致病菌检验-肉毒梭菌.

报告 （一）
毒素检测
观察生长性状， 染色镜检 报告（二）
分离培养
增菌产毒培养 30℃，5 d
观察菌落性状 染色镜检
毒素检测
培养检查
特殊需要例外）
报告（三）
（1）、肉毒毒素检测
液态或固体样品经过适当处理后离心，取上清液实验
上清液及其胰酶激活处理液
分别进行小白鼠腹腔注射，各3只，每只0.5 mL，观察4 d 注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24 h内发病、死亡。 确证试验 毒力测定
三、检验方法
1、检验标准：GB 4789.12-2003
2、培养基和试剂 培养基： 庖肉培养基、卵黄琼脂培养基、明胶磷酸盐缓冲液。 试剂： 肉毒分型抗毒诊断血清、胰酶（活力1:250）、革兰 氏染色液。 另需实验动物（小白鼠）。
3、检验Байду номын сангаас序
①报告(一)：检样中有无肉毒毒素以
及有何型肉毒毒素。(如仅为了肉毒中 毒诊断，即可结束检验) ②报告(二)：对增菌产毒培养物，一
中毒方式
• 食物媒介 • 吸入：极罕见的中毒类型 • 创伤感染：肉毒梭菌污染创伤部位，在局 部发芽繁殖，产生毒素，引起肉毒中毒。 • 肠道感染：根据肉毒梭菌能否在肠道内产 毒而引起人的都读中毒。
临床症状
• 肉毒中毒的潜伏期短着仅2h，长者可达10 天左右，通常约12-18h • 前期症状可能出现头昏、头痛、恶心、甚 至呕吐、腹泻等。 • 基本属于神经麻痹表现，最早是视觉障碍， 继而全身无力、呛噎、眼睑下垂、伸舌和 张口困难、抬头费力、瞳孔散大、咀嚼障 碍、不能下咽、胸内烦闷、有恐惧感、重 者晚期呼吸困难，最后死于呼吸麻痹。
（1）毒素检测：试验方法同上。 （2）培养特性检查：接种卵黄琼脂平板 ，分成两份，分别在35℃的需氧和厌氧 条件下培养48 h，观察生长情况及菌落 形态。肉毒梭菌只在厌氧条件下生长而 在需氧条件下不生长。
4、结果报告
报告(一)：检样含有某型肉毒毒素。 报告(二)：检样含有某型肉毒梭菌。 报告(三)：由样品分离的菌株为某型肉毒梭菌。 肉毒梭菌检验目标主要是毒素，不论食品中的肉毒毒素 检验还是肉毒梭菌检验，均以毒素的检测及定型试验为判定 的主要依据。
肉毒毒素是一种神经麻痹毒素，主要抑制神经末梢释放乙 酰胆碱，引起肌肉松弛麻痹，特别是呼吸肌麻痹导致死亡。 ������ 肉毒毒素的毒性极强，是目前已知在天然毒素和合成毒剂 中毒性最强的生物毒素，据称，精制毒素1克能杀死400万吨小 白鼠，一个人的致死量大概1微克左右。 肉毒中毒一年四季均可发生。美国以罐头发生中毒较多， 日本以水产品较多；我国以发酵食品（如：臭豆腐、豆瓣酱、 豆豉等）发生中毒较多。
在固体培养基表面上，形成类圆形， 边缘不整齐，约3毫米左右的菌落。菌落 半透明，表面一般比较光滑也有的呈颗粒 状，界线不明显，向外扩散。呈绒毛网状， 常常扩散成菌苔。
肉毒梭状芽孢杆菌菌落
3、肉毒梭菌的生化特性
肉毒梭菌的生化性状很不规律，即使同型，也常见到株 间的差异。
表1 各型肉毒梭菌的生化反应
定型试验
（2）肉毒梭菌的检出（增菌产毒培养试验）
取庖肉培养基五支，煮沸10min～15min，做如下处理：
第一支：急速冷却，接种检样均质液1 mL～2 mL；
第二支：冷却至60℃，接种检样，继续于60℃保温10 min，急速冷却； 第三支：接种检样，继续煮沸加热10 min，急速冷却。 以上3支试管于30℃厌氧培养5d，若无生长，可再培养10d。培养到期，若 有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同上，阳性结 果证明检样中有肉毒梭菌存在。
二、肉毒梭菌的致病性
肉毒梭菌能产生外毒素即肉毒毒素（大分子蛋白），根据 毒素的抗原特异性将其分为A、B、C （1、2） 、D、E、F、 G七个型别。与毒素型别相对应，肉毒梭菌也分为同样的七个 型别。其中A、B、E、F四型毒素对人有不同程度的致病性。 A型毒素经60℃ 2分钟加热，差不多能被完全破坏，而B、 E二型毒素要经70℃ 2分钟才能被破坏；C、D二型毒素对热的 抵抗更大些；C型毒素要经过90℃2分钟加热才能完全破坏，不 论如何，只要煮沸1分钟或75℃加热5~10分钟，毒素都能被完 全破坏。肉毒毒素对酸性反应比较稳定，对碱性反应比较敏感。 某些型的肉毒毒素在适宜条件下，毒性能被胰酶激活和加强。
毒素检测
检 样
增菌、产毒培养 30℃，5 d
方面做生长特性观察，同时检测肉毒
毒素。报告检样中有无肉毒梭菌以及 有何型肉毒梭菌。（有些样品如土壤、 泥沙等基本上不可能含有毒素，则应 从培养着手） ③报告(三)：欲获纯菌株，可用增菌 产毒培养物进行分离培养，对所得纯 菌株进行形态、培养特性等观察及毒 素检测，其结果可证明所得纯菌为何 型肉毒梭菌。（一般情况下，没有必 要从检样中分离纯的菌株，但研究或
致病菌检验——
肉毒梭菌
肉毒梭状芽孢杆菌检验
一、肉毒梭状芽孢杆菌的生物学特性 1、形态与染色 肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，革兰氏染色阳性， 约为4×1μm的大杆菌， 多单在，偶见成双或短链，两侧平行， 两端钝圆，直杆状或稍弯曲，芽胞为卵圆形，大于菌体宽度， 位于次极端，使菌体呈匙形或网球拍状，偶有位于中央，常 见很多游离芽胞。 有4~8根周生鞭毛，运动迟缓，无荚膜。
（3）、分离培养
选取证实含有肉毒毒素的增菌产毒培养物（必要时可重复一次适宜 的加热处理）接种卵黄琼脂平板，35℃厌氧培养48 h 。肉毒梭菌在卵黄 琼脂平板上生长时，菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样 (或珍珠 层样)薄层，但G型菌无此现象。 根据菌落形态及菌体形态挑取可疑菌落，接种庖肉培养基，于30℃ 培养5d，进行毒素检测及培养特性检查确证试验。
2、培养特性
最严格的厌氧菌 生长最适温度：28 ℃ ～37 ℃ ：pH为6.8~7.6，产毒的最适pH为7.8 ~8.2。 产毒培养温度：不同菌型产毒的最适培养温度不完全相同。C、D型 温度高些为宜，35℃ 培养3d即可，而E型菌低温度长时间培养效果较好。 对营养要求不高 ：在普通培养基上都能生长。