辛烷稀释至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0℃以下保存，作为贮备溶液（2）。
测定维生素D2时，应另取维生素D3对照品25mg，同法制成维生素D3对照品贮备溶液，供系统适用性试验用。
色谱条件与系统适用性试验用硅胶为填充剂，正己烷-正戊醇(997:3)为流动相，检测波长为254nm。
量取维生素D3对照品贮备溶液（1）5ml，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加热1小时，取出迅速冷却，加正己烷5ml，摇匀，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波长分别为254nm和365nm 的紫外光灯下，将石英吸收池斜放成45°,并距灯管5～6cm,照射5分钟,使溶液中含有前维生素D3、反式维生素D3、维生素D3和速甾醇D3；取此溶液注入液相色谱仪，测定维生素D3的峰值，先后进样5次,相对标准偏差应不大于2.0％；前维生素D3(与维生素D3的比保留时间约为0.5)与反式维生素D3(与维生素D3的比保留时间约为 0.6)以及维生素D3与速甾醇D3(与维生素D3的比保留时间约为1.1)的峰分离度均应大于1.0。
维生素d的检测方法
维生素d的检测方法维生素D是一种重要的脂溶性维生素，对人体生长发育、钙磷代谢和免疫功能具有重要作用。
维生素D的检测方法一直是人们关注的热点问题。
目前常用的维生素D检测方法主要包括化学方法、免疫学方法以及分子生物学方法等。
化学方法是最传统的维生素D检测方法之一。
它基于维生素D的化学性质进行测定，常见的化学方法有高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱法（GC）。
这些方法需要对样品进行提取和纯化处理，然后通过色谱技术进行分离和定量分析。
化学方法具有准确度高、可靠性好的优点，但它们需要较为复杂的仪器设备和繁琐的样品处理步骤，且需要专业的技术人员进行操作。
免疫学方法是近年来发展起来的一种维生素D检测方法。
这种方法基于抗体与抗原结合的特异性反应来检测维生素D水平，常用的方法有放射免疫分析法（RIA）、酶联免疫吸附法（ELISA）和化学发光法。
免疫学方法操作简便，结果快速，准确性和灵敏度较高，适用于大规模样品检测。
但免疫学方法也存在一定的局限性，例如可能受到交叉反应干扰，需要使用抗体等试剂，成本较高。
分子生物学方法在维生素D检测中发挥着越来越重要的作用。
PCR和实时荧光定量PCR是最常用的分子生物学方法。
这些方法通过检测与维生素D受体基因的关联突变位点，或者检测维生素D代谢相关基因的表达水平来间接评估体内维生素D的水平。
分子生物学方法具有快速、灵敏度高、样品体积要求低等优点，但需要复杂的实验操作和专业的技术支持。
除了以上主要的方法外，还有一些其他的维生素D检测方法，如质谱法、电化学法等。
这些方法在特定的实验条件下可以进行维生素D的测定，但一般更多用于科学研究领域。
需要注意的是，不论使用哪种检测方法，都需要注意样本的选择和处理。
维生素D血清水平的变化受到多种因素的影响，如日照时间、饮食摄入、年龄、季节、肥胖程度等。
因此，在进行维生素D的检测时，需要选择适当的样本类型（如血液、尿液或唾液）和采样时间，并尽量控制可能的干扰因素。
维生素D测定方法
维生素D测定方法维生素D的测定方法，目前只有“婴幼儿配方食品和乳粉通用检验方法”介绍的GB/T 5413.9-1997所列的先正相收集，后反相分离的H PLC测定方法。
该法可同时测定 A.D.E，但操作比较烦琐，对于维生素的营养素补充剂，样品中杂质干扰小，在测定A.E的同时可控制采样量和色谱的分离条件，并参照GB/T 5413.9-1997与G B/T 5009.82-2003（食品中维生素A和维生素E的测定）的方法检测营养补充剂维生素D也可同时测定A.E。
一、原理样品中维生素D经热皂化处理后。
用HPLC紫外检测，内标法定量。
二、仪器1、HPLC：water公司，510泵，486紫外检测器，三锐色谱工作站。
2、超声波振荡器3、水浴箱4、0.45μ滤膜三、试剂1、维生素D3标准对照品：精确称取维生素D3标准对照品（sigma公司）5.0mg 左右加已脱醛处理的无水乙醇至50ml刻度，配成100μg/ml的标准D3贮备液。
2、维生素D贮存一般较稳定，贮备液也可在264μn下按常规的标定方法用比吸光系数计算出维生素D3的标准浓度。
维生素D3比吸光系数E1%cm=493。
3、其他试剂：无水乙醚，无水乙醇，无水硫酸钠，甲醇，抗坏血酸，氢氧化钾，内标苯并e芘……等同GB/T 5009.82-2003或G B/T 5413.9-1997四、方法1、准确称取经研碎成粉状的均匀样品2.0g于皂化瓶中，加内标苯并e芘溶液2.0ml，加10%抗坏血酸5m l，样品先混成均匀的糊状，再加无水乙醇30ml同1：1氢氧化钾溶液10ml在沸水上皂化10分钟，使皂化完全，皂化后立即放入冰中冷却。
2、提取、洗涤、浓缩等步骤同GB/T 5009.82-2003，最后用无水乙醇定容至2ml。
人群维生素D缺乏筛查方法2020版
1 范围本标准规定了人群维生素D 缺乏和不足筛查的指标、参考判定值和检测方法。
本标准适用于人群维生素D 营养状况的判定。
2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 603 化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 WS/T 225 临床化学检验血液标本的收集与处理 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。
3.125-羟基维生素D 25-hydroxyvitamin D ；25(OH)D血液中维生素D 的主要循环形式，稳定性好，是公认的评价人体维生素D 营养状况的可靠指标，主要包括两种形式：25(OH)D 2、25(OH)D 3，其中25(OH)D 3是血液中维生素D 的主要存在形式。
3.2维生素D 缺乏 vitamin D deficiency当人体血清（或血浆）25-羟基维生素D 含量低于缺乏的参考判定值时，可判定为维生素D 缺乏。
3.3维生素D 不足 vitamin D insufficiency当人体血清（或血浆）25-羟基维生素D 含量低于正常人群的参考判定值，但高于缺乏参考判定值时，可判定为维生素D 不足。
4 人群维生素D 营养状况判定指标及参考判定值人群维生素D 营养状况判定指标及参考判定值见表1。
人群维生素缺乏筛查方法D表1 人群维生素D营养状况判定指标及参考判定值5 测定方法5.1 血液标本的采集与保存按附录A规定的方法进行。
5.2 第一法：液相色谱串联质谱法按附录B规定的方法进行。
5.3 第二法：化学发光免疫法按附录C规定的方法进行。
5.4 第三法：酶联免疫法按附录D规定的方法进行。
附录 A（规范性附录）血液标本的采集与保存A.1 标本采集A.1.1血液标本的采集：空腹静脉血，取血方法依据 WS/T 225 以及检测方法的要求采集空腹静脉血1 mL。
测维生素D的方法
测维生素D的方法维生素D是一种脂溶性维生素，对人体健康至关重要。
它在人体内能够促进钙的吸收与利用，维持骨骼的健康，并参与多种生理反应，包括免疫系统、神经系统和肌肉功能等。
因此，准确测定维生素D水平对于评估个体的健康状态非常重要。
下面将介绍几种常用的测量维生素D水平的方法。
1. 免疫层析法（Immunoassay）免疫层析法是目前最常用的测定维生素D水平的方法之一。
该方法基于抗体与维生素D结合的特异性，并通过抗原抗体反应来检测维生素D的含量。
免疫层析法具有快速、高灵敏度和高特异性等特点，但其结果可能受到其它物质的干扰，需要注意结果的正确解读。
2. 液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）液相色谱-串联质谱法是目前最准确和可靠的测定维生素D水平的方法。
该方法通过对样品经过色谱柱分离和串联质谱仪检测来确定维生素D2（麦角固醇）和维生素D3（胆骨化醇）的含量。
由于其高灵敏度和高分辨率，该方法能够准确地测定维生素D的浓度而且不受干扰。
3. 放射免疫分析法（RIA）放射免疫分析法是一种通过放射性同位素标记的抗体来测定维生素D水平的方法。
该方法通过测定放射性同位素与维生素D结合的程度来测定其浓度。
该方法具有高灵敏度和高特异性，但由于使用了放射性同位素，需要严格控制实验操作，确保安全性，并注意实验室安全操作。
除了上述常用的方法外，还有一些辅助的方法用于评估维生素D水平，如骨骼X 线检查、尿液中钙和磷含量的测定等。
但这些方法不是直接测定维生素D水平的，而是通过评估与维生素D代谢相关的指标来间接推断维生素D的水平。
需要指出的是，无论使用哪种方法测定维生素D水平，都需要注意标本的采集和处理，以及实验过程的严密控制，以确保结果的准确性和可靠性。
此外，由于维生素D的生理功能广泛，其水平的评估应结合临床症状和其它检查结果，综合判断个体的维生素D营养状况。
总结起来，测定维生素D水平的方法有免疫层析法、液相色谱-串联质谱法、放射免疫分析法等。
维生素D检测方法
在补充维生素D的过程中，应定 期进行检测，根据检测结果调 整补充剂量，避免过量或不足 。
05
维生素D检测技术的发 展趋势
高灵敏度检测技术的研究与应用
总结词
随着人们对维生素D的深入研究，对检测技术的要求也越来越高，高灵敏度检测技术成为研究热点。
详细描述
高灵敏度检测技术能够更准确地检测低浓度的维生素D，降低检测误差，提高检测的准确性和可靠性。这 种技术主要通过改进检测试剂、优化实验条件等方式实现。
个性化检测方案的研究与推广
总结词
针对不同人群和个体差异，研究者们正在研 究制定更为个性化的检测方案。
详细描述
个性化检测方案可以根据每个人的年龄、性 别、健康状况等因素，制定出最适合的检测 方法和标准。这种方案有助于更准确地评估 个体的维生素D水平，为预防和治疗维生素 D缺乏相关疾病提供更有针对性的方案。
总结词
血清25-羟基维生素D是维生素D的主要循环形式，也是评估维生素D营养状况的常用指标。
详细描述
通过抽取静脉血液样本，采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行检测，该方法具有较高的灵敏度和特异 性，能够准确反映体内维生素D的水平。
血清1,25-二羟基维生素D检测
总结词
血清1,25-二羟基维生素D是维生素D 的活性形式，对于评估维生素D的生 理功能和营养状况具有重要意义。
佝偻病的诊断与治疗
佝偻病是一种儿童常见的骨骼疾病，表现为 骨骼软化和弯曲。维生素D缺乏是佝偻病的 主要原因之一。通过检测维生素D水平，可 以早期诊断佝偻病，并采取相应的治疗措施 ，如补充维生素D和钙剂，以预防和治疗佝 偻病。
定期检测维生素D水平有助于监测佝 偻病的治疗效果，确保儿童健康成长。
维生素制剂中的维生素D化学分析方法
维生素制剂中的维生素D化学分析方法维生素D是一种重要的脂溶性维生素，它包括两种形式，即维生素D2和维生素D3、它们在人体中的主要功能是促进钙和磷的吸收和利用，有助于维持骨骼健康。
维生素D通常通过阳光照射皮肤或食物摄入来获得，但在一些情况下，人们可能需要通过维生素D补充剂来满足身体的需求。
因此，对维生素D制剂进行化学分析是至关重要的。
维生素D的化学分析主要包括两个方面：定性分析和定量分析。
定性分析用于鉴定样品中是否存在维生素D，而定量分析则用于确定维生素D的含量。
以下将介绍几种常用的维生素D化学分析方法。
1.高效液相色谱法(HPLC)HPLC是一种广泛应用于维生素D分析的方法。
该方法根据维生素D2和维生素D3的不同保留时间，通过比较待测样品与已知维生素D标准品的保留时间来定量测定维生素D的含量。
2.液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)LC-MS/MS是一种灵敏度极高的维生素D分析方法。
它结合了高效液相色谱和质谱技术，可以同时测定维生素D2和维生素D3的含量，并且不受样品基质的干扰。
3.放射免疫分析法(RIA)RIA是一种利用放射性同位素标记的抗体来测定维生素D的含量的方法。
该方法具有高度的选择性和灵敏度，可以测定较低浓度的维生素D，但需要使用放射性同位素，因此操作相对复杂。
4.高效液相色谱-紫外检测法(HPLC-UV)HPLC-UV是一种利用紫外光谱检测器来测定维生素D含量的方法。
该方法根据维生素D与紫外光的吸收特性，通过比较待测样品的吸光度与已知维生素D标准品的吸光度来定量测定维生素D的含量。
5.毛细管电泳法(CE)毛细管电泳是一种利用毛细管内部作为分离通道进行分析的方法。
该方法可以用于维生素D的定性和定量分析，具有分离效率高、操作简便等优点。
在进行维生素D制剂的化学分析时，需注意以下几点：1.样品处理：针对不同的分析方法，样品处理方式会有所不同。
例如，HPLC方法可能需要进行前处理步骤，如提取或萃取，而LC-MS/MS方法则可能需要对样品进行液-液萃取或固相萃取。
维生素D检测 方法
有效预防骨折
• Meta 分析 • 防骨折12RCTs 患者42,279例 ；
防髋部骨折8RCTs 患者40,886例
有效降低骨折风险 需达到的维生素D浓度： 29.6ng/ml(74nmol/L) 有效降低髋部骨折风险 需达到的维生素D浓度： 31ng/ml(78nmol/L)
Bischoff-Ferrari HA et al (2009) Prevention of nonvertebral fractures with oral vitamin D and dose dependency: a recta- analysis of randomized controlled trials. Arch Intern Med 169 (6):551-561
抗骨松药效发挥最佳疗效
美国一项调查： 2家医院共210名患者
比值比
置信区间
P值
结果： 维生素D>33ng/ml能够使得 双磷酸盐治疗效果最大化。 （治疗无效人数最少）
治疗无应答标准 •经过2年双磷酸盐治疗后，腰椎, 股骨颈,
髋关节,大转子T值仍<−3.0 •相比基线值，第二次BMD下降大于 >3.0% （超过18个月，腰椎, 股骨颈, 髋关节,大转子DEXA） • 超过12个月双磷酸盐治疗后仍发生骨折
H
V itam in D 3 (25-O H ) C H2
维生素D2
HO
• 天然形式见于蔬菜来源食物 （蘑菇）
• 用于强化与补充
1. Standing Committee on the Scientific Evaluation of Dietary Reference Intakes, IOM, DRI for Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride, 1st edition, National Academies Press: Washington DC, 1999
维生素D检测方法的研究进展
维生素D检测方法的研究进展应用高效液相色谱法、液质联用法、放射免疫法、酶联免疫法、化学发光免疫法、电化学发光免疫法、全自动生化法等检测血清25-（OH）D浓度，可根据测定结果对人体维生素D的营养状况做出评价，因此，在方法选择时，应根据测定灵敏度、特异性、测定费用、测定时间及实验人员能力和实验室条件等实际情况进行综合考虑。
为此，笔者对有关研究进展进行综述。
标签：维生素D；钙代谢；25.羟基维生素D；全自动生化維生素D是人体必需的营养素，其营养状况影响着人体钙和磷的正常代谢，与人体健康密切相关，因此，准确测量维生素D水平对于多种钙代谢相关疾病的预防和治疗有重要意义。
维生素D在血液中主要以25-羟基维生素D[25-（OH）D]的形式运输，是评价体内维生素D营养状况最为有效的指标。
高效液相色谱法、液质联用法、放射免疫法、酶联免疫法、化学发光免疫法、电化学发光免疫法、全自动生化法等方法均可检测血清25-（OH）D浓度，并根据测定结果对人体维生素D的营养状况做出评价。
笔者就常用的血清25-（OH）D浓度的检测方法和各自特点作一综述。
1维生素D概述维生素D是人体必需的营养素，在自然状态下，日光照射或植物性食物是维生素D的重要来源。
维生素D是类固醇衍生物，其家族最重要的成员是维生素D2和维生素D3。
维生素D2多含于植物性食物中，它是由植物的麦角固醇经阳光照射而合成的，维生素D3可由人体皮肤和脂肪组织在7-脱氢胆固醇经过阳光照射合成，这两种形式的维生素D均无生物活性，必须在体内经过两次羟化后方能发挥生物效应。
维生素D属脂溶性维生素，来自食物中的维生素D2与脂肪一起经小肠吸收，在胆汁协助下形成乳糜微粒，由淋巴管进入血液，与阳光照射合成的维生素D，一起转运入肝脏。
维生素D在肝脏中经干细胞微粒体中的25-羟化酶作用下，转化为25-羟基维生素D_[25-（OH）D]，再经过肾脏中线粒体1α羟化酶系统的作用下转变为有生物活性的1，25-羟基维生素D[1，25-（OH）2D]。
高效液相色谱法测定保健品中维生素D 含量
高效液相色谱法测定保健品中维生素 D 含量
□ 罗 骁 吴帅龙 李彩玲 广电计量检测（合肥）有限公司
摘 要：建立了一种使用液相色谱 - 紫外检测器，以维生素 D2、D3 互为内标，测定保健食品中维生素 D 的方法。样 品经淀粉酶水解，无水乙醇 - 氢氧化钾皂化，皂化液用石油醚萃取、水洗、干燥，旋转蒸发至约 2 mL，氮吹至干，甲醇溶 解定容，内标法定量。维生素 D2 和维生素 D3 的分离度为 1.5，线性范围为 0.01 ～ 5.0 μg/mL，相关系数 R2 ≥ 0.999； 相对标准偏差 RSD（n=6）为 2.82% ～ 5.10%；加标回收率 96.23% ～ 104.26%。当取样量为 5.000 g 时，VD2、VD3 的 检出限均低于 0.2 μg/100 g。
关键词：维生素 D；保健食品；液相色谱（HPLC）；内标法
维 生 素 D3 与 维 生 素 D2 为 脂 溶 性 维生素，主要功用是调节细胞生长分 化和人体免疫功能，有利于新骨生成 和钙化，促进骨骼生长 [1]，预防骨质 疏松症。但维生素 D 摄入过多，可引 起高血钙、甚至软组织异位骨化等 [2]。
Toledo），高效液相色谱仪（LC-20A， 5009.82-2016）第四法，准确称量某
维生素 D2 D3
线性范围 μg/mL 0.01 ～ 5.0 0.01 ～ 5.0
表 1 线性方程、相关系数（r2）及定量下限
线性方程
相关系数，r2
检出限 μg/100 g
C=1.0575A-0.0552
0.9999
0.1954
C=1.3888A-0.4966
0.9996
0.1723
Hale Waihona Puke 定量限 μg/100 g 0.6513 0.5743
维生素d检测方法
维生素d检测方法
维生素D检测方法根据需要检测的维生素D形式可以分为两种：维生素D2（ergocalciferol）和维生素D3（cholecalciferol）。
1. 高效液相色谱法（HPLC）：这是目前最常用的检测维生素D的方法之一。
首先通过样品预处理，提取维生素D，并将其转化为可测量的形式。
然后使用高效液相色谱仪进行分离和测量。
这种方法可以同时测量维生素D2和维生素D3。
2. 放射免疫测定法（RIA）：这是一种常用的测量总维生素D浓度的方法。
首先将样品中的维生素D与放射性荧光标记的维生素D结合。
然后使用放射免疫法来测量标记维生素D的浓度。
这种方法不区分维生素D2和维生素D3的浓度，只测量它们的总和。
3. 液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）：这是一种高灵敏度和高选择性的测量方法。
首先通过样品准备，提取和预处理维生素D。
然后使用液相色谱技术实现维生素D的分离。
最后使用串联质谱仪来检测和定量分离的维生素D2和维生素D3。
这些方法通常需要在实验室环境中进行，并由专业人员操作。
在进行维生素D 检测前，应选择适当的方法，并确保样品的准备和保存符合要求，以获得准确的测量结果。
维生素d常用的含量测定方法_概述及说明
维生素d常用的含量测定方法概述及说明1. 引言1.1 概述在我们的日常生活中，维生素D是一种非常重要的营养物质。
它对我们身体的健康具有至关重要的影响，包括促进骨骼生长和维持免疫系统功能等。
而为了确保我们获得足够的维生素D，我们需要了解食物和补充剂中维生素D的含量。
因此，测定维生素D的含量成为一个重要且必要的任务。
1.2 文章结构本文将对维生素D常用的含量测定方法进行概述和说明。
首先，我们将介绍维生素D在人体中的重要性和其主要功能、来源以及缺乏症状。
接下来，我们将详细介绍几种常见的测定方法，包括生化分析法、液相色谱法以及免疫学方法，并对每种方法进行说明。
最后，我们将总结文章内容并给出结论。
1.3 目的本文旨在提供对于测定维生素D含量方法的解释与说明，使读者能够更好地理解使用各种测定方法来确定食物或补充剂中维生素D的含量。
通过这样的了解，人们可以更好地制定膳食计划、购买合适的补充剂，并确保维生素D的充足摄入，维护身体健康。
2. 维生素D的重要性2.1 维生素D的功能维生素D是一种脂溶性维生素，对于人体健康至关重要。
最主要的功能是促进人体对钙和磷的吸收和利用。
它在骨骼发育和维持正常骨骼结构中起着关键作用。
此外，维生素D也参与免疫调节、神经系统发育、心血管健康以及肌肉功能等许多其他重要生理过程。
2.2 维生素D的来源维生素D可以通过两种方式得到：一是皮肤暴露于紫外线下，能够自主合成产生活性维生素D3；二是通过食物摄入。
食物中富含维生素D的主要来源包括脂类鱼类（例如鲑鱼、金枪鱼）、蛋黄、奶制品以及强化的食品（如强化谷物、橙汁等）。
2.3 维生素D的缺乏症状缺乏维生素D会导致骨骼健康问题。
儿童期间，严重缺乏可能引起佝偻病，表现为软弱的骨骼和变形。
在成人身上，维生素D缺乏可能会导致骨质疏松、易骨折等问题。
此外，维生素D缺乏还与免疫系统功能受到影响、肌无力、心血管疾病风险增加以及情绪障碍等多种其他健康问题相关联。
维生素D检测 方法
2013-1-3 第2 页 © 2011 罗氏
仅供内部使用
维生素 D
生物骨骼功能已众所周知 ...
• 维持正常血液钙与磷的浓度 • 增加小肠钙吸收 • 支持类骨质与其他维生素、激素与矿物质
的矿化 • 维生素 D 的浓度受 PTH 密切调节，PTH 可刺激肾小管对钙离子重吸收，并促进肾 脏生成维生素 D 1,25-(OH)2 • 对于强壮骨骼的形成与维持非常重要
小结
罗氏的电化学发光法总维生素D测试，全面，快速，准确，是 目前先进的检测方法
11
临床(25-OH) VitD3水平判读
目前没有官方的指南，也没有被广泛认可的VD判读水平
多家检测试剂说明书都建议如下判读水平（罗氏 雅培
• 维生素 D缺乏: < 10 ng/ml • 维生素 D不足: 10 – 30ng/ml • 维生素 D充足: 30 – 100 ng/ml • 维生素 D中毒: > 100 ng/ml < 25 nmol/L 25 – 75 nmol/L 75 to 250 nmol/L > 250 nmol/L
补充Vit D3 患者 补充Vit D2 患者
(25-OH) D3 可检测 可检测 (25-OH) D3+(25-OH) D2 可检测D3 不可检测D2 可检测D3+D2
Vit D total检测值为 Vit D total 与(25-OH) D3+D2，数值上大于 Vit D3 数值与意义相 (25-OH) Vit D3 ，更全 当 面反应体内维生素状况
抗骨松药效发挥最佳疗效
美国一项调查： 2家医院共210名患者
比值比
置信区间
P值
结果： 维生素D>33ng/ml能够使得 双磷酸盐治疗效果最大化。 （治疗无效人数最少）
公共营养师(三级)考点辅导：维生素D的测定方法
高效液相色谱法 1.原理样品中脂溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离，以石油醚萃取后，用正相色谱柱提取富集，用反相色谱柱，紫外检测器定量测定。
2.适用范围本方法来源于GB/T5413.9-1997。
适用于婴幼儿配方食品和乳粉维生素A、维生素D、维生素E的测定；也适用于食品或强经食品及饲料中的维生素D含量的测定。
3.主要仪器1)高压液相色谱仪，具有可变波长的紫外检测器，数据处理系统或记录仪。
2)旋转蒸发器。
3)平底烧瓶：250mL。
4)分液漏斗：500mL。
4.试剂所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所实验用水均指蒸馏水。
1)异丙醇：色谱纯。
2)2％焦性没食子酸乙醇溶液：取2g焦性没食子酸溶液于100mL 无水乙醇中。
3)75％氢氧化钾溶液：取75g氢氧化钾溶于100mL水中。
4)石油醚：沸程30～60℃。
5)甲醇：色谱纯。
6)正己烷：色谱纯。
7)环己烷:色谱醇。
8)维生素D标准溶液 A.维生素D2标准贮备液：含维生素D2100mg/ml的甲醇溶液。
称取10mg的维生素D2，用甲醇定容于100mL容量瓶中。
B.维生素D3的标准贮备液：含维生素D3100mg/ml的甲醇溶液。
称取10mg的维生素D3，用甲醇定容于100mL容量瓶中。
5.操作步骤 5.1样品处理：准确称取10g样品，于250mL平底烧瓶中，加30mL蒸馏水。
5.2测定液的制备：1)于上述样品溶液中加入100mL的20％没食子酸乙醇溶液，充分混匀后加50mL75％氢氧化钾溶液，在蒸汽浴上边续回流30min后，立刻冷却到室温。
2)将皂化液转入一500mL分液漏斗中，用100mL水分几次冲平底烧瓶。
洗涤液并入分液漏斗中。
3)于上述分液漏斗中，加入100mL石油醚，盖好瓶塞，倒置分液漏斗并剧烈振摇1min.在振摇过程中，注意释放瓶内压力。
静置分层，将水相放入另一500mL分液漏斗中，重复上棕萃取过程2次，合并醚液到第一个分液漏斗中。
用蒸馏水洗该醚液至中性，通过无水硫酸钠过滤干燥，在40℃和氮气流下，于旋转蒸发器上蒸至近于（绝不允许蒸干）后，用石油醚转移至10mL容量瓶中，定容。
维生素D的分析、结构和性质
第五节 维生素E
O
HO
苯并－二氢吡喃醇
CH3
R2
O*
HO R1
名称 α-生育酚 β-生育酚 γ-生育酚 δ-生育酚
*
*
R1 CH3 CH3 H H
R2 CH3 H
CH3 H
相对活性 1.0 0.5 0.2 0.1
生物效价 右旋体 ： 消旋体 = 1.4 ：10
VitEH 7 5℃N 1O53′生育酚 生育红 [ O]
橙红色
强氧化剂
H3C
CH3 O
O O
H3C HO
HNO3
CH3 O
CH3
CH3 C16H33
生育酚
CH3 C16H33
生育红（橙红色）
取本品约30mg，加无水 乙醇10ml溶解后，加硝酸2ml， 摇匀，在75℃加热15分钟，溶 液应显橙红色。
三、杂质检查 维生素D2中麦角甾醇的检查
灵敏度法
维生素D2 Ch.P（2005） 【检查】麦角甾醇 取本品10mg，加90%
乙醇2ml溶解后，加洋地黄皂苷溶液（取 洋地黄皂苷20mg，加90%乙醇2ml，加 热溶解制成）2ml，混合，放置18小时， 不得发生浑浊或沉淀。
四、含量测定 HPLC 药典附录 维生素D测定法 共有三法
第一法 适用于无维生素A醇及其它 杂质干扰时 正相色谱、内标法
1. 色谱条件 色谱柱 硅胶 流动相 正己烷 –正戊醇（997:3） 内 标 邻苯二甲酸二甲酯
2. 系统Байду номын сангаас应性试验
维生素D3 光照
对照品
△
维生素D3 前维生素D3 反式维生素D3 速甾醇D3
维生素制剂中的维生素D化学分析方法
维生素制剂中的维生素D维生素和其它营养物比色法A原理根据制剂是否含有油类，是否有其他脂溶性维生素存在以及维生素D的浓度要求特定的步骤，见表24-1所示。
A.a不含其他维生素的维生素D浓缩物按G制备的样品残留物，含有约2.5mg维生素D〔100，000IU〕，并溶于10.0ml0.1%BHT溶液中B(p)。
分别吸取此溶液4ml至2个10ml 容量瓶中，向其中一个瓶中加入2ml10%马来酸酐溶液B(m)(1)，将塑料管置于瓶颈上，充以氮气并用弹簧夹夹住管子。
在100℃水浴上于暗处加热3h，冷却，用0.1%BHT溶液稀释溶液〔用马来酸酐处理及未处理过的溶液〕，并定容。
定量转移未处理的溶液至200ml容量瓶中且用0.1%BHT溶液稀释定容。
按J(b)加显色剂采用比色法测定处理过的及未处理的稀释溶液的吸光度A。
$$残留物色值(%)＝5×(A/Au)$$式中A及Au分别表示处理过的和未处理过的稀释溶液的吸光度A。
当残留物色值小于等于5%，则被认为异速甾醇可忽略不计。
A.b复合维生素制剂中的维生素D将制剂皂化并提取，未皂化物在磷酸盐处理过的氧化铝色谱柱上层析，成功的除去可能存在的生育酚、胡萝卜素及BHT；在聚乙二醇600-ChromosorbW及Florex上除去可能存在的维生素A，纯化了的样品用马来酸酐处理以除去无生物活性的反式异构体。
维生素D与三氯化锑反应后进行比色法测定，对仍然存在于最后溶液中的维生素A分解产物的干扰应加以校正。
B试剂B.a溶剂大于等于95%Ac2O，乙醇，无甲苯的苯，无过氧化及酸的乙醚，无酸的异辛烷，无过氧化物及酸的聚乙二醇600及无酸的甲苯。
B.b石油醚在颗粒状KOH上回流，收集40℃至60℃的馏分。
B.c乙醚-石油醚洗脱液石油醚中8%和30%的醚。
B.d二氯乙烯按下述方法提纯试剂级产品。
将1L二氯乙烯与50g粒状KOH及约50cm^2^铝箔回流2h，除去KOH及铝，加5g粉末状P2O5与二氯乙烯振摇并蒸馏〔沸点82℃)，弃去50ml初馏液。
高效液相色谱-质谱法检测血清中维生素D含量
高效液相色谱-质谱法检测血清中维生素D含量曾义【摘要】目的建立测定血清中25-羟基D2和25-羟基D3含量的高效液相色谱-质谱法.方法采用固相萃取柱对血清样品进行处理和净化,以0.1％甲酸水溶液-0.1％甲酸的甲醇溶液(15∶85)为流动相,检测波长为240 nm,柱温为50℃,流速为0.5 mL/min为色谱条件,以ESI+ APCI组合离子源,正离子模式;离子源喷射电压5000V,离子源温度250℃,离子源喷雾流速5L/min为质谱条件.结果建立的分析方法25-羟基D2和25-羟基D3质量浓度线性范围在5～100 ng/mL范围与峰面积有良好线性关系(R2=0.999 2,0.999 5),日内精密度均低于5％,日间精密度均低于10％,回收率在96.19％～ 108.23％之间,血清中检测限和定量限分别是2 ng/mL和3 ng/mL.结论所建立的方法准确、灵敏、可重复,可用于检测血清中25-羟基D2和25-羟基D3的含量.【期刊名称】《中国药业》【年(卷),期】2013(022)020【总页数】2页(P17-18)【关键词】高效液相色谱-质谱法;维生素D;液质联用;固相萃取【作者】曾义【作者单位】重庆市黔江中心医院,重庆 409000【正文语种】中文【中图分类】R927.2;R977.2+4维生素D缺乏不仅与骨质疏松症和骨软化症相关，而且容易导致肌肉力量下降，近年来发现维生素D与癌症、心血管疾病、糖尿病等都有相关性，足量的体内维生素D水平对癌症、多发性硬化症、糖尿病等有一定预防作用[1]。
国外研究表明，维生素D的摄入与癌症的预防呈正相关，血清低水平维生素D与较高的外周动脉疾病发病率存在关联[2]。
维生素D有两种存在形式，即钙化醇(维生素D2)和胆固醇(维生素D3)。
维生素D状况评估主要是通过测量循环中血清25－(OH)－D水平。
传统检测方法采用竞争结合试验和免疫测定法来检测循环中总的维生素D(D2和D3)，这些方法中抗体交叉反应性通常不足100%[3]，因此结果差异较大。
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维生素D测定方法
维生素D的测定方法，目前只有“婴幼儿配方食品和乳粉通用检验方法”介绍的GB/T 5413.9-1997所列的先正相收集，后反相分离的HPLC测定方法。
该法可同时测定A.D.E，但操作比较烦琐，对于维生素的营养素补充剂，样品中杂质干扰小，在测定A.E的同时可控制采样量和色谱的分离条件，并参照GB/T 5413.9-1997与GB/T 5009.82-2003（食品中维生素A和维生素E的测定）的方法检测营养补充剂维生素D也可同时测定A.E。
一、原理
样品中维生素D经热皂化处理后。
用HPLC紫外检测，内标法定量。
二、仪器
1、HPLC：water公司，510泵，486紫外检测器，三锐色谱工作站。
2、超声波振荡器
3、水浴箱
4、0.45μ滤膜
三、试剂
1、维生素D3标准对照品：精确称取维生素D3标准对照品（sigma公司）5.0mg 左右加已脱醛处理的无水乙醇至50ml刻度，配成100μg/ml的标准D3贮备液。
2、维生素D贮存一般较稳定，贮备液也可在264μn下按常规的标定方法用比吸光系数计算出维生素D3的标准浓度。
维生素D3比吸光系数E1%cm=493。
3、其他试剂：无水乙醚，无水乙醇，无水硫酸钠，甲醇，抗坏血酸，氢氧化钾，内标苯并e芘……等同GB/T 5009.82-2003或GB/T 5413.9-1997
四、方法
1、准确称取经研碎成粉状的均匀样品2.0g于皂化瓶中，加内标苯并e芘溶液
2.0ml，加10%抗坏血酸5ml，样品先混成均匀的糊状，再加无水乙醇30ml同1：1氢氧化钾溶液10ml在沸水上皂化10分钟，使皂化完全，皂化后立即放入冰中冷却。
2、提取、洗涤、浓缩等步骤同GB/T 5009.82-2003，最后用无水乙醇定容至2ml。
五、色谱条件“
1、流动相：甲醇：水=97.5：2.5
2、分析柱：Kromasil C18 5μ250×4.6mm
3、紫外检测器波长：264nm（如同时测定维生素A.E可依维生素A.D.E的峰时间在325nm→264nm→292nm转换。
4、进样量10μl
5、流速：1.0ml/分钟
六、计算：常规内标法定量
注：本实验条件的出峰和检测波长转换顺序：
检测波长出峰时间
维生素A：325nm 5.80’±
内标苯并e芘：325nm 7.45’±
维生素D3：264nm 17.09’±
维生素E：292nm 19.61’±
叶酸测定方法
一、原理：样品中的叶酸用稀氨水提取，用HPLC反相分离后紫外检测，外标法定量。
二、仪器
1、HPLC：Water 公司.510泵、486紫外检测器、三锐色谱工作站。
2、PH计：ORION SA 720
3、超声波提取器
4、水浴箱
5、0.45μ滤膜
三、试剂
磷酸二氢钾（AR）；氢氧化钾（AR）；氨水（AR）；甲醇（色谱醇）；叶酸标准对照品（sigma公司）纯度＞98%
四、色谱条件“
1、流动相：称取磷酸二氢钾6.8g，氢氧化钾（0.1mol/L）70ml用水稀释到850ml，再用PH计调PH6.3±0.1，用0.45μ滤膜过滤后备用（水相），临用前与甲醇混合，水相：甲醇=87：13，超声脱气为流动相。
2、色谱柱：Kromasil C18 5μ250×4.6mm
3、流速：0.8ml/分钟
4、检测器波长：UV254
5、进样量10μl
五、方法
1、标准配制：准确称取sigma公司叶酸标准对照品10.0mg于50ml容量瓶中加0.5%氨溶液，超声溶解并用0.5%氨溶液稀释至50ml刻度，配成0.2mg/ml的叶酸标准贮备液。
本样品通过预实验配制成合适的叶酸标准进样浓度为5～6μg/ml 于HPLC进样测定，同时记录相应的峰面积。
2、样品提取与测定：准确取均匀研碎的样品粉末约5g(准确至0.001g)于100ml 容量瓶中，加0.5%氨溶液约80ml，超声提取15分钟，再于沸水中加热15分钟，冷却，再用0.5%氨溶液稀释至100ml刻度，摇匀经0.45μ滤膜过滤后，进样于
HPLC检测记录峰面积。
六计算：
样品峰面积×叶酸标准浓度μg/ml×100×1000
叶酸mg/100g=
标准峰面积×样品重量（g）×1000
注：本方法参照中华人民共和国药典2005年版二部P109叶酸片的定量方法。