微生物代谢尼古丁研究进展

oxidase ,6HDNO) 分别催化第二和第三步反应 ,它们 是一对严格光学特异的酶 ,分别作用于 L262羟基尼 古丁和 D262羟基尼古丁[11] 。L262羟基尼古丁氧化 酶是一个同源二聚体 ,分子量为 93 kDa ,每个亚基 以非共价键方式结合一个 FAD 分子[18] 。D262羟基 尼古丁氧化酶是一个分子量为 53kDa 仅由一个多 肽链组成的单体酶 ,每分子酶共价结合一个 FAD 分 子[19] 。 ( 3 ) 酮 脱 氢 酶 ( Ketone dehydrogenase , KDH) ,催化第四步反应 ,该酶为异源三聚体 ,3 个 亚基大小分别为 89 021171 Da ,26 778165 Da 和 17 638188 Da , 并分别依赖于钼蝶呤辅因子 (MoCo) 、 FAD 和 Fe2S 簇[20 ,21] 。( 4) 2 , 62二羟基吡啶羟化酶 (2 , 62dihydroxypyridine232hydroxylase , 2 , 62DHPH) , 催 化第六步反应 ,它是一个 90kDa 的同源二聚体 ,紧 密结合 2 个 FAD 分子 ,酶活对 NADH 严格依赖 ,当 2 ,62二羟基吡啶 、NADH 和氧气量为 1∶1∶1 时 ,反应 终产物为一种蓝色素[21 ,22] 。 112 节杆菌属细菌代谢尼古丁遗传学的研究
年代就有关于从烟叶和烟草种子上以及土壤中分
离到可代谢尼古丁微生物的报道 。已经发现的可
代谢尼古丁的细菌有 Pseudomonas sp . No. 41[4] 、P.
convexa PC1[5] 、 P. putida[6～8] 、 Arthrobacter
oxidans[9] 、A . oxidans P234 ( 后 来 重 新 鉴 定 为 A .
摘要 尼古丁是多种烟草的主要生物碱 ,它既是一种精神药品也是一种环境毒物 ,有效地控制卷 烟和环境中的尼古丁含量 ,对于维护人类健康有着重要意义 。一些微生物可以不同的途径代谢 尼古丁 ,它们具有降低烟草中尼古丁含量和处理卷烟加工产生的有毒废物的潜力 ,综述了节杆菌 属细菌和假单胞菌属细菌代谢尼古丁的分子生物学机理及可代谢尼古丁微生物在烟草陈化 、尼 古丁手性分离和含有尼古丁的废物处理等方面应用的研究进展 。 关键词 尼古丁 代谢 微生物
A . oxidans pAO1 尼古丁代谢的遗传学研究是 从发现 pAO1 质粒开始的 。1982 年 Brandsch 等[23] 通过质粒消除和接合转移的方法证明尼古丁降解
是由 约 160kb 的 大 质 粒 pAO1 介 导 的 。1986 年 Brandsch 等[24] 对 pAO1 亚克隆获得含有 6 hdno 的 218 kb 片段 ,并将其在大肠杆菌中成功表达 ,启动 子探针载体分析显示其表达来自本身的启动子 ;测 序后用该序列反推的氨基酸序列与提纯的 6HLNO 多肽氨基酸比较 ,发现两种酶在遗传上没有相关 性 ,FAD 的结合位点也不同 ,6HLNO 的 N 端具有类 似大多数酶的一个二核苷酸结合位点 ,而 6HDNO 没有[25] ;后来对该基因的启动子区和翻译起始密 码进行了功能分析 ,发现该菌株细胞中存在一个与 大肠杆菌σ70 和枯草杆菌σ43 聚合酶功能相似的 RNA 聚合 酶 , cAMP 和 pp Gpp 对 该 基 因 的 表 达 都 无 影 响[26] 。1992 年 Bermauer 等发现了调节蛋白 NicR1 和位于 6 hdno 5′2调节区的两个同源回文结构 IR1 和 IR2 ,NicR1 可以专一对称地协同结合在 IR1 和 IR2 上 ,但与含有 6 hdno 的启动子的 IR1 作用更强 , 在体外它可阻止大肠杆菌 RNA 聚合酶与其对应σ70 启动子的结合 ,但不论是否经尼古丁诱导 ,它与细 胞提取物中的 6 hdno 的启动子区的作 用 都 没 差 异[27 ] 。
111 节杆菌属细菌代谢尼古丁的酶学研究 尼古丁代谢过程中的 6 个主要反应步骤共涉
及到 6 个酶的作用 (图 1) ,除了催化第五步反应的 酶尚不知晓外 ,其它 5 个主要酶均已被纯化或克隆 表达 ,其催化机理也逐渐明确 。它们是 : (1) 尼古丁 脱氢酶 (nicotine dehydrogenase ,NDH) ,催化第一步反 应 ,该酶可被 D2尼古丁和 L2尼古丁同时诱导 ,没有 光学 选 择 性 , 会 被 葡 萄 糖 和 铵 盐 的 同 时 存 在 阻 遏[11] 。该酶由 3 个亚基组成 ,分子量分别为 30 011 Da ,14 924 Da 和 87 677 Da ,并分别以 Fe2S 簇 、FAD 和钼蝶呤二核苷酸为辅因子[16 ,17] 。(2) L262羟基尼 古丁氧化酶 (L262Hydroxy nicotine oxidase ,6HLNO) 和 D262羟 基 尼 古 丁 氧 化 酶 ( D262hydroxy nicotine
2003 年 Igoli 等将 pAO1 进行了全序列测定 (序 列号为 AJ507836) ,其准确大小为 165 137 bp , G + C 含量为 5917 % ,包含有 165 个开放阅读框架 ,包括 尼古丁转运和代谢 ,钼二核苷酸辅因子合成 ,糖类 、 肌氨酸和氨基酸的吸收和代谢必需酶的开放阅读 框架 ;并推测尼古丁转运载体与 6 hdno 形成一个基 因簇[28] 。
尼古丁 ( nicotine) ,俗称烟碱 ,是多种烟草的主
要生物碱 。因为尼古丁是一种精神药品 ,所以人类
长期保持着吸食烟草的习惯 。然而 ,长期吸烟会导
致对尼古丁的依赖性 ,而过量吸入尼古丁则会抑制
中枢神经 ,麻痹心脏 ,甚至有致命的危险[1] ;在吸烟
等过程中尼古丁还会被亚硝化 ,生成烟草中特有的 强烈的致癌剂 N2亚硝胺 ( TSNA) [2] ; 尼古丁也是一
2001 年 Baitsch 等报道了一个 27 690 bp 的基因 簇 ,从中鉴定出由 3 个片断组成的 kdh ,其中依赖 于钼蝶呤辅因子 (MoCo) 的大亚基基因 kdhC 距离 分别依赖于 FAD 和 Fe2S 簇的两个小亚基的基因 kdhA 和 kdhB 4266 bp ; 同时还对 2 ,62 dhph 克隆表 达 ;并对 pAO1 上尼古丁代谢酶基因的相对位置做 了分析 ,但 6 hdno 与其它的基因相对定位尚不清 楚[21 ] 。
ureaf aciens) [10] 、A . oxidans pAO1 ( 后来重新鉴定为
A.
nicotinovorans ) [11] 、
Achromobacter
nicotinophagum [12] 和 Cellulomonas sp . [6 ,13] ; 真菌主要
有 Cunninghamella echinulata 、Microsporum gypseum 、
第 24 卷第 7 期
中 国 生 物 工 程 杂 志
CHINA BIOTECHNOLOGY
2004 年 7 月
微生物代谢尼古丁研究进展 3
王书宁1 杜 毅2 陈 洪2 许 平1 33
(1 山东大学微生物技术国家重点实验室 济南 250100 ; 2 上海爱普香料有限公司 上海 200072)
近年来微生物代谢尼古丁的分子生物学机理 已经有了较深入的研究 ,这些研究主要围绕细菌展 开 ,集中在节杆菌属细菌 ,假单胞菌属细菌只有初 步的研究报道 ,而有关真菌方面的研究还未见有报 道。
1 节杆菌属细菌代谢尼古丁的分子生物学 研究
收稿日期 :2004204205 修回日期 :2004205210 3 国家“十五”攻关资助项目 (2001BA707B01) 3 3 通讯作者 ,电子信箱 :pingxu @sdu. edu. cn
节杆菌属细菌代谢尼古丁的分子生物学研究 , 主要是围绕 A . oxidans pAO1 (后来重新分类为 A . nicotinovorans) 展开的 。
第7期Leabharlann 王书宁 等 :微生物代谢尼古丁研究进展
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图 1 节杆菌属细菌尼古丁代谢途径 - 吡啶途径 (1) :尼古丁脱氢酶 ; (2) : (S)262羟基尼古丁氧化酶 ; (3) : (R)262羟基尼古丁氧化酶 ; (4) :酮脱氢酶 ; (5) :未知酶 ; (6) :2 ,62二羟基吡啶232羟化酶
Sepedonium chyrosperum 、 Streptomyces griseus 、 S .
platenses [14] 和 Pellicularia filamentosa[15] 。这 些 微 生 物多数能以尼古丁作为唯一碳氮源进行生长 ,它们 主要沿着三种不同的途径代谢尼古丁 ,第一种为节 杆 菌 属 细 菌 中 存 在 的 吡 啶 途 径 ( pyridine pathway) [10 ,11] (图 1) ,该途径从尼古丁吡啶环 6 位羟 基化开始 ,然后吡咯烷被氧化脱氢并自发水解打 开 ,接着吡啶环通过羟基化被打开 ;第二种为以假 单胞 菌 属 细 菌 为 代 表 的 吡 咯 途 径 ( pyrrolidine pathway) [4 ,5] ,该途径从尼古丁的吡咯烷被脱氢而打 开开始 ,然后通过羟基化打开吡啶环 ;第三种为存 在于真菌中的脱甲基化途径 (Me pathway) [14 ,15] ,该 途径从尼古丁的吡咯烷脱甲基生成去甲基尼古丁 (nornicotine) 开始 。微生物沿这些途径将尼古丁转 化为羧酸和氨基酸 ,为细胞的生物合成提供碳氮源 和能源 ,因而它们具有降低烟草中尼古丁含量和处 理卷烟加工产生的有毒废物的潜力 。所以有关微 生物代谢尼古丁的研究一直受到广泛关注 。
1994 年 Grether2Beck 等对 ndh 基因进行了克隆 和测序 ,发现它紧邻 6 hlno ,表达依赖于钼 ,NDH 由
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中 国 生 物 工 程 杂 志
第 24 卷
大小不同的 3 个亚基组成[17] 。 1998 年 Schenk 等利用λ噬 ,对它们进行 了克隆和表达 ,发现 6 hlno 大小为 1278bp ,表达产 物大小为 46 26415 Da 的脱辅基的单体 ; KDH 为异 源三聚体 ,其中 kdhA 终止密码子中的 A 用于 kdhB 的起始密码子中 ,而 kdhC 与 kdhA 相隔 281bp[20] 。