高效液相分析方法验证
HJ784-2016土壤和沉积物多环芳烃的测定高效液相色谱法方法验证报告
检测分析方法验证报告（验）字〔2022〕第号方法名称：土壤和沉积物多环芳烃的测定液相色谱法HJ 784-2016项目主编单位：验证单位：项目负责人及职称：（检测员）通讯地址：联系方式：报告日期：2022年03月17日土壤和沉积物多环芳烃的测定高效液相色谱法一、适用范围标准HJ 784-2016测定土壤和沉积物中十六种多环芳烃的液液萃取高效液相色谱法。
适用于土壤和沉积物中十六种多环芳烃的测定。
十六种多环芳烃（PAHs）包括：萘、苊、二氢苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、屈、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚并[1,2,3-cd]芘、二苯并[a,h]蒽、苯并[ghi]苝。
当取样量为10.0g，定容体积为1.0ml时，用紫外检测器测定16种多环芳烃的方法检出限为3μg/kg～5μg/kg，测定下限为12μg/kg～20μg/kg。
二、方法原理土壤和沉积物样品中的多环芳烃用合适的萃取方法（索氏提取、加压流体萃取等）提取，根据样品基体干扰情况采取合适的净化方法（硅胶层析柱、硅胶或硅酸镁固相萃取柱等）对萃取液进行净化、浓缩、定容，用配备紫外/荧光检测器的高效液相色谱仪分离检测，以保留时间定性，外标法定量。
三、试剂和材料3.1 乙腈（CH3CN）：HPLC级。
3.2 正己烷（C6H14）：HPLC级。
3.3 二氯甲烷（CH2Cl2）：HPLC级。
3.4 丙酮（CH3COCH3）：HPLC级。
3.5 丙酮-正己烷混合溶液：1+1。
用丙酮和正己烷按1:1的体积比混合。
3.6 二氯甲烷-正己烷混合溶液：2+3。
用二氯甲烷和正己烷按2:3的体积比混合。
3.7 二氯甲烷-正己烷混合溶液：1+1。
用二氯甲烷和正己烷按1:1的体积比混合。
3.8 干燥剂：无水硫酸钠（Na2SO4）或粒状硅藻土置于马弗炉中400℃烘4h，冷却后置于磨口玻璃瓶中密封保存。
3.9 硅胶：粒径75μm～150μm（200目～100目）。
HJ587-2010 水质阿特拉津的测定 高效液相色谱法方法验证
方法验证报告项目名称：水质阿特拉津的测定方法名称：《HJ587-2010水质阿特拉津的测定高效液相色谱法》报告编写人：参加人员：审核人员：报告日期：1实验室基本情况1.1人员情况实验室检测人员已通过《HJ587-2010水质阿特拉津的测定高效液相色谱法》的培训，熟知标准内容、检测方法及样品数据采集和处理等，考核合格，得到公司技术负责人授权上岗。
1-1参加验证的人员情况登记表姓名性别年龄职务或职称所学专业从事相关分析工作年限1.2检测仪器/设备情况设备编号设备名称规格型号计量/检定状态不确定度液相色谱仪1.3检测用试剂情况试剂名称生产厂家、级别、规格备注甲醇二氯甲烷阿特拉津标准溶液1.4环境设施和条件情况实验室具有检定合格的温湿度计，环境可以控制在标准要求范围内，满足检测环境条件。
另外实验室配备了洗眼器、喷淋设施、护目镜、灭火器等的安全防护措施，符合实验室安全内务的要求。
2实验室检测技术能力2.1方法原理及适用范围本方法用二氯甲烷萃取水中阿特拉津，萃取液经过无水硫酸钠干燥后，用浓缩器浓缩至近干，以甲醇定容，通过具有紫外检测器的高效液相色谱仪进行测定。
以保留时间定性，外标法定量。
当样品取样体积为100ml时，本方法的检出限为0.08μg/L，测定下限为0.32μg/L。
2.2试样的制备用量筒量取100ml样品于205ml分液漏斗中，加入5g氯化钠摇匀。
用20ml 二氯甲烷分两次萃取，每次10ml，于振荡器上充分振摇5min。
注意手动振摇放气。
静置分层后，将有机相通过装有无水硫酸钠的漏斗，接至浓缩瓶中，注意无水硫酸钠充分淋洗。
合并两次二氯甲烷萃取液。
用浓缩仪浓缩至近干立即用甲醇定容至1.00ml，供分析。
试样保存在4℃冰箱中，在40天内分析完毕。
2.3标准曲线的绘制取不同量的阿特拉津标准使用液（10mg/l），用甲醇稀释，配置成浓度为0.030﹑0.050﹑0.100﹑0.500﹑1.00μg/ml的标准系列，贮存在棕色小瓶中，于4℃冰箱中存放。
高效液相色谱仪验证
中心化验室型高效液相色谱仪验证（一）验证方案（二）验证报告药业有限公司中心化验室型高效液相色谱仪验证方案（SOP-YZ-???）方案制定人：制定日期：方案审查人：审查日期：方案审核人：审核日期：方案批准人：批准日期：药业有限公司目录1、概述2、验证目的3、验证实施小组成员及有关责任4、验证文件5、合格标准6、验证方法和步骤7、验证结果分析和综合评价8、最终评价9、验证周期10、验证记录1、概述高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种现代液相色谱法，其基本方法是用高压输液泵将流动相泵入到装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。
由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高、分析速度快的特点。
高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。
其中LC-2010和Agilent1100型为单泵型，LC-20AB型为双泵型高效液相色谱仪。
2、验证目的检查并确认高效液相色谱仪运行性能符合要求。
3、验证实施小组成员及有关责任验证实施小组组长???负责协调及异常情况的处理；操作员??????负责验证的具体操作工作；QA???负责监督实施本方案。
4、主要验证文件高效液相色谱法（SOP-ZL-???）、中华人民共和国国家计量检定规程液相色谱仪（JJG705-2002）、UV-VIS检测器SPD-20A/SPD-20AV说明书、溶液传输单元LC-20AB说明书、中华人民共和国药典2005年版二部、LC-2010A/2010C操作说明书安装手册和维修手册。
5、合格标准6、验证方法和步骤6.1验证方法整个验证过程分为单个部件的验证和整机验证。
验证时一般先验证泵、柱温箱、自动进样器的性能，接着是检测器的性能，最后是整机的性能验证。
HPLC有关物质分析方法验证
HPLC有关物质分析方法验证HPLC（高效液相色谱）是一种常用的物质分析方法，广泛应用于药品、食品、环境等领域。
为了保证分析结果的准确性和可靠性，对HPLC方法进行验证是非常必要的。
HPLC方法验证包括了准确性、精密度、线性范围、灵敏度、特异性和系统适应性等方面的评估。
首先，准确性是衡量方法是否精确地测量目标物质含量的能力。
方法准确性的验证包括添加回收试验、标准品浓度重现性试验以及样品稀释后的测试。
通过添加已知浓度的目标物质到待测样品中，在不同浓度下测定回收率，可以评估方法的准确性。
其次，精密度是衡量方法在短期内进行重复实验的一致性。
精密度的验证包括了重复测定试验以及系统精密度试验。
通过重复测定同一样品多次，计算相对标准偏差，可以评估方法的精密度。
线性范围是指方法在一定浓度范围内的目标物质含量与测定结果之间的关系。
验证线性范围时，需要测试少量目标物质的浓度，以及相对较高的浓度，测定结果在一定限度内应与浓度成比例关系。
灵敏度是指方法在检测限下测定目标物质的能力。
灵敏度的验证包括了检测限试验和定量限试验。
检测限试验是通过在基质中添加多个不同浓度的目标物质溶液，确定出检测限。
定量限试验是通过在基质中添加不同浓度的目标物质溶液，确定出定量限。
特异性是指方法所测定的目标物质与其他干扰物之间的选择性。
特异性的验证包括了干扰物试验和选择性试验。
通过加入干扰物到目标物质溶液中，然后进行测定，确定干扰物是否对结果产生影响。
选择性试验是通过测定其他可能存在的相关物质浓度，确定是否与目标物质有影响。
最后，系统适应性主要是验证HPLC仪器和设备的稳定性和可靠性。
系统适应性的验证包括了仪器精度试验和仪器稳定性试验。
精度试验是通过测定标准品溶液的浓度，评估仪器的精度。
稳定性试验是在一定时间范围内，对同一样品进行多次测定，评估仪器的稳定性。
在进行HPLC方法验证时，需要根据相关规范文件，制定详细的验证计划和方案，确保验证方法的全面性和科学性。
HJ1071-2019水质 草甘膦的测定高效液相色谱法方法验证
方法验证报告项目名称：水质草甘膦的测定方法名称：《HJ 1071-2019水质草甘膦的测定高效液相色谱法》报告编写人：参加人员：审核人员：报告日期：1.实验室基本情况1.1 人员情况实验室检测人员已通过《HJ 1071-2019水质草甘膦的测定高效液相色谱法》的培训，熟知标准内容、检测方法及样品数据采集和处理等，考核合格，得到公司技术负责人授权上岗，详见表格1-1。
1-1参加验证的人员情况登记表1.2 检测仪器/设备情况1-2 检测仪器/设备情况详情表1.3 检测用试剂情况详见表格1-3。
1-3 溶液及标准物质详情表1.4 环境设施和条件情况实验室具有检定合格的温湿度计，环境可以控制在标准要求范围内，满足检测环境条件。
另外实验室配备了洗眼器、喷淋设施、护目镜、灭火器等的安全防护措施，符合实验室安全内务的要求。
2.方法简介2.1方法原理及适用范围样品在PH为4-9的条件下加入二合水柠檬酸三钠，经过滤或固相萃取净化后与9-芴甲基氯甲酸酯进行衍生化反应，生成的荧光产物经二氯甲烷萃取净化后去除衍生化副产物后，用具有荧光检测器的高效液相色谱分离检测。
以保留时间和特征波长定性，外标法定量。
当进样体积为20μL时，本方法检出限为2μg/L,测定下限为8μg/L。
2.2样品采集与保存按照HJ91.1、HJ/T91和HJ/T164的相关规定进行样品的采集用棕色采样瓶采集样品，样品满瓶采集。
若采集的样品PH不在4-9之间，用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节其PH至4-9，4℃以下冷藏、避光保存，7d内完成样品分析。
2.3 试样的制备依次用6ml甲醇和6ml水活化固相萃取柱，保证小柱柱头浸润。
量取10ml 样品，加入29.3mg二水合柠檬酸三钠，混合后以约1低/秒的流速通过固相萃取柱，收集净化后的样品，代衍生2.4 衍生化反应取2.00ml净化后的样品于聚乙烯塑料管中，加入0.50ml四硼酸钠溶液，1.00ml9-芴甲基氯甲酸酯乙腈溶液，充分混匀后置于混匀仪上，40℃衍生1h。
HPLC分析方法开发与验证
HPLC分析方法开发与验证HPLC（High Performance Liquid Chromatography，高效液相色谱法）是一种常用的分析技术，广泛应用于药物研发、环境监测、食品检测等领域。
本文将从方法开发和验证两个方面介绍HPLC分析方法。
一、方法开发方法开发是确定分析物检测条件的过程。
以下是HPLC方法开发的步骤：1.确定分析目标：确定待分析的物质以及其化学性质，如分子量、分子结构等，以便选择正确的色谱柱和检测方法。
2.选择色谱柱：根据分析物的特性选择合适的色谱柱，如反相色谱柱、离子交换色谱柱等。
3.优化流动相：选择适当的流动相组成，如有机溶剂和缓冲液的混合物，以实现分离效果的最大化。
4.优化柱温：通过改变柱温度来控制分析物的保留和分离，可以提高分离效果和峰形。
5.选择检测波长：根据分析物的特性选择最佳的检测波长，以最大化检测灵敏度和选择性。
6.确定流速和进样体积：通过改变流速和进样体积来优化分离效果和检测灵敏度。
7.优化pH值：对于离子化合物，通过改变缓冲液的pH值可以改变分离效果。
8.创建方法文件：根据上述优化结果，建立最终的分析方法文件，记录分析条件和步骤。
二、方法验证方法验证是确保分析方法可靠和准确的过程，以下是HPLC分析方法验证的主要内容：1.线性范围：检测浓度在一定范围内的线性关系，通过测定不同浓度的标准品并绘制标准曲线来确定。
2.精密度和重复性：通过重复测定样品的相对标准偏差（RSD）来评估分析方法的精密性。
3.准确度：通过添加已知浓度的标准品到已知浓度样品中并测定含量，评估分析方法的准确性。
4.特异性：分析物是否受其他物质的干扰，通过对混合标准溶液进行测定来评估色谱方法的特异性。
5.检出限和定量限：标准曲线下限和浓度下限的浓度，测定方法的灵敏度。
6.系统适应性：测试HPLC仪器系统的重复性和稳定性，包括波长准确性、峰对称性和分离效果。
7.样品稳定性：评估样品在一定时间和条件下的稳定性，包括溶液稳定性和冷冻/解冻稳定性。
HPLC方法学验证
HPLC方法学验证高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是现代分析化学中常用的一种分离和检测技术。
它通过溶液中混合物组分的分配系数差异、亲和性差异、反应性差异等物理和化学特性，将混合物中的成分分离并通过检测器进行定量分析。
HPLC方法学验证的目的是评估和验证HPLC方法在其中一种特定条件下的适用性。
验证的步骤和标准通常遵循相关的法规和指南，如美国药典（USP）和国际协会（IUPAC）等。
以下是HPLC方法学验证的主要内容：1.精密度：通过连续多次注射样品，计算分析结果的相对标准偏差，评估方法在短期内的重复性。
2.准确度：通过添加已知浓度的标准溶液或纯品，检测其在样品中的回收率，评估方法的准确性。
3.线性范围：通过测定一系列浓度不同的标准溶液，绘制峰面积与浓度之间的线性回归曲线，评估方法的线性范围。
4.检测限和定量限：通过逐渐降低标准品浓度，确定最低可检测浓度和最低可定量浓度。
5.选择性：通过分析含有其他干扰物质的复杂样品，验证方法对目标成分的选择性。
6.准确性：通过与其他已建立的分析方法进行比较，评估新方法与已有方法的一致性。
7.精确度：通过不同操作人员、不同仪器、不同试剂等条件下的重复性测试，评估分析结果的一致性。
8.稳定性：通过在不同时间、温度和储存条件下的分析结果比较，评估方法在长期和不同条件下的稳定性。
HPLC方法学验证需要详细记录实验过程和结果，并进行统计分析。
通常，多次独立实验（至少三次）并计算结果的平均值、标准偏差和相对标准偏差。
如果符合要求，该方法即可认为是有效可靠的，并可以应用于具体的样品分析。
在HPLC方法学验证结束后，还需要定期进行方法的核查和验证，以确保方法的持续有效性。
方法的效能也可以通过参与国际或国内规范样品分析比对（如美国药典认可的试剂或样品）来进行评估。
总之，HPLC方法学验证是确保新牵涉到患者健康或食品安全的方法的准确性、可靠性和有效性的重要步骤。
岛津高效液相色谱仪验证方案
岛津高效液相色谱仪验证方案一、引言高效液相色谱仪是一种广泛应用的分析仪器，用于分离、鉴定和测定复杂混合物中的化合物。
为确保色谱仪的准确性和可靠性，在购买和使用新仪器之前，需要进行一系列的验证实验。
本文将提出一种岛津高效液相色谱仪的验证方案。
二、验证目标1.确保色谱仪的性能符合规格要求。
2.验证色谱仪的方法准确性和可靠性。
3.验证色谱仪的稳定性和重复性。
三、验证项目1.系统准确性验证：通过使用标准物质进行色谱分析，验证色谱仪的峰面积准确性和重复性。
选择具有不同保留时间和峰面积的标准物质，进行3次测定，计算相对标准偏差（RSD），要求在规定范围内。
2.方法准确性和可靠性验证：使用已验证的方法，分析已知浓度的化合物，通过计算回收率和相对误差，评估方法的准确性和可靠性。
要求回收率在90-110%之间，相对误差在±2%之内。
3.仪器稳定性验证：将标准物质连续注入色谱仪，连续分析5次，观察峰形和峰面积是否保持稳定，计算相对标准偏差（RSD），要求在规定范围内。
4.重复性验证：使用相同条件下的标准物质进行多批次分析，通过计算相对标准偏差（RSD），评估色谱仪的重复性。
要求RSD在规定范围内。
四、验证步骤1.系统准确性验证：a.准备不同浓度的标准物质溶液。
b.通过色谱仪进行测定，重复3次。
c.计算每个峰的相对标准偏差（RSD）。
2.方法准确性和可靠性验证：a.选择已知浓度的化合物，准备标准品溶液。
b.通过已验证的方法进行测定，重复3次。
c.计算每个峰的回收率和相对误差。
3.仪器稳定性验证：a.选择一个相对稳定并具有较大信号的峰，通过连续注入标准物质进行测定，重复5次。
b.观察峰形和峰面积的变化，计算每个峰的相对标准偏差（RSD）。
4.重复性验证：a.准备多批次的标准物质溶液。
b.通过相同条件进行测定，重复3次。
c.计算每个峰的相对标准偏差（RSD）。
五、结果分析通过对上述验证项目的实验数据进行分析，得出以下结论：1.系统准确性验证结果：峰面积的相对标准偏差在规定范围内，说明色谱仪具有良好的峰面积准确性和重复性。
高效液相色谱仪校验方案
高效液相色谱仪校验方案一、引言高效液相色谱仪（HPLC）是一种常用的分析仪器，广泛应用于药物、食品、环境等领域。
为确保HPLC的准确性、可靠性和稳定性，需要进行定期的校验和保养。
本文将介绍一种高效液相色谱仪校验方案，旨在提供一套操作规范，以确保HPLC的正常工作。
二、校验前准备在进行HPLC校验前，需要进行以下准备工作：1.确保校验设备和试剂的准备和到位。
2.检查HPLC仪器各部件是否完好无损，如进样器、流动相泵、检测器等是否正常工作。
3.清洗进样器和流动相泵，确保没有残留物。
4.检查HPLC仪器上的管道连接是否牢固，是否有漏气现象。
三、校验项目及方法1. 流动相流速校验项目描述流动相的流速是HPLC分析的重要参数，需保证其准确性和稳定性。
校验方法1.用高精度天平称取准确质量的校验溶液，在恒温条件下，通过进样器将校验溶液输入到流动相泵中。
2.设置初始流速并启动流动相泵，采用亚洲最大采取法即可获得流速值。
3.重复上述步骤3次，计算平均值，并与预设的流速值进行比较。
2. 进样量校验项目描述进样量是HPLC分析中的重要参数，需要准确控制。
校验方法1.使用标准样品，并在恒温条件下设置流动相流速。
2.分别进行不同进样量的校验，每次重复3次。
3. 峰面积校验项目描述峰面积是HPLC分析结果的一个重要参数，可用于定量分析。
校验方法1.使用标准样品，并在恒温条件下设置流动相流速和进样量。
2.对标准样品进行3次连续进样分析，记录每个峰面积。
四、结果与讨论根据校验所得数据，可以计算相对偏差和标准差，并与厂家提供的规格要求进行比较。
如果相对偏差和标准差均在规定范围内，说明HPLC仪器的性能良好，可以继续使用。
如果超出规定范围，需要进行维修或调整。
五、结论通过本校验方案的实施，可以对HPLC仪器的流动相流速、进样量和峰面积进行有效校验，确保仪器的准确性和稳定性。
校验结果可为仪器的日常使用和维护提供依据。
六、参考文献暂无。
HPLC方法验证
HPLC方法验证高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种广泛应用于药物、食品、环境、生物和化学分析等领域的分离和定性定量分析方法。
HPLC方法验证是确保所采用的分析方法能够稳定、准确地进行分析的过程。
下面将以1200字以上的篇幅介绍HPLC方法验证的步骤、参数和标准。
HPLC方法验证通常包括以下步骤：系统适应性、选择性、线性性、准确性、精密度和重复性。
首先是系统适应性验证，目的是确保所选的HPLC系统可以满足所需的分析要求。
这一步骤通常涉及校准和校准曲线的建立，通过检查稳定性、重复性和灵敏度等参数来评估系统的性能。
选择性验证是指检测方法对目标分析物的选择性，确保所选择的分析方法能够清楚地分离目标分析物，而不会受到其他干扰物的影响。
这通常涉及方法的优化和杂质检测。
线性性验证是评估方法在一定浓度范围内的线性关系，即样品浓度与峰面积的关系。
这一步骤涉及建立标准曲线，并通过回归分析来评估方法的线性性。
准确性验证是确定方法对目标分析物的准确性和恢复率。
这通常涉及测量已知浓度的标准样品，并与理论值进行比较，以确定方法的准确性。
精密度和重复性验证是评估方法在同一实验室内和不同实验室之间的可重复性和精密度。
这一步骤涉及对同一样品的重复测量，并计算相对标准偏差（RSD）。
在HPLC方法验证中，除了上述步骤外，还需要根据相关准则和标准来设计验证实验，并记录和分析实验结果。
例如，美国食品药品管理局（FDA）和国际药典（USP）提供了一些关于HPLC方法验证的指南和标准，如FDA的ICHQ2(R1)和USP1225章节。
根据这些准则和标准，HPLC方法验证需要满足一些特定的参数和标准。
例如，在线性性验证中，通常要求相关系数（r）大于等于0.99，而在准确性验证中，通常要求恢复率在80%至120%之间。
精密度和重复性验证通常要求相对标准偏差（RSD）不超过2%或2.5%。
HPLC仪器验证方案
HPLC仪器验证方案HPLC（高效液相色谱）仪器验证是确保仪器正常运行和产生可靠结果的重要步骤。
以下是一个1200字以上的HPLC仪器验证方案，包括设备验证、性能验证和方法验证。
一、设备验证设备验证是验证HPLC仪器的各个组成部分和设备参数是否符合规定要求的过程。
以下是设备验证的主要内容：1.仪器校准：校准仪器的参数（如流速、温度、压力）并与参考值进行比较，以确保精确度和准确性。
2.设备清洁和维护：定期清洁仪器的各个部件，如针尖、柱头和流动通道，以确保仪器正常运行和消除污染的风险。
3.电源和地线：检查电源接头和插头是否正常连接，并确保地线连接良好，以避免电气故障和触电风险。
4.仪器参数设置：根据标准和方法要求，设置仪器的参数，如波长、检测器灵敏度和积分时间等，以确保仪器能够正确执行分析过程。
5.故障检测和保护：测试仪器的自动诊断和保护功能，如温度过高、压力异常和泄漏等故障的检测和报警系统，以及自动停止流程和保护仪器。
二、性能验证性能验证是验证HPLC仪器的参数和性能是否符合规定要求的过程。
以下是性能验证的主要内容：1.流速准确性：使用标准物质，验证仪器的流速准确性，测量仪器的流速与参考值之间的偏差。
2.重复性和精密度：通过多次重复测量相同样品，并计算测量结果的变异系数以验证仪器的重复性和精密度。
3.检测限和线性范围：使用标准物质，测量仪器的检测限和线性范围，并与规定要求进行比较。
4.分离度：使用混合物标准物质，检验仪器的分离度和分辨率，并与规定要求进行比较。
5.峰对称性：使用对称性标准物质，检验仪器的峰对称性，并与规定要求进行比较。
三、方法验证方法验证是验证HPLC仪器的分析方法是否能够正确、准确和可靠地分析样品。
以下是方法验证的主要内容：1.选择合适的标准物质：选择能够准确、快速和可靠地分析样品的标准物质，并制定合适的样品前处理方法。
2.优化分析方法：通过调整仪器参数和条件，优化分析方法，使得样品能够在较短的时间内获得准确的结果。
211132928_高效液相色谱法测定小麦粉中偶氮甲酰胺的方法验证
分析检测高效液相色谱法测定小麦粉中偶氮甲酰胺的方法验证李丽丽，吕 琳，李佳慧，杨 跃（营口市食品药品检验检测中心，辽宁营口 115003）摘 要：为提高营口市食品药品检验检测中心仪器分析实验室检测能力，本实验室依据《实验室质量控制规范食品理化检测》（GB/T 27404—2008），利用高效液相色谱仪，对《食品安全国家标准食品中偶氮甲酰胺的测定》（GB 5009.283—2021）开展方法验证。
本文主要对标准曲线及线性范围、检出限、定量限、精密度和回收率等参数进行逐一验证。
结果表明，本实验室具备开展小麦粉中偶氮甲酰胺测定的能力。
关键词：高效液相色谱；偶氮甲酰胺；方法验证Method Verification for Determination of Azodicarbonamidein Wheat Flour by HPLCLI Lili, LV Lin, LI Jiahui, YANG Yue(Yingkou Food and Drug Inspection Center, Yingkou 115003, China)Abstract: In order to improve the ability of instrument analysis laboratory testing of Yingkou Food and Drug Inspection Center, according to GB/T 27404—2008, the laboratory verified the method of GB 5009.283—2021 using HPLC. In this paper, standard curve, linear range, detection limit, quantitative limit, precision, recovery rate and other parameters were verified one by one. The results showed that the laboratory had the ability to determine azoformamide in wheat flour.Keywords: high performance liquid chromatography; azodicarbonamide; method validation偶氮甲酰胺（Azodicarbonamide，ADA）是目前小麦粉行业常见改良剂，可增强小麦粉筋度，提升韧性，包括中国在内的部分国家允许其在一定限量内添加使用[1-3]。
液相色谱仪HPLC分析方法验证 液相色谱解决方案
液相色谱仪HPLC分析方法验证液相色谱解决方案为了保证分析检测结果精准、牢靠，必需对所接受的分析方法的精准性、科学性和可行性进行验证，以证明分析方法符合检测的目的和要求，这就是分析方法验证。
从本质上讲，方法验证就是依据检测项目的要求，预先设置确定的验证内容，并通过设计合理的试验来验证所接受的分析方法符合检测项目的要求。
方法验证在质量掌控上有紧要的作用和意义，只有经过验证的分析方法才能用于药品生产的分析检测，方法验证是订立质量标准的基础。
方法验证内容包括方法的专属性、线性、范围、精准度、精密度、检出限、定量限、耐用性和系统适用性等，检测目的不同验证要求也不尽相同。
1.专属性专属性是指分析方法能够将产品和杂质分开的特性，也称为选择性。
对于纯度检测，可在标准品中加入产品中的已知杂质，或者直接用粗品，考察产品峰是否受到杂质的干扰，对于过程跟踪，可用反应体系样品来考察有没有其它的杂质干扰。
必要时使用二极管阵列检测器或者质谱检测器进行色谱峰纯度检查。
一般要求产品和杂质之间的分别度大于2.0、2.线性线性是在设定的范围内，检测结果与样品中原材料或产品的浓度呈线性关系的程度。
线性是定量检测的基础，需要定量检测的项目都需要验证线性。
一般用储备液经过精密稀释，或分别精密称样，制备得到一系列被测物质的浓度（5个以上），按浓度从小到大运行序列，以峰面积和浓度的函数作图，用zui小二乘法进行线性回归计算，考察分析方法的线性。
3.范围范围指在能够达到确定的精准度、精密度和线性时，样品中被分析物的浓度区间。
简单的说，范围就是分析方法适用的样品中待测物的浓度zui大值和zui小值。
需要定量检测的分析方法都需要对范围进行验证，纯度检测时，范围应为测试浓度的80%～120%。
4.精准度精准度是指测定的结果与真实值之间接近的程度，所以也叫做真实度，需要定量得分析方法均需要验证精准度。
精准度应在规定的范围内建立，对于原材料药可用已知纯度的标准品或符合要求的原材料药进行测定，必要时可与另一个已建立精准度的方法比较结果。
HPLC验证方案
HPLC验证方案HPLC（高效液相色谱）是一种常用的分析测试技术，广泛应用于各个行业，包括制药、化工、环境监测、食品安全等领域。
为了确保HPLC的可靠性和准确性，需要进行验证实验。
1.仪器验证：验证仪器的性能是否符合要求。
包括泵的流量准确性、进样系统的精密度和准确性、检测器的灵敏度和线性度等方面。
可以使用标准样品进行验证，比较测试结果与标准结果的偏差。
2.HPLC柱验证：验证柱的性能是否符合要求。
柱的选择对于HPLC分析测试非常重要，柱的质量直接影响分析结果的准确性和重复性。
柱验证可以通过一系列的测试来完成，比如测试分离效果、压力、回收率等指标。
3.方法验证：验证分析方法的准确性和可靠性。
分析方法验证是确保分析结果的准确性和可靠性的重要环节。
常用的方法验证包括线性性、准确性、精密度、重复性、特异性、检出限和定量限等。
4.校准曲线的建立：建立标准曲线，用于定量分析未知样品。
标准曲线是通过一系列已知浓度的标准溶液测定其响应后得到的，可以用于测定未知样品的浓度。
5.系统适用性：检验该分析方法对所需测定物质的准确性和可靠性。
可以进行类似方法验证的测试，比如线性性、准确性、精密度等。
6.选择合适的峰区和背景区：峰区应选在不邻近拐点和峰尾上升区域，以避免与其他成分重叠；背景区应选在物质浓度较低处，以避免与干扰物质重叠。
以上是HPLC验证方案的主要内容，具体实施时需要根据实际情况进行调整。
验证实验的结果应进行分析和总结，确保验证结果的可靠性和准确性。
并且，验证实验应定期进行，以便及时发现和解决问题，确保测试的可靠性和准确性。
高效液相色谱方法的验证
方法验证的内容
• 准确度 • 精密度 • 专属性 • 检测限 • 定量限 • 线性和范围 • 耐用性
准确度
定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。
1. 主成分含量测定
原料药：对照品或方法比对
制剂、中药：标准加样回收 2. 杂质定量
杂质对照品 方法比对 杂质与主成分的相对含量
S h =
P
N hbaselinenoise
测定：将一对照品储备溶液，逐步稀释，分别进样分析，计算相应 色谱峰高hp和平均基线噪音（h baseline noise）之比。通常报告进样质量 或进样体积（需与样品制备方法相关）。
线性和范围
线性ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ在设计范围内，测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比关 系的程度。
专属性
定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。
1. 鉴别反应
2. 含量测定
杂质测定 限量检查
测定： 空白制剂，模拟复方
加速破坏试样测试
DAD峰纯度检查
检测限和定量限
检测限（LOD）：供试品中被测物能被检测出的最低量。 通常采用信噪比3:1或2:1
定量限（LOQ）: 供试品中被测物能被定量测定的最低量。 通常采用信噪比10:1
分析方法研究和验证中使用的标准物质
• 对照品（一级标准） • 工作标准（二级标准） • 非法定对照品
杂质分析
新原料药和新制剂中的杂质研究 国家有关新药申报要求 ICH文本：Q3A, Q3B
仪器要求：
1. 检测灵敏度：波长，灯 能量，流通池，进样量 等其它色谱条件
2. 数据处理：积分参数
• 采用对照品，或相对保留时间定位 • 采用DAD或MWD确定UV光谱或不同波长的检测情况 • 测定对主成分的相对响应因子（0.9~1.1）
高效液相色谱质检方法
高效液相色谱质检方法
高效液相色谱（HPLC）是一种广泛应用于分析和分离化学物质的技术。
以下是一些高效液相色谱质检方法的步骤：
1. 准备样品：将待测样品进行前处理，如过滤、萃取、浓缩等，以确保样品适合进行HPLC 分析。
2. 选择色谱柱：根据待测物质的性质和分离要求选择合适的色谱柱，如反相柱、正相柱、离子交换柱等。
3. 选择流动相：根据待测物质的性质和色谱柱的要求选择合适的流动相，如有机相、水相、缓冲液等。
4. 设定仪器参数：根据色谱柱和流动相的要求设定仪器参数，如流速、柱温、检测波长等。
5. 进样：将待测样品注入HPLC 系统，通常使用微量注射器或自动进样器。
6. 分离和检测：待测物质在色谱柱中进行分离，并通过检测器进行检测。
常用的检测器包括紫外检测器、荧光检测器、示差折光检测器等。
7. 数据分析：根据检测结果进行数据分析，如计算峰面积、保留时间、分离度等。
高效液相色谱是一种高灵敏度、高分辨率的分析技术，广泛应用于化学、生物、医药等领域的质量控制和分析检测。
检测HPLC验证报告
检测HPLC验证报告HPLC验证报告的目的是对高效液相色谱（HPLC）方法进行验证，并确保其在实验室环境中的准确性和可靠性。
这是一项非常重要的工作，因为合理和准确的验证结果对于实验室的品质控制和分析结果的可信度至关重要。
HPLC验证报告以实验室测试的数据为基础，结合HPLC方法的验证原理和标准要求，对该方法进行全面分析和评估。
验证报告应包含详细的验证计划、实验流程、验证参数、数据分析和结论等内容。
该报告的目的是确保HPLC方法的可靠性、准确性和一致性。
通过验证报告，我们可以评估该方法是否能够在特定条件下有效分离和定量分析化合物。
因此，了解HPLC验证报告的目的和重要性对于实验室的质量管理和实验结果的可靠性至关重要。
本报告将解释HPLC验证报告的具体步骤和方法，包括样品制备、仪器设置和分析条件等。
样品制备在进行HPLC验证之前，首先需要准备样品。
样品制备的步骤如下：确定需要分析的目标物质，例如药物或化合物。
按照标准操作程序，准备样品溶液。
确保使用纯净的溶剂和标准品（如果适用）。
对于固体样品，将其适当加工或粉碎，以便于溶解。
按照实验要求和标准程序，对样品进行必要的稀释或浓缩。
仪器设置在进行HPLC验证之前，需要进行仪器设置。
仪器设置的步骤如下：打开HPLC仪器，并确保其正常工作，例如检查移液器、柱和检测器。
清洗和平衡柱，以确保柱得到适当的运行条件。
设置所需的流动相，包括溶剂和缓冲液。
确保溶剂和缓冲液的配制符合设备要求。
设置流速、温度和压力等操作参数，以确保稳定的运行条件。
分析条件在进行HPLC验证之前，需要设置适当的分析条件。
分析条件的步骤如下：确定所需的检测波长和峰检测方式，例如紫外检测或荧光检测。
对于每个目标物质，根据其化学特性和前期实验结果，设置适当的保留时间窗口和峰宽度。
根据样品的特性，设置适当的进样量和进样方式。
建立质量标准曲线，并确定目标物质的检测限和定量范围。
在进行HPLC验证时，需要注意以下事项：检测过程中应严格遵守实验室安全规范和操作规程。
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Method Development 方法开发 – method optimization sample 方法优化举例
柱 Column: Waters Symmetry C18 4.6 mm x 25 cm, 5 µ m 柱温 Column temperature: 20˚C 流动相 Mobile phase A: 0.01% HAC in water 流动相 Mobile phase B: 0.01% HAC in ACN 流速 Flow Rate: 0.8 mL/min 进样量 Injection Volume: 5 µ L 检测器 Detector: UV at 203 nm
Method Development – HPLC Column (cont.) 色谱柱
Column Dimension: 柱子的尺寸 4.6 mm x 25 cm 4.6 mm x 15 cm 4.6 mm x 10 cm
Particle Diameter: 粒径 10 µm, 5 µm, 3.5 µm, 1.8 µm Pore size, Surface area, End capping 孔径，表面积，封尾
Method Development 方法开发 – Initial Chromatographic Conditions Initial 色谱条件
Column 柱: Waters Symmetry C18 4.6 mm x 15 cm, 3.5 µ m Column temperature 柱温: 35˚C Sample temperature 样品温度: Room Temperature 室温 流动相 Mobile phase A: 0.1% H3PO4 in water Mobile phase B: 0.1% H3PO4 in acetonitrile 流速 Flow Rate: 1.0 mL/min 进样量 Injection Volume: 20 µ L 检测器 Detector: Photodiode array detector 梯度 Gradient Profile: 10% B - 80% B in 60 min.
Method Development 方法开发
– HPLC UV Detectors 紫外检测器
Method Development – Other Chromatographic Conditions 其它色谱条件
Flow rate 流速: 1.0 ± 0.5 mL/min
Injection Volume 进样量: 10 µ L – 100 µ L Sample temperature 样品温度: 5˚C – room temperature室温 Isocratic vs. Gradient 等度 VS. 梯度
Method Development – HPLC Mobile Phase: Buffer 流动相：缓冲液
Henderson-Hasselbalch Equation 公式: pH = pKa + log ([A-] / [HA]) Buffers for use in HPLC separations: 色谱分离使用的缓冲液 Buffer pKa Buffer Range UV Cutoff Phosphate 2.1 1.1 – 3.1 <200 nm 磷酸盐 Acetate 4.75 3.75 – 5.75 210 nm 醋酸盐 Citrate 3.1 2.1 – 4.1 230 nm 柠檬酸盐
Analytical Method Development and Validation
分析方法的建立和验证 28 March 2008
Outline总纲
HPLC Method Development
高效液相方法建立 HPLC Trouble-shooting Guide HPLC问题解答 Method Optimization 方法优化 Method Validation 方法验证 System Suitability Requirements 系统适应性要求 GMP “Mind-set” GMP理念
封尾
Method Development 方法开发
– HPLC Mobile Phase 流动相
Strong solvent component: 强溶剂组份 Methanol 甲醇 Acetonitrile 乙腈 Tetrahydrofuran 四氢呋喃 Weak solvent component: 弱溶剂组份 Water 水 Buffer 缓冲液 Diluted acid (0.1% H3PO4)
Method Development 方法开发
– HPLC Detectors：HPLC 检测器
UV absorption 紫外吸收
Fixed-wavelength UV detector 固定波长紫外检测器 Variable-wavelength UV detector 可变波长紫外检测器 Photodiode array detector 二极管阵列检测器 Fluorescence detector 荧光检测器 Mass spectrometer (LC/MS) 质谱仪 （液质联用） Electrochemical detector 电化学检测器 Conductivity detector 电导率检测器 Evaporative light scattering detector 蒸发光散射检测 器
HPLC Trouble-shooting ：高效液相问题解答 – Sources of peak tailing：拖尾的原因
pH问题 pH issue 问题柱子 （柱床坏掉） Bad column (packed bed damaged) 化学效应 （与硅烷醇结合）Chemical effects (interact with silanol) 柱过载 Column overloaded 不正确的稀释液 Wrong diluent (100% ACN) 死体积 Dead volume 温度问题Temperature issue 等等 etc.
Method Development 方法开发 – HPLC Column色谱柱：考考你 ???
Particle Size 粒径Length长度 Expected N 要求 3.5 µm 5 cm 4200 3.5 µm 10 cm ??? 5 µm 25 cm 12000 10 µm 25 cm ??? Particle Size粒径 Length长度 Resolution分离度 3.5 µm 5 cm 1.5 3.5 µm 10 cm ???
Method Development 方法开发 – HPLC Column 色谱柱
Reversed phase: C18(USP L1), C8(L7) 反相：C18(USP L1), C8(L7) Normal phase: Silica, CN, and NH2 Silica, CN, and NH2 Ion-Exchange: Dionex column 离子交换： Dionex column Ion pair Chromatography: C18/C8/CN 离子对色谱法： C18/C8/CN Size Exclusion Chromatography 排阻色谱法 Chiral separation 手性分离
Method Development 方法开发
– HPLC Column (cont.)色谱柱
Guard Column 预柱 Column Wash 柱子冲洗 Column Temperature (35 ˚C - 60 ˚C) 柱温 （ 35 ˚C - 60 ˚C ） Column Storage 柱子的储存
Method Development – HPLC Mobile Phase: Buffer 流动相：缓冲液
Buffer Selection Principle:
缓冲液选择原则 The pH of the mobile phase buffer should NOT be within ±2 pH units of the pKa values of the analytes. 流动相缓冲液的pH值不应在样品酸性解离常数值pH单位的 ±2范围内 This ensures reproducible retention times and good peak shapes. 这保证了保留时间的重复性和良好的峰形。
Method Development 方法开发 – Useful Information 有用的信息
Chemical structure and MW 化学结构和分子量 Solvent solubility 溶剂中的溶解度 pKa and pH solubility 酸性解离常数和PH溶解度 UV spectrum 紫外光谱 Process impurities 工艺杂质 Possible degradation impurities 可能的降解杂质 Literature References 参考文献 MSDS – Material safety data sheets 安全数据表
Regulatory Requirements 法规要求 Technical Requirements 技术要求 Practical Requirements 实践要求 Validation Requirements 验证要求
Method Optimization - Four “S” 方法优化－ 4S
Method Development – Method Classification 方法开发－分析方法分类 Assay Method 含量方法 Impurity Profile 杂质情况 - Related Substances 有关物质 Chiral Purity 手性纯度 Content Uniformity 含量均一性 Dissolution Cleaning Validation 清洁验证 Identity – Fingerprint 鉴别－指纹 法