DNS法对食用菌发酵液淀粉酶活力的测定

DNS法对食用菌发酵液淀粉酶活力的测定

摘要选取广泛栽培的著名食用菌香菇、平菇和姬菇菌丝体为研究菌种，采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法检测供试食用菌的淀粉酶产生能力。以2%可溶性淀粉为唯一碳源的查氏液体培养基诱导发酵，供试食用菌产生的淀粉酶活力在1.513~3.417 U/ mL，为食用菌工业发酵菌种的选育提供了参考依据和分析方法。

AbstractEnzyme energy of amylase from edible fungi was determinated based on 3，5-dinitryl-salicyle（DNS）.Taking czapek as induction medtum in whith the only carbon source was 2% soluble starch，and amylase energy ranged from 1.513 to 3.417 U/mL among Lentinula edodes，Pleurotus ostreatus，Pleurotus cornucopiae，so as to put forward a reference and analysis method for the edible fungistrain selection.

Key wordsedible fungi；fermention；DNS；amylase；activity determination

经过人工驯化培养的食用真菌的菌丝体，可以栽培扭结成食药用价值很高的子实体。近年来，人们发现食用真菌菌丝体也可以仿效青霉菌发酵，大规模生产食用菌多糖、抗生素、酶制剂等亟待研发的生物活性物质[1]。食用菌发酵有赖于适宜的工艺条件与生物反应器，但更取决于具工业开发价值的生产菌种的生理性状，其中包括食用菌生产菌种对环境的适应性，归结为食用菌的代谢能力，能够利用廉价原料迅速生长并大量合成目的产物。许多工业发酵菌种不能直接利用淀粉，生物工厂必须对原材料进行预处理，通过液化、糖化生产微生物可以直接利用的淀粉水解糖。如果选育出具有淀粉酶活力的生产菌种，就可以实现边糖化边发酵，可极大地提高生产效率。因此，探讨灵敏而准确的食用菌淀粉酶活力的测定技术，具有重要的生理学意义和实践应用潜力。

淀粉酶活性测定方法较多[2]，但大致分为4类：一是测定底物淀粉的消耗量，有粘度法、浊度法和碘—淀粉比色法等；二是生糖法，测定产物葡萄糖的生成量；三是色原底物分解法；四是酶偶联法。利用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定还原糖含量来反映淀粉酶活力是目前较常采用的方法。此法是用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。该方法测试所用试剂易得，溶液有效期长，且测试精确度高，结果比较可靠。故笔者采用此法来测定供试食用菌产生淀粉酶的活力[3-5]。

1材料与方法

1.1供试材料

香菇（Lentinula edodes）、平菇（Pleurotus ostreatus）和姬菇（Pleurotus

cornucopiae）新鲜子实体购买于超市，取菌柄和菌盖交接处进行组织分离。马铃薯葡萄糖琼脂培养基配方为马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15~20 g，水1 000 mL，pH值自然。27 ℃恒温培养5~6 d，培养基上长满白色丝状菌落，经出菇试验鉴定所得菌株确为香菇、姬菇和平菇。同时，分离酒曲根霉（Rhizopus sp.）平行测定淀粉酶的活力。

1.2发酵液制备

在以2%可溶性淀粉为唯一碳源的查氏（Czapek）[6]液体培养基中分别接种香菇、平菇、姬菇、酒曲根霉，27 ℃恒温摇床培养5~6 d，无菌过滤得食用菌发酵液。供试查氏液体培养基配方修改为：KNO3 2 g，可溶性淀粉20 g，KH2PO4 1 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4 0.01 g，蒸馏水1 000 mL。该培养基与查氏培养基不同之处在于是用可溶性淀粉代替蔗糖作为唯一的可用碳源，以诱导食用菌产生淀粉酶发酵生长。

1.3DNS比色法测定食用菌淀粉酶活力

取2 mL供试食用菌和酒曲根霉的发酵液，加入2 mL 3，5-二硝基水杨酸试剂，置40 ℃水浴中5 min，定容至25 mL于520 nm波长下测吸光度，在以系列梯度浓度的麦芽糖比色反应制备的标准曲线上查出对应的还原糖含量。定义以1 mL的发酵液中的淀粉酶，在40 ℃，1 min生成0.1 mg的还原糖为1个酶活力单位（U）。根据以下公式计算酶活力：

淀粉酶活力=C×7/2×0.1×5（1）

式（1）中，C代表测定的还原糖产生量。每处理10次重复，计算平均值。

2结果与分析

由表1可知，酒曲根霉产生淀粉酶活力最强，达到20.331 U/mL，为评价DNS比色法测定食用菌淀粉酶活力提（上接第16页）

供参考标准。另从酒曲中分离到尚未鉴定的霉菌M1、m?2、M3的淀粉酶活力较弱，表明商品酒曲存在多种功能互补的微生物，协同淀粉的糖化。

3结论与讨论

供试食用菌香菇、平菇和姬菇发酵液产生的淀粉酶活力相对较弱，与酒曲分离霉菌M1、m?2、M3的淀粉酶活力相当。食用菌淀粉酶活力的强弱与试验菌株的来源、遗传组成、发酵的环境条件有关，反映了栽培食用菌发酵淀粉的代谢水平。因此，本研究结果表明：利用3，5-二硝基水杨酸（DNS）比色法测定还原糖含量来反映淀粉酶活力，灵敏准确，结果可靠，适于食用菌产生淀粉酶活力的精确定量，从而科学了解食用菌营养生理习性，为食用菌发酵生产多糖、抗生素、酶制剂等亟待研发的生物活性物质提供工业候选菌种及其检测方法[7-8]。

4参考文献

[1] 梁宗琦.真菌次生代谢产物多样性及其潜在应用价值[J].生物多样性，1999，7（2）：145-150.

[2] 郭勇.酶工程[M].3版.北京：科学出版社，2005.

[3] 王清吉，尹西竹.DNS法测定饲用木聚糖酶活力[J].兽药与饲料添加剂，2000，5（1）：10.

[4] 王琳.DNS法测定纤维素酶活力最适条件研究[J].河南师范大学学报：自然科学版，1998，26（3）：66-69.

[5] 韩德权，章佳佳.DNS法在普鲁兰多糖发酵液中糖测定的研究[J].食品工业科技，2008（2）：285-286.

[6] 沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验[M].北京：高等教育出版社，2004.

[7] 王蕾，郑璞.DNS法定量测定海藻糖的研究[J].食品科技，2004（2）：82-84.

[8] 王俊丽，聂国兴，李素贞，等.DNS法测定还原糖含量时最适波长的确定[J].河南农业科学，2010（1）：115-118.

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文