致病菌检验-肉毒梭菌.
肉毒梭菌及肉毒毒素检验 标准文本(食品安全国家标准)
食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验1 范围本标准规定了食品中肉毒梭菌（Clostridium botulinum）及肉毒毒素（botulinum Toxin）的检验方法。
本标准适用于食品中肉毒梭菌及肉毒毒素的检验。
2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：a）冰箱：2℃～5℃、-20℃;b）天平：感量0.1g;c）无菌手术剪、镊子、试剂勺；d）均质器或无菌乳钵；e）离心机：3000 rpm、14000 rpmf）厌氧培养装置；g）恒温培养箱：35℃±1℃、28℃±1℃；h）恒温水浴箱：37℃±1℃、60℃±1℃、80℃±1℃；i）显微镜：10倍×100倍j）PCR仪；k）电泳仪或毛细管电泳仪；l）凝胶成像系统或紫外检测仪；m）核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计；n）可调微量移液器：0.2µL～2µL、2µL～20µL、20µL～200µL、100µL～1000µL；o）无菌吸管：1.0mL、10.0 mL、25 .0mL；p）无菌锥形瓶：100 mL；q）培养皿：直径90mm；r）离心管：50mL、1.5mL；s）PCR反应管；t）无菌注射器：1.0mL；u）小鼠：15g～20g，每一批次试验应使用同一品系的KM或ICR小鼠。
3 培养基和试剂除另有规定外，PCR试验所用试剂为分析纯或符合生化试剂标准，水应符合GB/T6682中一级水的规格。
3.1 庖肉培养基：见附录A中A.1。
3.2 胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉汤（TPGYT）：见附录A中A.2。
3.3 卵黄琼脂培养基：见附录A中A.3。
3.4 明胶磷酸盐缓冲液：见附录A中A.4。
3.5 革兰氏染色液：见附录A中A.5。
3.6 10%胰蛋白酶溶液：见附录A中A.6。
食品中的致病菌检测
食品中的致病菌检测食品安全一直是人们关注的焦点，而其中，致病菌的检测是保障食品安全的重要环节之一。
致病菌的存在可能导致食物中毒等严重后果，因此，食品生产和销售环节对致病菌的检测非常重视。
一、致病菌的常见类型食品中的致病菌种类繁多，常见的包括大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌等。
这些菌种在食品中的存在和繁殖可能导致食物中毒，对人体健康造成威胁。
二、致病菌检测的重要性1. 保障人体健康致病菌检测可以及时发现食品中的致病菌，防止其进入人体，减少食物中毒的发生，保障人体健康。
2. 降低食品安全风险通过致病菌检测，可以及时发现并淘汰存在问题的食品，降低食品安全风险，提高食品质量。
3. 维护食品生产经营者声誉食品生产经营者对食品安全负有法律和道德责任。
通过致病菌检测，可以更好地控制食品的质量，降低面临的法律风险，并保持良好的声誉。
三、常见的致病菌检测方法1. 快速检测方法快速检测方法主要包括PCR技术、免疫学方法等。
这些方法具有操作简便、检测速度快的特点，可以迅速确定食品中是否存在致病菌。
2. 传统检测方法传统的致病菌检测方法包括培养方法、生化方法等。
这些方法需要较长时间进行培养和分析，但其结果准确可靠，被广泛运用于食品行业。
3. 进口食品的检测对于进口食品，通常需要进行更加严格的致病菌检测。
相关部门会对进口食品进行抽样检测，并进行详细的化验，以确保进口食品的质量安全。
四、致病菌检测的挑战与前景1. 检测方法的不断创新随着科技的发展，致病菌检测方法也在不断创新。
例如，近年来，利用基因测序技术进行检测逐渐成为趋势，其可以快速准确地鉴定致病菌的种类和特性。
2. 食品链追溯的完善食品链追溯体系的完善可以帮助快速找出食品中的致病菌来源，减少食品中毒事件发生的可能性，提高人们对食品安全的信任度。
3. 国家层面监管力度的加强近年来，国家层面对食品安全的监管力度不断加强。
加强对食品生产和销售环节的监管，提高对致病菌检测的要求，有助于构建更加安全的食品生产和供应体系。
肉毒梭菌及其毒素检验
肉毒梭菌及其毒素检验
检验方法（GB4789.12）
肉毒毒素 检验
肉毒梭菌 检出
分离 培养
结果 报告
《动物检疫检验技术专业教学资源库》
肉毒梭菌及其毒素检验
（一）肉毒毒素检验
1
样品的处理
2
检出试验
3
确证试验
4
毒力测定
5
定型试验
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肉毒梭菌及其毒素检验
1.样品的处理
液体检样可直接离心，固体或半流动检样须加适量（例 如等量、倍量或5倍量、10倍量）明胶磷酸盐缓冲液，浸 泡、研碎，然后，取上清液进行检测。
血液琼脂：菌落周围有溶血区。
血液琼脂
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肉毒梭菌及其毒素检验
培养特性： 普通琼脂：形成灰白色、半透明、边缘不整齐。呈绒毛网
状、向外扩散的菌落。直径约为3～5mm。 肉渣肉汤：呈均匀混浊生长，肉渣可被A、B和F型菌消化溶
解成烂泥状，并发黑，产生腐败恶臭味，从第三天起，菌体 下沉，肉汤变清。在肉渣培养基和半固体培养基，大量产气。
肉毒梭菌产生的毒素是一种神经毒素，是目前已知的化学毒物与生物毒素中毒性 最强的一种，对人的致死量为10-9mg/Kg体重。其毒力比氰化钾还要大一万倍。
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肉毒梭菌及其毒素检验
二、致病性
肉毒毒素是一种与神经亲和力较强的毒素，肉毒毒素经肠道吸收后， 作用于外周神经肌肉接头，植物神经末梢以及颅脑神经核，毒素能阻 止乙酰胆碱的释放，导致肌肉麻痹和神经功能不全。在临床上表现以 中枢神经系统中毒症状为主，肉毒毒素中毒潜伏期长短不一，短者2小 时，长者可达数天，一般为12～24小时。中毒症状，早期为瞳孔放大 、明显无力、虚弱、晕眩，继而出现视觉不清和雾视，愈来愈感到说 话和吞噬困难，通常还可见到呼吸困难，体温一般正常，胃肠道症状 不明显。病程一般为2～3天，也有的长达2周之久。肉毒中毒死亡率较 高，据报导可达30%～50%，死亡主要是由于呼吸麻痹及心肌痪瘫。如 早期使用型特异或多价抗血清治疗，死亡率可降至10%～15%。
常见致病菌导致的食物中毒及其检测
对肉毒梭菌的检测，首先在固体培养基层的表面上，当肉毒梭菌长到3cm时，菌落呈半透明状，表面出现颗粒状，边缘部分界限不明显，在整个过程中呈现出一种扩散状，常常在扩散之后就形成菌苔。在血平板上，出现了与菌落等大或者是较大的融血环，在乳糖的平板上，形成上下两层的分化，在最底层形成基层的溶蚀，在菌落下部形成层层叠叠的薄层，在周围形成一定的透明环。
由沙门氏菌引发的疾病其主要症状为恶心、呕吐、腹泻、腹痛、发热等。急性腹泻以黄色或黄绿色水样便为主，有恶臭。重者可引起痉挛、脱水、休克甚至死亡，多见于老人、婴儿和体弱者。其潜伏期一般为6～48小时。如果患者免疫力低下且症状严重者，可导致脑膜炎、骨髓炎、胆囊炎、心内膜炎等多种器官炎症。
造成沙门氏菌引起食物中毒的必要条件是食品中的细菌已经繁殖到了相当数量。对于较轻患者可采用支持疗法，不推荐使用抗菌药物；重者则需要使用抗菌药物治疗，同时进行对症治疗。
沙门氏菌的宿主特异性极弱，既可感染动物也可感染人类，极易引起人类的食物中毒。其致病性最强的是猪霍乱沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌与肠炎沙门氏菌。
沙门氏菌按照其传染范围可分为以下三种类型。其一是能引起人类疾病，例如伤寒沙门氏菌，它们是引起肠热症的人类伤寒、副伤寒的病原菌；其二是引起动物疾病，例如牛流产沙门氏菌；其三是引发人、动物疾病，例如猪霍乱沙门氏菌和如鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌。无论是引发人类疾病还是使动物致病，其中毒病症各不相同，一般可分为霍乱型、感冒型、中毒是指细菌在食物内生长繁殖达到一定数量，进而产生毒素再引发食物中毒的过程。它主要由肉毒梭菌引起。
肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，有鞭毛，呈梭状，能运动，其最适宜温度是37摄氏度，PH值为6-8，属于中温性芽孢菌。肉毒梭菌生长时可产生一种强力的毒素抑制呼吸导致死亡，这也是迄今为止所知的最毒的自然生成的毒素之一。肉毒梭菌在120摄氏度高压蒸汽下5-10分钟才能将其杀死。
食品中肉毒杆菌检测
食品中肉毒杆菌检测中国科学院广州化学研究所分析测试中心卿工--189--3394--6343肉毒梭菌是一种生长在缺氧环境下的致病菌，全称肉毒梭状杆菌，在罐头食品及密封腌渍食物中具有极强的生存能力，它在繁殖过程中所分泌的肉毒毒素具有极强的毒性，是KCN毒性的一万倍。
纯化结晶的肉毒毒素1mg能杀死2亿只小鼠，对人的致死剂量约0.1μg。
它通过阻断人体神经接头，导致全身麻痹、瘫痪，严重时能引起人呼吸肌麻痹，导致无法呼吸，最终死亡。
目前报道新西兰恒天然浓缩乳清蛋白粉大批量被肉毒梭菌污染，多家产品被卷入其中。
食品中肉毒梭菌检测(PCR检测方法)一、实验原理本中心结合国标GB/T4789.12-2003食品中卫生微生物学检验肉毒梭菌及内毒素检验和SN/T2525-2010食品中肉毒梭菌的PCR检测方法对食品中肉毒杆菌进行检验。
将样品经增菌后划平板分离单菌落，挑取可疑菌落到胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤(TPGY)培养基培养，对培养物用DNA提取试剂盒抽提DNA，进行PCR扩增，用琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物中是否含有肉毒梭菌的的特征条带，从而对食品中是否污染肉毒梭菌进行快速检测。
二、仪器和试剂Heraeus Multifuge X1R高速台式冷冻离心机，Bio-RAD ALS1296PCR仪器，Tanon-3500凝胶成像分析系统，YQX-Ⅱ厌氧培养箱，恒温水浴锅。
三、试验方法1、样品的增菌培养取庖肉培养基2管和TPGY培养基2管，煮沸10min~15min（为了排除溶解于培养基中的氧，切勿摇动），迅速冷却。
每15ml培养基中接种1g~2g固体食品或1ml~2ml液体食品（缓慢地将接种物接入肉汤液面下）。
将样品接种2管庖肉培养基（35±1℃下培养）和2管TPGY培养基（28±1℃下培养），均厌氧培养5天。
观察培养物的浊度、产气、肉粒的消化和产生的气味。
若有生长继续以下操作，若无生长，则继续培养10天。
肉毒梭状芽孢杆菌检测
• 介绍 • 检测方法 • 检测标准与法规 • 案例分析 • 结论
01
介绍
肉毒梭状芽孢杆菌简介
肉毒梭状芽孢杆菌是一种革兰氏 阳性菌，属于梭状芽孢杆菌属， 能产生肉毒素，是引起食物中毒
的主要原因之一。
该菌在土壤、动物和人类中都有 可能出现，在厌氧条件下生长良
好。
肉毒梭状芽孢杆菌可产生A型、 B型、E型和F型四种毒素，其中 A型和B型毒素对人类具有高度
毒性。
肉毒梭状芽孢杆菌的危害
肉毒梭状芽孢杆菌产生的毒素可引起 食物中毒，导致肌肉麻痹、呼吸困难 等症状，严重时可致人死亡。
肉毒梭状芽孢杆菌引起的食物中毒具 有起病急、病情重、病死率高的特点 ，对人类健康构成严重威胁。
肉毒梭状芽孢杆菌检测的重要性
及时检测肉毒梭状芽孢杆菌可有效预防食物中毒 的发生，保护消费者健康。
03
利用生物传感器对肉毒毒素进行实时、快速、高灵敏度的检测。
基因检测方法
聚合酶链式反应（PCR）
通过扩增肉毒梭状芽孢杆菌的特异性基因片段进行检测，具有高 特异性和灵敏度。
基因芯片技术
利用芯片上固定的探针与样品中的基因片段进行杂交，实现快速、 高通量的检测。
下一代测序技术（NGS）
对可疑样品进行全基因组测序，能够检测出肉毒梭状芽孢杆菌的同 时，提供菌株的基因型和耐药性等信息。
通过检测可追溯污染源头，有效控制食品安全风 险，防止疫情扩散。
检测肉毒梭状芽孢杆菌还可评估食品生产过程的 卫生状况，提高食品安全监管水平。
02
检测方法
传统检测方法
分离培养
将可疑样品接种在选择性培养基上，观察是否有 肉毒梭状芽孢杆菌的生长。
毒素检测
肉毒梭菌及肉毒毒素检验
七）肉毒中毒
1、流行病学
肉毒梭菌食物中毒又叫做肉毒中毒，是由于人们因误食了被肉毒
梭菌污染，并在其中繁殖过程中所产生的外毒素所致。
引起肉毒中毒的食品，因饮食习惯和膳食结构不同而有差别。 日本发生的肉毒素主要由鱼类、鱼卵等水产品所引起。其中家庭
自制食品引起者占93％，市售食品引起者占5.4％。美国发生的肉毒
中毒主要由家庭自制的蔬菜、水果罐头、水产品和肉、奶类制品所 引起。其中家庭自制食品占72％，市售商品引起者占9.0％。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
我国发生的肉毒中毒，91.48％由植物性食品所引起，8.52％
由动物性食品所引起。
在植物性食品中，绝大部分是家庭自制的发酵食品，例如臭
豆腐、豆豉、豆酱和制造面酱的一种中间产物，即“米送糊糊” 等。这些发酵食品所用的原料粮和豆类常带有肉毒梭菌，发酵 过程往往在密闭容器中和高温环境下进行。由于加热时间短， 未能杀灭肉毒梭菌芽胞，又在20℃-30℃进行发酵，所以为芽 胞生长繁殖并产生毒素提供了适宜条件，如食品不经加热，即 可引起中毒。
（六）致病性
肉毒梭菌致病的物质基础，是它产生的强烈外毒素——肉 毒素，是目前所知的最强烈的细菌外毒素。提纯的外毒素 1mg含有三亿个小白鼠的半数致病量，毒素作用于神经系统， 引起运动神经麻痹而致病。引起人类食物中毒的主要为A、B、 E三型（见表6—30所致疾病一栏），F型亦可引起人类的毒 血症，E型肉毒素，可被胰酶激活而毒力增强。 人工感染细菌全培养物、细菌的滤液、含毒素的送检材料， 均可使小白鼠或脉鼠发病死亡，兔、猫、犬的易感性较低。
粗大杆菌，其大小为（4-6）µ m×（0.9-1.2） µ m，
两端钝圆，一般单个存在，偶有成对或成短链状，无 荚膜。周身有4~8根周毛，能运动。芽胞呈卵圆形， 大于菌体，位于菌体次末端，使细菌呈匙形或网球拍 状。在老龄培养物上呈革兰氏阴性。
致病菌相关
食品安全事故常见致病因子的临床表现、潜伏期及生物标本采集要求一般为10~20 分钟由腌制不当或变质蔬菜引起的中毒一般为1~3 小时，最长可达20 小时口唇、耳廓、舌及指(趾)甲、皮肤黏膜等出现不同程度发绀，可伴有头晕、头痛、乏力、恶心、呕吐；中毒明显者可出现心悸、胸闷、呼吸困难、视物模糊等症状；严重者可出现嗜睡、血压下降、心律失常，甚至休克、昏迷、抽搐、呼吸衰竭亚硝酸盐血液定，采样量约10ml，抗凝剂以肝素为佳，禁用草酸盐，应冷藏保存，如长时间运输，可冷冻呕吐物胃内容物采样量50g~100g，使用具塞玻璃瓶或聚乙烯瓶密闭盛放应冷藏保存，保存和运输条件同上尿液采样量300ml~500ml，使用具塞玻璃瓶或聚乙烯瓶盛放，保存和运输条件同上1~6 小时（平均2~4 小时）恶心，剧烈地反复呕吐，腹痛，腹泻金黄色葡萄球菌及其肠毒素粪便或肛拭子新鲜粪5g，置于无菌、干燥、防漏的容器内。
或采样拭子沾满粪便插入Cary—Blair运送培养基1，冷藏运送至实验室呕吐物采取呕吐物置无菌采样瓶或采样袋密封送检, 冷藏运送至实验室皮肤病变拭子鼻拭子采样拭子插入Cary—Blair运送培养基1内保存，冷藏运送至实验室0.5~5小时以恶心、呕吐为主，并有头晕、四肢无力蜡样芽孢杆菌（呕吐型）粪便或肛拭子新鲜粪便5g，置于无菌、干燥、防漏的容器内。
或用采样拭子沾满粪便插入Cary—Blair运送培养基1内保存，冷藏运送至实验室4~24小时恶心、呕吐、轻微腹泻、头晕、全身无力，严重者出现黄疸、肝肿大、皮下出血、血尿、少尿、意识不清、烦躁不安、惊厥、抽搐、休克；一般无发热椰毒假单胞菌酵米面亚种（米酵菌酸）粪便或肛拭子新鲜粪便5g，置于无菌、干燥、防漏的容器内。
或用采样拭子沾满粪便插入Cary—Blair运送培养基1内保存，冷藏运送至实验室呕吐物采取呕吐物置无菌采样瓶或采样袋密封送检, 冷藏运送至实验室12~48 小时（中位36 小时）恶心，呕吐，水样无血腹泻，脱水诺如病毒粪便或肛拭子、呕吐物新鲜粪便10g（10ml）或呕吐物，置于无菌、干燥、防漏的容器内。
食品中致病菌的检验
3060min
1d
恶心呕吐腹痛腹泻
食品学院
第一节 食品中肠道致病杆菌的检验
一、沙门氏菌检验
沙门氏菌属是一群形态和培养特性都类似的肠杆菌科中的一 个大属，也是肠杆菌科中最重要的病原菌属，它包括2000多个 血清型。 沙门氏菌病常在动物中广泛传播，人的沙门氏菌感染和带菌 也非常普通。由于动物的生前感染或食品受到污染，均可使人 发生食物中毒。 世界各地的食物中毒中，沙门氏菌食物中毒常占首位或第二 位。沙门氏菌常作为进出口食品和其他食品的致病菌指标。因 此，检查食品中的沙门氏菌极为重要。
食品学院
沙门氏菌最适生长温度为35℃～37℃， 10h～42h能生长，最适生长pH为7.2～7.4。 在培养基中若加入硫代硫酸钠、胱氨酸、血 清、葡萄糖、淀粉、脑心浸液、胶体硫或甘油 等，均有助于本菌的生长。
食品学院
沙门氏菌属按其生化特性，可分为Ⅰ、 Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ五个亚属，其中亚属Ⅲ又 称为亚利桑那菌，它们在亚硫酸铅琼脂、 DHL琼脂、HE琼脂和SS琼脂平板上培养 特性各不相同。
食品学院
O抗原很稳定，能耐热100℃达数小时。 O抗原含有许多不同的多糖成分，分别以1， 2，3…等阿拉伯数字表示，例如：甲型伤寒 沙门氏菌的Ｏ抗原有1、2、12；猪霍乱沙 门氏菌的O抗原有6、7。
食品学院
致病菌检测
致病菌检测
2.17检测方法检测标准
致病菌（Pathogenic bacteria)能引起疾病的微生物称为病原微生物或致病菌。
病原微生物包括细菌、病毒、螺旋体、立克次氏体、衣原体、支原体、真菌及放线菌等。
一般所说的致病菌指的是病原微生物中的细菌。
细菌的致病性与其毒力、侵入数量及侵入门户有关。
虽然绝大多数细菌是无害甚至有益的，但是相当大一部分可以致病。
条件致病菌只在特定条件下致病，如有伤口可以允许细菌进入血液，或者免疫力降低时。
例如，金黄色葡萄球菌和链球菌也是正常菌群，常可以存在于体表皮肤，鼻腔而不引起疾病，但可以潜在引起皮肤感染，肺炎（pneumonia），脑膜炎（meningitis）败血症（sepsis)
常见的致病菌有：葡萄球菌、链球菌、结核菌、炭疽芽孢杆菌、鼠疫杆菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌、幽门螺杆菌、李斯特菌、痢疾杆菌、结核分枝杆菌、
检测项目：致病性检测、形态检测、分离和生化试验
检测标准：GB4789.4-2010（09）。
肉毒梭菌及其毒素检验
－－A、B型肉毒梭菌生长旺盛，而且表面浑浊，产大量气 体，底有粉状或颗粒状沉淀，并能消化肉块，变黑有臭味。
4.2 卵黄琼脂培养基：GB／T 4789.28--2003中4.68
含葡萄糖和卵黄 －－鉴别培养
本菌含脂肪酶，分解脂肪，产生 甘油，使菌落及其周围表面覆盖 着特有的彩虹样(或珍珠层样)薄 层
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2、菌体和毒素生物学特性
1）形态及染色
形态：肉毒梭菌为专性厌氧性G+周身鞭毛 网球拍样梭状芽孢大杆菌.
大小:(4—6)μm X(0.9—1.2) μm 形状：两端钝圆，有芽胞，周身4—8根鞭毛，无荚膜。 芽孢：卵圆形大于菌体，位于菌体次末端，使细菌
呈匙形或网球拍状。 排列：一般单个存在，偶有成对或成短链状。 染色： G+
医学上利用麻痹肉毒素美容、治肌肉痉挛性收缩病症。
/i?ct=503316学4习8文0&档z=&tn
www.cho-obgy.co.kr
http://neurobtx.blog.so学hu习.文c档om/107783323.html
各型肉毒梭菌毒素为对人兽的致病情况及所通过的主要媒介
观察4d 部凹陷，宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。 小鼠猝死：以至症状不明显时，则可将注射液做适当稀释， 重做试验。
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（2）确证试验：取致死样上清液分成三份
上清液＋等量多型抗毒素血清－混匀－37℃，30min －－ 0.5mL接种小鼠
剧毒神经麻痹外毒素(又称肉毒毒素),引起以神经麻痹为主要
症状且很高死亡率的食物中毒(又称肉毒中毒)。
厌氧菌鉴定—肉毒梭菌(微生物检验课件)
状菌体 ▪ 严格厌氧，普通平板生长R型菌落，可消化肉渣，变黑腐败 ▪ 抵抗力
▪ 芽胞强，100℃3-5h，180 ℃5-15min ▪ 肉毒毒素：不耐热，100 ℃1min破坏
耐酸，胃酸24h不破坏
致病性
▪ 致病物质——肉毒毒素:是一种强烈的神经外毒素，是目前已 知毒素中毒力最强者，对人的致死剂量是0.1μg。
▪ 肉毒毒素作用机制（嗜神经毒素） ▪ 作用部位
—脑神经核 —外周神经—肌肉神经接头处 阻止乙酰胆碱的释放 —自主神经末梢 →运动神经末梢功能失调→肌肉松弛性麻痹（软瘫）
❖ 所致疾病
毒素性食物中毒（肉毒中毒） 食品：罐头、香肠、腊肠、发酵豆制品
潜伏期短 临床表现
❖无胃肠道症状，为神经末梢麻痹症状、乏力、头痛 ❖眼肌（复视、斜视、眼睑下垂） ❖喉肌（吞咽困难、咀嚼不灵、语言障碍） ❖膈肌（呼吸困难、死亡率高20-70%）
微生物学检查与防治
❖ 检测毒素——动物试验 ❖ 加强相关食品的卫生监督和管理，发病后尽早注射肉毒多价
抗毒素
肉毒素美容
❖ 肉毒素可以阻断神经与肌肉间的神经冲动，使过度收缩的小 肌肉放松，进而达到除皱的效果。或者是利用其可以暂时麻 痹肌肉的特性，使肌肉因失去功能而萎缩，来达到雕塑线条 的目的，也就是通常所说的去皱和瘦脸。
肉毒梭菌及肉毒毒素检验
6 操作步骤
• 6.1 肉毒毒素检测 液状检样可直接离心，固体或半流动检样须
加适量(例如等量、倍量或5倍量、10倍量)明胶磷 酸盐缓冲液，浸泡、研碎，然后离心，取上清液 进行检测。
另取一部分上清液，调pH6.2，每9份加10% 胰酶(活力1：250)水溶液1份，混匀，经常轻轻搅 动，37℃作用60min，进行检测。
• 6.3.1 毒素检测：试验方法同4.1。 6.3.2 培养特性检查：接种卵黄琼脂
平板，分成2份，分别在35℃的需氧和厌氧 条件下培养48h，观察生长情况及菌落形态。 肉毒梭菌只有在厌氧条件下才能在卵黄琼
型菌之外，其它各型菌的分布都是相当广泛的。
2.3.2肉毒毒素流行病学
• 肉毒中毒是由于误食含有肉毒毒素的食品而引起的纯粹的 细菌毒素食物中毒。人的肉毒中毒发生并不多，但是发病 急、病程发展快、病死率高。肉毒中毒是毒素中毒，潜伏 期较短，一般为6至36小时，最长60小时。主要症状有： 视力减弱、全身无力、伸舌和张口困难、抬头费力、瞳孔 散大、呼吸麻痹等。
常扩散成菌苔。在血平板上，出现与菌落几乎等大或者较大的溶血环。在乳
糖卵黄牛奶平板上，菌落下培养基为乳浊，菌落表面及周围形成彩虹薄层，
不分解乳糖；分解蛋白的菌株，菌落周围出现透明环。
•
肉毒梭菌发育最适温度为25-35℃，培养基的最适的酸硷度为pH6.0-8.2。
•
肉毒梭菌的生化性状很不规律，即使同性，也常见到株间的差异。（见
表1）
表1 各型肉毒梭菌的生化反应
型别 反应
葡萄糖发酵 麦芽糖发酵 乳糖发酵 蔗糖发酵 靛基质产生 胆胶液化 牛奶消化
A
＋ ＋ － （±） － （＋） ＋
B
C
D
肉毒梭菌(Clostridium botalinum)毒素的形成
第十三章肉毒梭菌（Clostridium botalinum）毒素的形成（生物危害）本指南代表了美国食品药品管理局（FDA）在这一领域的最新思考。
它没有赋予任何人任何权利，也没有束缚FDA或公众。
如果有其他方法满足了应适用的法律及法规的要求，您可以选择该替代方法。
若您想讨论其他的替代方法，请联系负责实施本指南的FDA工作人员。
若您无法确定合适的FDA工作人员，请拨打列于本指南首页的电话号码。
了解潜在危害肉毒梭菌毒素（C. botalinum）的形成能使消费者发病和死亡。
这都是由于肉毒梭菌毒素的原因。
在美国，考虑所有来源，每年大约要暴发10次左右的食物源性肉毒梭菌中毒。
症状包括：虚弱，头晕，视力重影，说话、吞咽及呼吸困难，腹部胀痛，便秘，瘫痪甚至死亡。
在食用18到36小时内，可出现以上症状。
每个人都会受到肉毒梭菌毒素的影响。
只有几微克的毒素便可导致一个健康成年人的疾病。
死亡率高；没有抗毒素和呼吸帮助的话，极可能发生死亡。
这一章讲述在加工、贮存以及分销过程中由于时间/温度控制不当会导致肉毒梭菌生长和产生毒素。
控制致病菌生长策略在鱼类和水产品中，有众多的控制致病菌生长的策略，包括：·控制产品（见酸化食品法规，21 CFR 114，对耐贮存酸化产品，及本章中冷冻酸化产品）中的酸度（pH值）；·控制产品中盐或防腐剂的数量，例如亚硝酸盐（见本章）；·通过计算，控制产品中有利于致病菌生长（水活性）的水分含量（见本章）；·通过干燥，控制产品中有利于致病菌生长（水活性）的水份含量（见14章）；·控制经巴氏杀菌工艺后和经蒸煮后立即进行减少氧气包装之前致病菌的介入（见18章）；·控制软体贝类源头和空气中暴露的时间（例如通过收获或退潮）来冻结控制收获区域的致病菌（见14章）；·管理好食品暴露在容易使致病菌生长和毒素产生的温度下的次数（普遍见于12章；肉毒梭菌，见本章；水合物中金黄色葡萄球菌，见15章）；221·通过蒸煮或巴氏杀菌（见16章）或干馏（见低酸食品包装于密封容器条例中的热加工，21CFR113，（以下简称低酸罐头食品（LACF）条例））杀灭致病菌；·通过加工保留原产品特性（见17章）杀死致病菌；·肉毒梭菌（C. botalinum）毒素的形成。
肉毒芽孢杆菌的检验
样品制备 检出 肉毒毒素检测 实验 确证实验 毒力测定 定型试验
样品处理 增菌培养 分离培4——6h内死亡，而且98%—— 99%的小白鼠会在12h内死亡，因此，实验前24h内的观察是非常重 要的。 2)24h后的死亡是可疑的，除非有典型症状出现。 3）如果小白鼠注射经1：2或1：5倍数稀释的样品后死亡，但注射 更高稀释度的样品后未死亡，这也是非常可疑的现象，一般为非特 异性死亡。 4）小白鼠要用不会抹去的染料加以标记。 5）小白鼠的饲料与水必须及时添加，充分供应。 6）食物中发现毒素，表明未经充分的加热处理，可能引起肉毒中 毒。 7）检出肉毒梭菌，但未检出肉毒毒素，不能证明此食物会引起肉 毒中毒。
8）肉毒中毒的诊断必须以检出食物中的肉毒毒素为准。
9）中和试验可以为毒素定型。
三 肉毒毒素是一种神经毒素，能 透过机体各部的粘膜。肉毒毒 素由胃肠道吸收后，经淋巴和 血行扩散，作用于颅脑神经核 和外周神经肌肉接头以及植物 神经末梢，阻碍乙酰胆碱释放 ，影响神经冲动的传递，导致 肌肉的松弛性麻痹。
的
显微 镜下
肉毒 杆菌
样品（食品）
消毒检测 报告（一） 毒素检测
增菌、产毒培养30度5天
一 肉毒杆菌是一种生长在缺氧环境下的细菌，在 罐头食品及密封腌渍食物中具有极强的生存能 力，是目前毒性最强的毒素之一。肉毒杆菌是 一种致命病菌，在繁殖过程中分泌毒素，是毒 性最强的蛋白质之一。军队常常将这种毒素用 于生化武器。人们食入和吸收这种毒素后，神 经系统将遭到破坏，出现头晕、呼吸困难和肌 肉乏力等症状。
二 肉毒棱菌（cl.botulinum）为腐物寄生菌， 广泛分布于土壤和动物粪便中。革兰氏阳 性粗大杆菌。单独或成双排列，有时可见 短链状。有周身鞭毛，无荚膜。芽胞椭圆 形，大于菌体，位于次极端，使菌体似网 球拍状，芽胞抵抗力甚强。严格厌氧，在 普通琼脂培养基上形成直径3～5mm不规 则的菌落，血液琼脂平板上有β溶血。能 消化肉渣，使之变黑，有腐败恶臭。分解 葡萄糖、麦芽糖及果糖，产酸产气。液化 明胶，产生hzs，不形成吲哚。
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三、检验方法
1、检验标准：GB 4789.12-2003
2、培养基和试剂 培养基： 庖肉培养基、卵黄琼脂培养基、明胶磷酸盐缓冲液。 试剂： 肉毒分型抗毒诊断血清、胰酶（活力1:250）、革兰 氏染色液。 另需实验动Байду номын сангаас（小白鼠）。
3、检验程序
①报告(一)：检样中有无肉毒毒素以
及有何型肉毒毒素。(如仅为了肉毒中 毒诊断，即可结束检验) ②报告(二)：对增菌产毒培养物，一
2、培养特性
最严格的厌氧菌 生长最适温度：28 ℃ ～37 ℃ ：pH为6.8~7.6，产毒的最适pH为7.8 ~8.2。 产毒培养温度：不同菌型产毒的最适培养温度不完全相同。C、D型 温度高些为宜，35℃ 培养3d即可，而E型菌低温度长时间培养效果较好。 对营养要求不高 ：在普通培养基上都能生长。
致病菌检验——
肉毒梭菌
肉毒梭状芽孢杆菌检验
一、肉毒梭状芽孢杆菌的生物学特性 1、形态与染色 肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，革兰氏染色阳性， 约为4×1μm的大杆菌， 多单在，偶见成双或短链，两侧平行， 两端钝圆，直杆状或稍弯曲，芽胞为卵圆形，大于菌体宽度， 位于次极端，使菌体呈匙形或网球拍状，偶有位于中央，常 见很多游离芽胞。 有4~8根周生鞭毛，运动迟缓，无荚膜。
中毒方式
• 食物媒介 • 吸入：极罕见的中毒类型 • 创伤感染：肉毒梭菌污染创伤部位，在局 部发芽繁殖，产生毒素，引起肉毒中毒。 • 肠道感染：根据肉毒梭菌能否在肠道内产 毒而引起人的都读中毒。
临床症状
• 肉毒中毒的潜伏期短着仅2h，长者可达10 天左右，通常约12-18h • 前期症状可能出现头昏、头痛、恶心、甚 至呕吐、腹泻等。 • 基本属于神经麻痹表现，最早是视觉障碍， 继而全身无力、呛噎、眼睑下垂、伸舌和 张口困难、抬头费力、瞳孔散大、咀嚼障 碍、不能下咽、胸内烦闷、有恐惧感、重 者晚期呼吸困难，最后死于呼吸麻痹。
（1）毒素检测：试验方法同上。 （2）培养特性检查：接种卵黄琼脂平板 ，分成两份，分别在35℃的需氧和厌氧 条件下培养48 h，观察生长情况及菌落 形态。肉毒梭菌只在厌氧条件下生长而 在需氧条件下不生长。
4、结果报告
报告(一)：检样含有某型肉毒毒素。 报告(二)：检样含有某型肉毒梭菌。 报告(三)：由样品分离的菌株为某型肉毒梭菌。 肉毒梭菌检验目标主要是毒素，不论食品中的肉毒毒素 检验还是肉毒梭菌检验，均以毒素的检测及定型试验为判定 的主要依据。
定型试验
（2）肉毒梭菌的检出（增菌产毒培养试验）
取庖肉培养基五支，煮沸10min～15min，做如下处理：
第一支：急速冷却，接种检样均质液1 mL～2 mL；
第二支：冷却至60℃，接种检样，继续于60℃保温10 min，急速冷却； 第三支：接种检样，继续煮沸加热10 min，急速冷却。 以上3支试管于30℃厌氧培养5d，若无生长，可再培养10d。培养到期，若 有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同上，阳性结 果证明检样中有肉毒梭菌存在。
（3）、分离培养
选取证实含有肉毒毒素的增菌产毒培养物（必要时可重复一次适宜 的加热处理）接种卵黄琼脂平板，35℃厌氧培养48 h 。肉毒梭菌在卵黄 琼脂平板上生长时，菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样 (或珍珠 层样)薄层，但G型菌无此现象。 根据菌落形态及菌体形态挑取可疑菌落，接种庖肉培养基，于30℃ 培养5d，进行毒素检测及培养特性检查确证试验。
二、肉毒梭菌的致病性
肉毒梭菌能产生外毒素即肉毒毒素（大分子蛋白），根据 毒素的抗原特异性将其分为A、B、C （1、2） 、D、E、F、 G七个型别。与毒素型别相对应，肉毒梭菌也分为同样的七个 型别。其中A、B、E、F四型毒素对人有不同程度的致病性。 A型毒素经60℃ 2分钟加热，差不多能被完全破坏，而B、 E二型毒素要经70℃ 2分钟才能被破坏；C、D二型毒素对热的 抵抗更大些；C型毒素要经过90℃2分钟加热才能完全破坏，不 论如何，只要煮沸1分钟或75℃加热5~10分钟，毒素都能被完 全破坏。肉毒毒素对酸性反应比较稳定，对碱性反应比较敏感。 某些型的肉毒毒素在适宜条件下，毒性能被胰酶激活和加强。
在固体培养基表面上，形成类圆形， 边缘不整齐，约3毫米左右的菌落。菌落 半透明，表面一般比较光滑也有的呈颗粒 状，界线不明显，向外扩散。呈绒毛网状， 常常扩散成菌苔。
肉毒梭状芽孢杆菌菌落
3、肉毒梭菌的生化特性
肉毒梭菌的生化性状很不规律，即使同型，也常见到株 间的差异。
表1 各型肉毒梭菌的生化反应
报告 （一）
毒素检测
观察生长性状， 染色镜检 报告（二）
分离培养
增菌产毒培养 30℃，5 d
观察菌落性状 染色镜检
毒素检测
培养检查
特殊需要例外）
报告（三）
（1）、肉毒毒素检测
液态或固体样品经过适当处理后离心，取上清液实验
上清液及其胰酶激活处理液
分别进行小白鼠腹腔注射，各3只，每只0.5 mL，观察4 d 注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24 h内发病、死亡。 确证试验 毒力测定
毒素检测
检 样
增菌、产毒培养 30℃，5 d
方面做生长特性观察，同时检测肉毒
毒素。报告检样中有无肉毒梭菌以及 有何型肉毒梭菌。（有些样品如土壤、 泥沙等基本上不可能含有毒素，则应 从培养着手） ③报告(三)：欲获纯菌株，可用增菌 产毒培养物进行分离培养，对所得纯 菌株进行形态、培养特性等观察及毒 素检测，其结果可证明所得纯菌为何 型肉毒梭菌。（一般情况下，没有必 要从检样中分离纯的菌株，但研究或
肉毒毒素是一种神经麻痹毒素，主要抑制神经末梢释放乙 酰胆碱，引起肌肉松弛麻痹，特别是呼吸肌麻痹导致死亡。 ������ 肉毒毒素的毒性极强，是目前已知在天然毒素和合成毒剂 中毒性最强的生物毒素，据称，精制毒素1克能杀死400万吨小 白鼠，一个人的致死量大概1微克左右。 肉毒中毒一年四季均可发生。美国以罐头发生中毒较多， 日本以水产品较多；我国以发酵食品（如：臭豆腐、豆瓣酱、 豆豉等）发生中毒较多。