(高考生物)生物固氮作用的分子机理研究

（生物科技行业）生物固氮作用的分子机理研究
项目名称：生物固氮作用的分子机理研究首席科学家：王忆平北京大学
起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部
一、研究内容
生物固氮研究的关键科学问题是获得最佳生物固氮体系（包括共生固氮、联合（内生）固氮等）和建立非豆科植物的自主固氮体系，具体包括：（1）阐明根瘤菌共生固氮基因表达调控的网络，根瘤菌识别、传递环境和植物信号，调节自身基因表达的分子机理；（2）揭示固氮及氮代谢基因调控机理，与碳代谢系统及其基因的调控偶联机制；（3）阐明共生固氮体系中植物与微生物相互作用的机理，如植物与微生物相互识别及分子信号的传导机制，克服宿主特异性，从而扩大根瘤菌的宿主范围；（4）利用单细胞真核生物--酵母菌的线粒体遗传操作系统，探索固氮基因簇向真核生物转化和表达的机制，为固氮基因向高等植物转移，建立非豆科植物自主固氮体系的奠定基础。

（5）阐明固氮酶结构、功能和催化机理。

围绕上述提高生物固氮效率、扩大共生固氮植物范围、建立自主固氮体系的关键问题，主要研究内容有：
（1）以模式豆科植物共生固氮体系为材料，分离和鉴定参与根瘤菌结瘤因子信号传递的调控元件及基因，研究和建立根瘤菌与宿主植物共生关系蛋白相互作用网络；通过对豆科植物与根瘤菌、AM真菌共生的异同以及与非豆科植物比较基因组学研究，揭示非豆科植物中存在哪些与共生相关基因的功能及调控机制，为探索扩大根瘤菌寄主范围和建立非豆科共生固氮途径可能性提供科学资料；分离和鉴定LysR、GntR等家簇转录因子及其靶基因，阐明根瘤菌主代谢与共生固氮功能的相关性和调控机理；开展根瘤菌群体感应系统、Ⅲ型分泌系统及胞外多糖合成基因表达调节的双组分调控系统的研究，阐明这些代谢系统在不同环境条件下的功能和作用机制，揭示根瘤菌环境适应性与竞争结瘤之间的相关性。

（2）碳代谢与氮代谢是自然界生命活动的两大主要代谢作用。

固氮基因调控
机理，以及碳代谢和氮代谢之间的调控偶联途径已经得到了解析，但碳代谢对固氮基因的表达的抑制机理与途径有较大不同。

因此，进一步解析碳代谢调控系统对固氮基因的调控偶联机理将为提高生物固氮效率打下理论基础；建立酵母菌单细胞真核生物及其线粒体遗传操作系统，探索固氮基因簇向真核生物转化的可能和表达机制。

包括：酵母菌线粒体遗传操作系统的构建；线粒体钼的运输、RNA 聚合酶对固氮基因表达的影响（RNA聚合酶、因子、DNA折叠蛋白等）；线粒体呼吸耗氧与固氮酶厌氧的关系和影响；线粒体与细胞质之间的氨基酸穿梭往返机制对生物固氮效果的影响等。

以上研究是固氮基因向真核生物转移的新的尝试，为非豆科植物（包括粮食作物）建立自主的生物固氮体系探索新路。

（3）联合固氮作用有三个重要的限制因子，即氧、铵和能量。

其中，能量和铵又是导致目前田间联合固氮效率低下的最主要限制因子。

我们拟利用功能基因组操作平台，对斯氏假单胞菌和巴西固氮螺菌等联合固氮菌和上述主要限制因子，在联合固氮微生物功能基因组、联合固氮基因表达调节以及固氮酶催化机制等开展工作。

分析鉴定可能参与细菌氮信号传导、调控或保持最佳固氮水平的新基因和新机制，系统研究联合固氮体系形成的分子机理和联合固氮微生物对土壤环境变化的适应能力,探讨提高作物与固氮微生物之间的联合固氮效率的策略。

（4）在固氮酶还原氮气和质子的分子机制方面，利用生物信息学和结构化学理论，分析研究野生型及各突变株固氮酶还原N2和H+的动力学、EPR、CD波谱等特征。

明确N2的络合和还原位置及其电子质子传递通道。

二、预期目标
总体目标：
本项目的总体目标是借助分子生物学和现代生物技术，开展生物固氮作用的分子机理研究，在分子水平上解析低等固氮微生物与高等植物宿主之间遗传信息的交流；共生固氮体系的建立；固氮过程中能量及营养物质的交换；固氮功能的发挥等关键科学问题。

为扩大根瘤菌宿主植物范围、提高生物固氮效率，探索非豆科植物共生体系及自主固氮的可能性提供科学依据，为生物固氮在农业生产中的应用提供理论基础和技术支撑，缓解和减轻农业生产中长期和大量依赖工业氮肥施用所造成的能源和环境问题，为保障我国粮食生产安全，农业可持续发展提供新的途径。

五年目标：
1）建立根瘤菌与宿主植物共生关系中蛋白相互作用网络，分离和鉴定参与根瘤形成和发育功能基因及其调控蛋白，阐明根瘤菌共生信号在豆科植物中接受、传递及其调控的机制；建立豆科植物突变体库，分离和鉴定与共生固氮相关的突变株；比较豆科植物与根瘤菌或AM真菌共生基因的异同，并比较非豆科植物基因组，阐明非豆科植物中存在哪些与共生固氮相关的基因及其功能、表达与调控机制。

2）通过基因芯片等转录组学方法，分离和鉴定LysR和GntR家族转录因子调节的下游靶基因，阐明其调节共生固氮作用的分子机理；通过定向缺失突变，分离和鉴定参与根瘤菌细胞周期调控以及共生固氮作用的激酶和反应蛋白基因，并确定其相互作用网络；分离和鉴定参与共生固氮作用的功能基因和调节蛋白，阐明根瘤菌共生固氮基因表达调控的网络，根瘤菌识别、传递环境和植物信号，
调节自身基因表达的分子机理。

3）在结构层面和基因组水平揭示固氮及氮代谢基因调控机理，与碳代谢系统及其基因的调控偶联机制，为提高固氮效率奠定理论基础；在结构层面上解析根瘤菌共生固氮的唯一碳源（能量）供应系统（Dct）的信号转导原理及其调控机制，为提高共生固氮效率奠定理论基础；构建单细胞真核生物--酵母菌的线粒体遗传操作系统，探索固氮基因簇向真核生物转化和表达的机制，为固氮基因向高等植物转移，建立非豆科植物（包括粮食作物）自主固氮体系的奠定基础。

4）开展联合固氮微生物比较基因组、生物固氮体系的进化、不同条件下联合固氮微生物基因表达谱的研究，揭示生物固氮进化途径的形成和机制，分析鉴定可能参与细菌氮信号转导或保持最佳固氮水平的新基因；系统研究联合固氮体系形成的分子机理，建立稳定的联合固氮体系，为提高作物与固氮微生物之间的固氮效率提出新策略；
5）分析P-cluster和FeMoco之间α螺旋上单个氨基酸替换后固氮酶结构的变化和可能对电子质子传递的影响，对固氮酶MoFe蛋白α亚单位中FeMo辅因子周围多肽环境中保守氨基酸定位诱变并构建不同的突变株，明确FeMoco的Fe2和Fe6是否是氮的络合和还原位置，及用于氮和质子还原的电子质子传递通道。

6）分离和鉴定100个左右在共生固氮系统中参与根瘤形成和发育、共生固氮作用的功能基因和调节蛋白、根瘤菌细胞周期调控、LysR和GntR家族调控子（regulon）的新基因；分离和鉴定30-50个与共生固氮相关的突变体；20个联合固氮系统中参与细菌氮信号转导或保持最佳固氮水平的新基因；在影响因子2以上的国际刊物上发表论文80篇或达到相应的影响因子总数的文章数目。

申请
国内外发明专利10个以上。

在生物固氮研究领域造就一支高水平的研究队伍，培养博士研究生60名以上。

三、研究方案
1）学术思路：
我们的学术思路和技术途经是围绕着生物固氮菌氮碳代谢基因表达调控偶联机理、豆科植物与根瘤菌相互作用机理、根瘤菌固氮系统调控机理和固氮菌固氮基因网络调控与固氮酶催化机制等核心课题，依据多学科（生物学、化学、物理学）交叉的研究优势，获得创新成果，促进生命科学领域的发展。

同时提高生物固氮的效率，促进农业可持续发展。

总体研究方案以下图简示：
2）技术途径：
总体研究方案以下图简示：
生物固氮作用的分子机理研究
豆科植物共生信号根瘤菌固氮系统固氮菌氮碳代谢联合固氮菌固氮基因
传递及作用机制调控机理基因调控偶联网络调控与酶催化机理
扩大根瘤菌固氮基因向真核高效稳定的固氮体系
的宿主范围生物的转移
非豆科植物的生物固氮
生物固氮创新研究和农业持续发展
3)创新点与特色：
本建议项目是继2002-2006年“高效生物固氮作用机理及其在农业中的应用”973项目之后，又一次跨学科、跨系统的全国性大型协作。

我们争取在以下问题上获得创新成果：
1）本项目四个课题的研究内容都集中在两条主线上，一个研究如何提高生物固氮效率；一个是研究建立共生或自主固氮体系的基本条件。

这两条主线都为
最终提高农作物产量服务。

2）从豆科植物固氮根瘤形成调控系统和根瘤菌固氮调控系统两个方面出发，结合根瘤菌及其宿主植物基因组学、功能基因组学和蛋白组学技术平台，现代分子生物学、遗传学理论和技术，对共生固氮体系植物和根瘤菌各自基因的表达和两者之间分子相互作用机制研究，具有创新性和特色。

3）碳代谢与氮代谢是自然界生命活动的两大主要代谢作用。

本建议项目从揭示存在于微生物体内的固氮及氮代谢与碳代谢之间的基因调控偶联及其调控机理出发，进而研究固氮过程中能量的供应，对提供碳源，提高固氮作用有重要意义。

这也是本建议项目的特色和创新点之一；
4）建立酵母菌单细胞真核生物及其线粒体遗传操作系统，探索固氮基因簇向真核生物转化的可能和表达机制，是固氮基因向真核生物转移的新的尝试，为非豆科植物（包括粮食作物）建立自主的生物固氮体系探索新路。

5）通过对野生和突变固氮酶的结构与功能进行比较，确定N2和H+在活性中心原子簇上的络合与还原位点及其催化机理，为实现温和条件合成氨的设想创造条件。

在学科发展方向上具有创新性和特色。

4）可行性分析：
我们认为上述预期成果是可以达到的，理由是：
本建议是在“八五”、“九五”、“十五”的“863”计划项目“根瘤菌和寄主相互关系的分子遗传学研究”、“重组大豆根瘤菌的研制”、“水稻联合固氮菌研究”、“玉米联合固氮研究”、“高效固氮大豆、花生根瘤菌的研制”、“高效固氮大豆、花生根瘤菌的中试研究”、“重组大豆根瘤菌的研制”、“重组固氮菌田间把关鉴定”、“高效固氮工程菌的构建及其应用”、“新型高效固氮菌剂的研制”；国家
自然科学基金重点项目“我国豆科植物根瘤菌资源调查和分类”的研究、国家973项目“高效生物固氮作用机理及其在农业中的应用”基础上提出的。

本研究方案将我国的生物固氮资源与生物固氮基础研究和应用基础研究有机地结合起来，使近期和中长期目标更加明确、技术路线更加清晰，具有可行性和创新性。

本建议项目将由在固氮微生物及其宿主植物的基因调控及其分子生物学、固氮微生物分子生态学及其分类、微生物与植物相互作用及其分子生物学、固氮酶生物化学及其化学模拟等研究方面的国内优势单位组成，具有很好的研究基础和成熟的组织管理经验。

建议参加单位的实验设施和装备良好，其中有国家重点实验室5个和部门重点实验室3个。

建议参加本项目研究任务的主要单位有北京大学、中国农业大学、华中农业大学、南京农业大学、中山大学、中科院上海植物生理生态研究所、中科院植物研究所、中国农业科学院生物技术研究所等国内优势单位共37人，其中包括新近引进的杰出人才10余人。

多年来，我国生物固氮研究与英国、法国、德国、荷兰、比利时、美国、澳大利亚等国家有良好的合作基础，其中包括政府间科技合作议定书的重点项目，如“中法先进研究计划”、“中德科技合作项目”、“欧盟合作计划项目”、美国洛氏基金“水稻结瘤固氮国际合作项目”、国际人类前沿科学基金（HFSPO）：“细菌中氮同化作用的调控网络研究”等。

首次在亚洲召开的国际固氮大会（第十四届）于2004年在北京由本项目首席科学家王忆平教授主持大会并获得圆满成功，会议进一步展示了我国生物固氮研究的成果，并促进了我国科学家与国际同行的合作与交流。

各课题间相互关系
1豆科植物固氮根瘤形成的分子机理
本课题以模式豆科植物共生固氮体系为材料，研究蛋白质与蛋白质、蛋白质与核酸、蛋白质与多糖的相互作用，建立根瘤菌与宿主植物共生关系建立早期蛋白相互作用网络。

分离和鉴定参与根瘤菌结瘤因子信号传递的调控元件及基因，研究植物响应根瘤菌结瘤因子的作用方式、传递途径及其信号蛋白的调控机制。

研究豆科植物的长/短距离信号转导途径之间的关系，阐明根瘤形态发生以及根瘤属性的分子机制，为提高共生固氮效率和作物产量、以及在非豆科植物建立共生或自主固氮体系奠定细胞生物学和形态发育的分子基础。

通过对豆科植物与根瘤菌、AM真菌共生的异同以及与非豆科植物比较基因组学研究，揭示非豆科植物中存在哪些与共生相关的基因及其调控机制，为探索扩大根瘤菌宿主范围和建立非豆科共生固氮途径可能性提供科学依据。

主要研究内容：
1）研究响应根瘤菌信号分子的宿主植物苜蓿基因，及其在根瘤发育中的信号传导。

研究百脉根突变体rel1和rel3中，小RNA在生长素信号传导途径中对于根瘤发育的调控作用。

通过对根瘤菌与多种豆科宿主植物（苜蓿和百脉根等）互作过程的研究，揭示结瘤因子在宿主植物中的信号传导途径和植物水解酶诱导的结瘤因子失活机理。

2）利用酵母双杂交技术鉴定出与根瘤菌Ⅲ型效应因子互作，并决定宿主特异性结瘤的豆科植物基因（即靶蛋白）。

通过构建不同转录水平的转基因植物来研究所克隆基因在共生中的作用。

另外，将构建可表达Ⅲ型效应子的转基因豆科植物，以此来研究根瘤菌Ⅲ型效应子在植物细胞中的功能（如：引起超敏反应；抑制植物防御反应等）。

此外，应用Cre重组酶Lox-P技术，验证Ⅲ型效应子-Cre 融合蛋白是否从根瘤菌转移到豆科植物。

构建表达启动子-loxP-报告基因（编码
葡糖苷酸酶或绿色荧光蛋白）的转基因日本百脉根，接种携带Ⅲ型效应子-Cre融合蛋白的根瘤菌后，可在显微镜下检测报告基因的表达活性。

3）通过抑制性减法杂交技术，DNA微阵列技术和蛋白质组技术确定被根瘤菌胞外寡聚糖所诱导的豆科植物基因。

通过RNA干扰技术将找到的基因进行沉默，从而研究其在共生过程中的功能。

通过基因突变方案（获得基因功能的方法）鉴定百脉根中不需要胞外寡聚糖也可以建立根瘤菌NGR234与豆科植物的固氮结瘤的突变体。

4）在宿主植物与根瘤菌相互作用机理方面：根瘤菌与宿主植物共生关系早期蛋白相互作用网络，根瘤菌结瘤因子的作用方式、传递途径中的基因（如：COCH、BIO1/ELE1和ELE2基因及其同源基因等）及其调控机制。

豆科植物与根瘤菌、AM真菌共生的异同比较，以及与非豆科植物比较基因组学，探讨在豆科根系和其他高等植物根系发育中的功能差异；在水稻中异源表达豆科植物结瘤因子信号转导途径中的基因（如LysM受体激酶等）；用结瘤因子处理转基因水稻以观测相关的菌根信号转导途径中的基因是否表达；研究植物与微生物共生所产生的其他特殊根形态发育（如菌根）与豆科根瘤形态发育分子调控机理的异同，揭示非豆科植物中与共生相关的基因及调控机制。

5）在豆科植物固氮根瘤形态发育与其他不同器官的关系方面：整合百脉根、蒺藜苜蓿的基因组信息和豌豆EST信息，设计芯片，分析野生型和突变体的表达谱，以及应用酵母双杂交等技术，寻找与COCH、BIO1/ELE1和ELE2基因相互作用的基因/蛋白，确定COCH、BIO1/ELE1和ELE2基因所参与的信号转导途径的遗传调控网络。

探讨根瘤及侧根发育的分子途径异同；COCH对根瘤属性（有限和无限型）决定的分子机理。

BIO1/ELE1和ELE2基因所涉及的影响豆科作物整株形态发育的信号转导途径，及其在根瘤形态发生的分子决定机制。

预期研究目标：
1)建立根瘤菌与宿主植物共生关系早期蛋白相互作用网络，分离和鉴定参与根瘤形成和发育功能基因及其调控蛋白20-30个；确定结瘤因子信号通路调控的结瘤因子失活的分子机理（反馈调节通路），找到抑制结瘤因子活性的结瘤因子水解酶基因，研究这些与结瘤因子相关的基因在共生结瘤过程中的作用；确定豆科植物中与根瘤菌Ⅲ型效应因子互作的基因，并阐明Ⅲ型效应因子被释放进入了豆科宿主的细胞，及在特异性宿主结瘤过程中蛋白与蛋白互作的功能，了解Ⅲ型效应因子在宿主和非宿主豆科植物细胞中的分子机制。

确定在豆科植物中对根瘤菌的胞外寡糖的识别和共生作用相关的基因；了解胞外寡糖在宿主和非宿主豆科植物上的作用和分子机制。

进一步阐明根瘤菌共生信号在豆科植物中接受、传递及其调控机制。

为扩大根瘤菌宿主植物范围，探索创建非豆科植物共生固氮体系的可能性提供科学依据。

2）建立豆科植物与根瘤菌共生固氮突变体库，分离和鉴定30-50个与共生固氮相关的突变体，阐明根瘤形态发生以及根瘤属性的分子机制，根瘤形成与JA 等植物激素信号转导途径的相关性。

3）通过对豆科植物与根瘤菌、AM真菌共生的异同以及与非豆科植物比较基因组学研究；通过构建对结瘤因子响应的转基因水稻，即拥有功能性的结瘤因子信号转导途径的水稻，阐明非豆科植物中存在哪些与共生固氮相关基因的功能及调控机制。

课题承担单位：中山大学、中科院上海植物生理生态研究所
课题负责人：StaehelinC.46博士教授中山大学
主要学术骨干：
程奇43博士教授中山大学
谢致平44博士副教授中山大学
罗达52博士教授中科院上海植物生理生态所
王彦章30博士副研究员中科院上海植物生理生态所
罗利30博士副研究员中科院上海植物生理生态所
陈爱民40硕士副研究员中科院上海植物生理生态所
经费比例：21.67%
2根瘤菌固氮系统调控的分子机理
借助分子生物学和现代生物技术，开展生物固氮作用的分子机理研究，在分子水平上解决低等微生物与高等植物遗传信息的交流、共生固氮体系的建立、固氮过程中能量物质的交换、及固氮功能的发挥等科学问题。

为扩大根瘤菌宿主植物范围、提高生物固氮效率，探索建立非豆科植物共生体系及自主固氮提供科学依据，为其应用提供理论基础和技术支撑，以缓解农业生产中长期和大量施用工业氮肥而导致的能源、环境问题，为农业可持续发展提供新的途径。

主要研究内容：
1）苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobiummeliloti）LysR和GntR转录因子家族中共生固氮必需基因的作用及其调节机理。

双组份系统（组氨酸激酶和反应蛋白）调节根瘤菌细胞周期相关基因表达的分子机理。

2）根瘤菌群体感应系统、Ⅲ型分泌系统的底物蛋白及胞外多糖合成基因表达调控系统，这些系统在根瘤菌共生固氮过程中作用及其分子机理。

3）类菌体及其与宿主方控制类菌体分化、固氮、衰老的功能基因组，dmtH，opa22,lpsH对华癸中生根瘤菌类菌体分化和根瘤发育的调控作用。

4）根瘤菌生物多样性及其环境与固氮作用的关系、新功能基因的发掘。

预期研究目标：
1)建立类菌体分化与固氮根瘤发育过程中根瘤菌与宿主植物间蛋白相互作用
网络，分离和鉴定根瘤菌-宿主共生体系双方控制类菌体分化、共生固氮
和根瘤衰老的功能基因、调控蛋白及信号分子20-30个，阐明各功能基
因的结构与功能及其调控机制。

为揭示根瘤菌与宿主植物在共生中、晚
期相互作用的分子机制提供科学资料。

2)建立根瘤菌“组学”研究平台，在自生和共生条件下开展根瘤菌共生固氮
基因组、转录组、蛋白组和代谢组学的研究，分离和鉴定LysR、GntR
等家簇转录因子及靶基因30-50个，阐明根瘤菌代谢与共生固氮功能的
相关性和调控机理，为改造和提高共生固氮效率奠定理论基础。

3)分离根瘤菌群体感应系统、Ⅲ型分泌效应子及胞外多糖等与共生相关基因
20-30个，阐明这些基因在不同环境条件下的功能和作用机制，揭示根
瘤菌环境适应性与竞争结瘤之间的相关性，为生物固氮在农业生产中的
应用提供理论基础和技术支撑。

课题承担单位：华中农业大学、南京农业大学
课题负责人：张忠明54硕士教授华中农业大学
主要学术骨干：
李友国42博士教授华中农业大学
朱辉32博士讲师华中农业大学
李一星30博士讲师华中农业大学
朱军40博士教授南京农业大学
钟增涛35博士副教授南京农业大学
郑会明27硕士讲师南京农业大学
王卉29博士讲师南京农业大学
经费比例：21.67%
3固氮菌氮、碳代谢基因表达的调控偶联及固氮基因向真核生物的转移
长期以来，微生物体内碳代谢与固氮及氮代谢之间的调控偶联一直不清。

然而，生物固氮是一个高耗能的过程，可供固氮微生物使用的植物光合作用产物（碳水化合物）的质和量是限制其固氮效率的主要瓶颈。

如何提供更多能源是提高共生固氮效率的关键。

实为提高共生固氮效率的必由之路。

目前已经有可能进行这方面的研究，但当前国际上尚未见有开展这方面的研究报道。

主要研究内容：
1）在结构层面和基因组水平，研究固氮及氮代谢基因调控机理，研究与碳代谢系统及其基因的调控偶联机制。

在固氮及氮代谢基因调控机理方面，拟从54-RNA聚合酶、AAA+家族激活蛋白、DNA弯曲蛋白及其靶位点这些主要元件出发，研究54-RNA聚合酶激活复合体的组装机制，及其在结构特征与功能。