DNA序列比对同源性分析图解BLAST

1、进入网页：/BLAST/

2、点击Search for short, nearly exact matches

3、在search栏中输入引物系列：

注：文献报道ABCG2的引物为5’-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3’;

5’-TGCCCATCACAACATCATCT-3’

（1）输入方法可先输入上游引物，进行blast程序，同样方法在进行下游引物的blast程序。

这种方法叫繁琐，而且在结果分析特异性时要看能与上游引物的匹配的系列，还要看与下游引物匹配的系列——之后看两者的交叉。

（2）简便的做法是同时输入上下游引物：有以下两种方法。输入上下游引物系列都从5’——3’。

A、输入上游引物空格输入下游引物

B、输入上游引物回车输入下游引物

4、在options for advanced blasting中：

select from 栏通过菜单选择Homo sapiens

Expect后面的数字改为10

5、在format中：

select from 栏通过菜单选择Homo sapiens Expect后面的数字填上0 10

6、点击网页中最下面的“BLAST！”

7、出现新的网页，点击Format！

8、等待若干秒之后，出现results of BLAST的网页。该网页用三种形式来显示blast的结果。（1）图形格式：

图中①代表这些序列与上游引物匹配、并与下游引物互补的得分值都位于40～50分

图中②代表这些序列与上游引物匹配的得分值位于40～50分，而与下游引物不互补

图中③代表这些序列与下游引物互补的得分值小于40分，而与上游引物不匹配

通过点击相应的bar可以得到匹配情况的详细信息。

（2）结果信息概要：

从左到右分别为：

A、数据库系列的身份证：点击之后可以获得该序列的信息

B、系列的简单描述

C、高比值片段对（high-scoring segment pairs, HSP)的字符得分。按照得分的高低由大到小排列。得分的计算公式＝匹配的碱基×2＋0.1。举例：如果有20个碱基匹配，则其得分为40.1。

D、E值：代表被比对的两个序列不相关的可能性。。E值最低的最有意义，也就是说序列的相似性最大。设定的E值是我们限定的上限，E值太高的就不显示了

E、最后一栏有的有UEG的字样，其中：

U代表：Unigene数据库

E代表：GEO profiles数据库

G代表：Gene数据库

（3）结果详细信息：

①圈出来的部分代表序列的信息

②第一个大括号代表上游引物与该序列的正链的匹配情况：

共有21个碱基匹配，得分42.1分，E值为0.020

上游引物与序列的2143～2163位点匹配

③第二个大括号代表下游引物与该序列的负链的匹配情况：

共有20个碱基匹配，得分40.1分，E值为0.077。

下游引物与该序列的29360～29379位点互补

注意点：

①上游引物为20个碱基，为什么会变成21个碱基呢？这是因为下游引物的第一个碱基为T，刚好与系列的2163位点的T匹配，因此下游引物的开头的第一个碱基被当成了上游引物了。同理，上游引物的最后一个碱基为G，被当成了下游引物了。通过寻找有没有与1～20位点、20～40位点完全匹配的序列，就可以避免这个因素的干扰了。

②为什么与上下游引物匹配的ABCG2序列有多种？

A、为同一个基因来源的不同的mRNA片段

B、为该基因的DNA系列

C、为同一个基因来源的不同的cDNA片段。

结果判断：

①验证文献报道的引物是否正确：如果你可以在所显示的结果中找出你的目的基因，一般说明你的引物正确性没问题。如果你blast后没有发现你的目的基因，或者分值很低，该引物就可能不适合用

②检测该对引物是否可与其它序列匹配，引起PCR的非特异性扩增。如果找到了你的目的基因名称，而且找到了一大批同物种的不同基因，（上下游引物分别搜索到相同的基因），而且分数也较高。这时表明你的引物设计的特异性不高，极有可能在你的扩增产物中出现非特异性产物。