微生物实验技术(一)
微生物学实验一 微生物制片及形态观察
实验一微生物制片及形态观察一、显微镜油镜的使用显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。
显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。
1. 结构光学显微镜是由光学放大系统和机械装置两部分组成。
光学系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等；机械系统一般包括镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和底座等（图1－1）。
图1－1 光学显微镜结构图标本的放大主要由物镜完成，物镜放大倍数越大，它的焦距越短。
焦距越小，物镜的透镜和玻片间距离（工作距离）也小。
油镜的工作距离很短，使用时需格外注意。
目镜只起放大作用，不能提高分辨率，标准目镜的放大倍数是十倍。
聚光镜能使光线照射标本后进入物镜，形成一个大角度的锥形光柱，因而对提高物镜分辨率是很重要的。
聚光镜可以上下移动，以调节光的明暗，可变光栏可以调节入射光束的大小。
显微镜用光源，自然光和灯光都可以，以灯光较好，因光色和强度都容易控制。
一般的显微镜可用普通的灯光，质量高的显微镜要用显微镜灯，才能充分发挥其性能。
有些需要很强照明，如暗视野照明、摄影等，常常使用卤素灯作为光源。
2. 原理显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。
所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。
要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。
显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。
3. 使用方法1）低倍镜观察先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。
实验一显微镜油镜的使用及微生物基本实验技术
实验一显微镜油镜的使用及微生物基本实验技术实验一显微镜油镜的使用及微生物基本实验技术一、实验目的1. 复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术。
2. 了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。
3. 掌握微生物实验的操作技能。
二、实验内容：1．学习油浸系物镜的使用方法。
2．用油镜观察细菌和酵母菌染色装片。
3. 学习微生物实验的操作技能。
三、实验材料和用具细菌三型、酵母菌染色装片；显微镜、香柏油、擦镜液、擦镜纸；试管、培养皿、移液管、纱布、棉花等。
四、操作步骤（一）显微镜油浸的使用1．将显微镜置于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为4cm，坐正。
2．调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm 左右。
转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。
观察染色装片时，光线宜强；观察末染色装片时，光线不宜太强。
3. 低倍镜观察染色装片首先下降镜台，将酵母菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至低倍镜正下方，镜台升至距装片0.5cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使镜台下降至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。
移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。
4. 高倍镜观察染色装片眼睛离开目镜从侧面观察，旋转物镜转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相撞。
再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。
用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。
将最适宜观察部位移至视野中心。
不要移动装片位置，准备用油镜观察。
5. 油镜观察染色装片提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。
在玻片标本的镜检部位(镜头的正下方)滴一滴香柏油；从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头；将光线调亮，从目镜观察，用粗调节器将镜台徐徐下降(切忌反方向旋转)，当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。
微生物工程实验报告
实验1 培养基的配制和灭菌一、目的要求1.了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。
2.了解几种灭菌方法，掌握高压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。
3.熟悉菌种分离筛选的前期准备工作及操作方法。
4.每2人一组，每人一份实验报告。
二、实验材料1.药品：酵母粉、蛋白胨、氯化钠、琼脂、葡萄糖、KNO3、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、1N HCl、1N NaOH2.设备：高压蒸汽灭菌锅、紫外线灭菌灯、75%酒精棉。
3.材料：天平、药匙、电炉、pH 试纸、烧杯、量筒、5mL、10mL 注射器、玻璃棒、试管、培养基、吸管、移液器（1mL 0.2mL）、牛皮纸、线绳、标签等。
三、实验内容(一) 培养基的配制1．培养基的配制方法和步骤1)称量：按照配方正确称取所需药品放于烧杯中。
2)溶化：在烧杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。
3)调pH 值：用1N NaOH 或1N HCl 调pH，用pH 试纸对照。
4)加琼脂溶化：加热过程要不断搅拌，可适当补水。
5)分装：注意不要污染试管塞或纱布。
6)包扎成捆：用记号笔注明何种培养基。
7)灭菌：在高压锅中， 115 °C 高温灭菌30min。
2．培养基的配制A.富集培养基（液体）：海水2216E 液体培养基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉1.0，海水1L，pH 8.0。
取50mL 分装250mL 三角瓶后，8 层纱布封口，外包1层牛皮纸，121℃，高温灭菌20min。
B. 2216E 斜面（固体）：海水2216E 液体培养基中加入2%的琼脂粉，加热溶化琼脂，每支试管内。
加入3mL，121℃高温灭菌20min，灭菌后摆斜面。
C. 无菌生理盐水和保种液：生理盐水： NaCl 0.85% 蒸馏水配制。
每支试管加入5mL，盖上试管帽、包扎、121°C 高温灭菌20min。
保种液：生理盐水，加25%甘油D. 碳源优化培养基：以海水2216E 液体培养基（蛋白胨0.5%，酵母粉0.1%，磷酸铁0.01%，人工海水，pH7.6）为基础，碳源分别是：葡萄糖、蔗糖、甘油、柠檬酸钠、乳糖，每种碳源的添加量为1%。
微生物实验
①标 本
③ 孔径 光栏
⑤ 光轴中心调节 螺钉
③ 视场 光栏
N.A聚=(0.6-0.8)N.A物
操作步骤如下: (1）可变光栏的中心对准聚光镜的中心。如果可变光栏的水
平是固定的，则装配时已保证它与聚光镜合轴，不必调整;如果可 变光栏的水平位置可以移动，则应把可变光栏关到最小，使它的 中心孔对准聚光镜下方的透镜中心。
实验一培养基的配置、灭菌与无菌操 作技术
1、明确培养基的配制原则，掌握配制培养基的一般方法 和步骤； 2、掌握玻璃器皿的洗涤和包扎方法，了解玻璃器皿的灭 菌方法和原理； 3、了解几种常用灭菌方法的基本原理及应用范围； 4、掌握高压蒸汽灭菌技术，。
微生物学实验所用的器皿，大多要进行消毒、灭 菌和用来培养微生物，因此对其质量、洗涤和包 装方法均有一定的要求。清洁的玻璃器皿是实验 得到正确结果的先决条件，包扎方法要能保证防 止污染杂菌。空的玻璃器皿一般用干热灭菌，若 用湿热灭菌，则要多用几层报纸包扎。
为什么要将培养基倒置培养？
显微镜概述 微生物的个体微小，必须借助显微镜才能观察到。因
此，显微镜就成为微生物学研究工作者不可缺少的基本工 具。所以，了解显微镜的种类、结构、功能和正确地掌握 不同显微镜的使用方法是很有必要的。
显微镜可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。光学 显微镜有普通光学显微镜、相差显微镜、微分干涉差显微 镜、暗视野显微镜、紫外光显微镜、偏光显微镜和荧光显 微镜。下面主要介绍普通光学显微镜。
一、目的要求 1.学习显微镜的结构、功能和使用方法。 2.学习并掌握油镜的原理和使用方法。 3.学习微生物涂片、染色的操作技术；
4.掌握细菌单染色和革兰氏染色的方法；
5.掌握革兰氏染色反应原理、操作步骤和意义。
微生物学实验报告
微生物学实验报告(格式标准)(生命科学专业)教师:黎勇目录索引实验一油镜的使用与细菌的简单染色法 3实验二细菌的革氏染色与芽孢染色 5实验三常用培养基的配制7实验四酵母菌霉菌的形态结构观察及酵母死活细胞的鉴别8实验五、微生物大小的测定与显微计数10实验六环境中微生物的检测与分离纯化11实验七细菌鉴定中常用的生理生化反应12实验八(综合实验)化能异养微生物的分离与纯化13课程名称: 微生物学实验班级:化生系生命科学本科实验日期: 指导教师:黎勇实验一油镜的使用与细菌的简单染色法〔目的要求〕学习并熟练掌握油镜的使用技术;观察细菌的基本形态;学习观察细菌的运动性的基本方法。
〔基本原理〕1、 N·A=n·sinα2、 D=λ/2N、A3、目镜可提高放大倍数,但有效放大率取决于镜口率。
已经分辨的物体不放大瞧不清,未分辨物放得再大也瞧不清。
4、用悬滴法或凹玻片法观察细菌的运动性时,可以通过真运动能定向地由一处快速运动来区别于颗粒的布朗运动。
〔器材用具〕显微镜、载玻片、凹玻片、盖玻片、接种环、香柏油、二甲苯、凡士林、吸水纸、擦镜纸;细菌、放线菌等固定装片;培养18小时左右的B、subtilis、 S、arueus 菌斜面培养物;无菌水、生理盐水。
〔方法步骤〕:(一) 油镜的使用镜检装片在中倍(或高倍镜)下找到目的物,并使位于视野正中聚光镜上升到最高位置,虹彩光圈开到最大,镜头转开成八字形在玻片的镜检部位(光斑处)滴一滴香柏油油镜转入正下方侧视小心上升载物台(缩短镜头与装片距离,镜头浸入油中,至油圈不扩大为止镜头几与装片接触) 粗调器徐徐下降载物台(密切注视视野,当捕捉到物像时,立即用细调器校正) 仔细观察并绘图取出装片,清洗油镜:擦镜纸拭去镜头上的香柏油擦镜纸沾少许二甲苯擦去残留(用手指辅助,迅速拭擦一、二次) 用清洁擦镜纸仔细擦干二甲苯(2-3次)。
(二) 细菌的简单染色法:涂片干燥火焰固定染色水洗干燥油镜观察(三) 细菌运动性的观察取洁净盖玻片,四周涂上凡士林滴加一小滴菌悬液凹玻片的凹窝向下盖于盖玻片上翻转观察〔结果分析〕1、画一圆圈表示视野,选取所观察的微生物绘图,注意特殊结构、形状与排列。
微生物学 实验1 普通光学显微镜的使用及细菌形态的观察
一、实验目的
ß 了解显微镜的构造和各部分的作用，掌握 显微镜的使用方法 ß 学习并掌握油镜的原理和使用方法 ß 了解并观察细菌的三种基本形态
一、普通光学显微镜的基本结构
机械部分和光学部分 普通光学显微镜的构造可分为两部分：
粗准焦螺旋 细准焦螺旋 镜臂
镜柱
目镜
镜筒
转换器 物镜 通光孔 载物台 聚光器 压片夹 反光镜 镜座
三、实验器材
1、标本片：四联球菌、枯草芽孢杆菌 2、试剂：香柏油、二甲苯 3、仪器及其它用具：显微镜、擦镜纸等
四、实验步骤
1、显微观察步骤 1）低倍镜观察（10×）： 2）高倍镜观察（40×）： 3 ） 油 镜 观 察 （ 100× ） ： 2、显微镜用毕后的处理
低倍镜的操作
1. 右手握住镜臂，左手拖住镜座，将显微镜放在自己身体的 前方，离实验台边缘10 cm左右处；
四联球菌（10×100）
杆菌120（10×100）
六、思考与讨论
用油镜观察时应注意哪些问题？在载 玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作 用？
实验报告格式
一、实验项目名称 二、实验目的 三、实验基本原理 四、主要仪器设备及耗材 五、实验步骤 六、实验数据及处理结果 七、思考讨论题
下次实验项目名称：细菌的简单染色和革兰 氏染色
二、实验原理：显微镜的工作原理
显微镜的总放大倍数=物镜放大倍数X目镜放大倍数
◆ 物镜上的标识
油镜的放大倍数可达100× ，放大倍数这样大的镜头， 焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。
由低倍镜转为高倍镜时，通过增加照明强度和开 大虹彩光圈，以增大高倍镜及油镜下视野的亮度。
从标本玻片透过来的光线， 因介质密度不同（从玻片进入 空气，再进入镜头），有些光 线会因折射或全反射，不能进 入镜头，致使在使用油镜时会 因射入的光线较少，物像显现 不清。
微生物学实验技术
微生物学实验技术
微生物学实验技术是研究和发掘微生物的重要方法，也是一门多种实验技术和方法的
综合。
它既可以应用于生物体内，对微生物调查，可以使用培养基或特定介质进行鉴定，
也可以用来通过遗传工程分离、改造微生物，了解不同微生物的全部 trait 特性。
一、培养微生物
培养微生物是一种最常用的微生物实验技术，需要使用特定的培养基，通过控制温度、湿度等变量的变化来培养不同的微生物。
通过检测培养基中的微生物数量及某些代表性特征，可确定微生物的分类特征，来鉴定微生物的种类和形式。
二、基因组测序
基因组测序是一种实验技术，是分析一个微生物种类全部 genetic 的方法。
主要利
用高通量DNA测序技术，对样品中贮藏的 DNA 进行范围检测，得到 DNA 的测定序列，从
而确定微生物的遗传结构、物种种类，以及特定物种生态和功能特征。
三、共价法抗菌药敏试验
共价法抗菌药敏试验是研究微生物对一类药物或多类药物的抗性程度的重要方法之一。
通过检测药物剂量的不同，在药物浓度相同的情况下微生物在某种时间内生长情况不同，
来确定微生物对某种药物或多类药物的抗性情况。
四、特异性提取
特异性提取是一种以特定方法从微生物中提取出特定“ biomolecule ”，比如 DNA、蛋白质等，分离和纯化微生物某功能元件或特征分子的实验技术。
这种技术既可以提取大
量的基因片段，也可提取微量的特异性物质。
五、遗传修饰
遗传修饰是一种利用遗传工程改造或添加微生物特定遗传物质来改变微生物的特性的
实验技术，常用来进行分子育种和改良育种，以提高产品的质量和性能。
2-5动物微生物--细菌的人工培养(实验一)
1、3：有动力 2：无动力
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（2）在琼脂斜面上长成菌台。
a丝状
b刺毛状 c念珠状 d扩展状
e树状 f假根状
2、在液体培养基中的生长情况
（1）表面生长：液体清晰，细菌生长在 液面上形成菌膜。 （2）混浊生长：液体均匀混浊或有少量 沉淀。 （3）沉淀生长：液体清晰，细菌生长在 管底，形成沉淀。
三. 细菌在液体培养基中的生长情况
（1）在平板上形成肉眼可见的细菌集团， 称为菌落，观察菌落的大小、形状、边缘、 表面、颜色、溶血等情况。
Colony morphology
¹ ÌÅ à Ñ øÏ ù íµ ± æ Ï ¸Î ú ¾ úÆ ä Ï ¸ ¾ ú ¸» ° û µ Ä çÃ × Ó Ï Ô ¢¾ ¾ µ Í ¼ ¬Â
实验一
细菌的人工培养
一、实验目的
1、掌握平板划线、斜面、液体和半固体 培养基等各种接种方法。 2、熟悉接种细菌用具、接种细菌的环境 要求和无菌操作要领。
3、熟悉细菌在各种培养基的生长现象。
二、实验原理
1、细菌在适宜的生长环境下，如营养、 酸碱度、温度和氧等条件下进行生长繁殖。 2、细菌的分离培养是根据细菌在固体 培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个 细胞繁殖而成的集合体。因此可通过调取单 菌落而获得一种纯培养。
菌膜
对照
菌沉淀
均匀浑浊
3、在半固体培养基中的生长情况 （1）有鞭毛的细菌，由于能运动，在半 固体培养基内沿穿刺线弥漫生长，原来的 穿刺线不清。 （2）无鞭毛的细菌，因不能运动，接种 后仍沿穿刺线生长，穿刺线与周围界限清 晰。
细菌在半固体培养上的培养特征
abd 沿穿刺线生长
cef运动生长
三. 细菌在半固体培养基中的生长情况
微生物学实验一、细菌的革兰染色、特殊形态观察、细菌分布
革兰阳性菌与阴性菌细胞壁的比较
细胞壁 质地 厚度 肽聚糖层数 肽聚糖含量 糖类含量 脂类含量 磷壁酸 外膜
G+菌 坚韧 20-80nm 15-50 50-80%（干重） 约45% 1-4%
+ —
G-菌 疏松 10-15nm 1-2 5-20%（干重） 15-20% 11-22%
实验结果
（1） 绘图：画出大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的细胞 形态图。如果染色结果不理想，请分析原因。 （2） 思考: 进行革兰氏染色的意义?
细菌的基本结构
一、细胞壁 二、细胞膜 三、细胞质 四、核质
细菌的特殊形态结构
• 芽孢：休眠体，不利环境下产生，耐受各 种极端环境。
• 荚膜：多糖，包裹在菌体外围，保护菌体 • 鞭毛：运动，菌落形态。
实验一、细菌的革兰染色、特殊形态观察、细菌分布
实验目的
• 学习细菌的革兰氏染色原理和方法
• 了解细菌的特殊形态结构： 荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢
• 了解细菌在环境(空气、污水),人体(皮肤、 口咽腔)中的分布
革兰氏染色法基本原理
• 革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家 C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有 的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏 阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的 鉴别染色法。 G+ -紫色 G- - 红色
细菌荚膜的观察
主要成分是多糖、 多肽或蛋白质， 尤以多糖居多。
荚膜
细菌鞭毛的观察
菌毛
芽胞
肉毒梭菌
破伤风芽孢杆菌
了解细菌在环境中的分布 空 气: 每组一个琼脂培养皿 污 水: 每组一个琼脂培养皿
了解细菌在人体中的分布 皮 肤: 2人一个琼脂培养皿红 1min——水洗
微生物实验.doc
微生物基础试验实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒一、实验目的1、掌握配制培养基的一般方法和步骤；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法；2、了解培养基的配制原理；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法。
二、实验原理培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。
培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。
根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。
由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。
干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。
三、试剂与器材1、器材试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。
2、试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂四、实验内容1、称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查2、干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温摇床→降温→开箱取物3、高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查4、过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌五、关键步骤及注意事项1、要严格按配方配制。
2、调pH不要过头。
3、干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC以下放物、取物。
4、高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。
5、过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。
六、思考题1、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？2、在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么？3、培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么？4、培养基的配制原则是什么？实验二土壤中微生物分离纯化培养一、实验目的1、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；掌握微生物培养方法；2、了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术。
微生物学实验1
三、流程 涂片→干燥 固定→染色 初染→媒染 脱色→复染 干燥→固定 染色（ 媒染→脱色 复染） 镜检 镜检。 涂片 干燥 固定 染色（初染 媒染 脱色 复染）→镜检 四、步骤 1. 涂片：取一洁净的载玻片，在载玻片的中心滴一小滴蒸馏水，以无菌 接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净无油，否则 菌液涂不开。 2. 初染：滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上，染色 1～2min ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩 净。 3. 媒染：用卢戈氏碘液媒染约l min ，水洗。 l 4. 脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴 管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止 脱色，将载玻片上水甩净。 脱色时间一般约20～30s。 5. 复染：在涂片上滴加番红液复染约2～3min ，水洗，然后用吸水纸吸 干。 6. 镜检：用高倍镜观察 7. 实验结束后处理：清洁显微镜。
实验一 微生物的染色及观察
一、 实验目的 1.学习并掌握显微镜的原理及使用方法 2.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类 鉴定中的重要性。 3.学习掌握革兰氏染色技术。
二、实验原理 1. 复式显微镜的结构：机械装置、光学系统 显微镜成像原理：成倒立放大的虚像 显微镜的使用步骤： 观察前准备→ 显微观察→用毕后的处理
三、实验步骤 • 称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分 装→包扎标记→灭菌→倒平板 • 配方： 配方：
牛肉膏蛋白胨培养基： 牛肉膏蛋白胨培养基： NaCl 5.0g 蛋白胨 10.0g 牛肉膏 5.0g 琼脂 20.0g 蒸馏水 1000ml pH 7.0 淀粉培养基： 淀粉培养基： 牛肉膏 5.0g 蛋白胨 10.0 g NaCl 5.0 g 可溶性淀粉 2.0 g 琼脂 20.0 g 蒸馏水 1000 ml pH 7.2 明胶培养基： 明胶培养基： 蛋白胨 5g 牛肉膏 3g 明胶 120g 蒸馏水 1000mL pH 7.2
微生物检验的基本操作技术
1）、在固体培养基上，观察： 菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶
性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特 征及迁移性等； 2）、在液体培养中： 表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等； 3）、半固体培养基穿刺接种：
观察运动、扩散情况。
1.点状 2.圆形 3.丝状 4. 不规则形 5.假根状 6.纺锤 状
d.表面：有无生长、性状（膜状、环状）、菌膜厚薄及 表面特征（光滑、颗粒、皱状）；
e.其他：有无特殊气味，色素。如果是糖发酵培养基则 主要观察是否产酸和有无气体。
5）、穿刺接种法（半固体接种）
多用于保存菌种、观察动力及厌氧培养等也可以 用于观察细菌的某些生化反应。 （1）如斜面接种法持好菌种管及培养基管； （2）以灭菌接种针从菌种管取菌，垂直刺入培养基的中 心（半固体或一般琼脂高层）直达近管底部（但不能 完全刺到管底），接种针应沿原路退出； （3）经培养后半固体培养基可观察到：沿穿刺线生长， 线外的培养基清亮表示细菌无动力；穿刺线模糊不清， 或沿穿刺线向外扩散生长，或整个培养基混浊表示细 菌有动力。
③ 处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随 意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。在无 菌室内如需要安装空调时，则应有过滤装置。
2、超净工作台
超净台的使用与保养: （1）风速保持在0.32-0.48米/秒; （2）使用前开启紫外灯照射30分钟以上; （3）让超净台预工作10－15分钟; （4）使用完毕后，用70%酒精将台面和台内四周擦拭干
（1）取菌技巧 D
1. 调整 Pipetman 刻度 (P1000 吸取 范围 200 ~ 1000μl)
2. 插上灭过菌之 Tip
(用力插紧)
实验一 微生物培养基的制备与灭菌
实验一微生物培养基的制备与灭菌（8课时）一、目的要求1、学习配制微生物培养基的一般方法和步骤。
2、掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。
二、基本原理正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。
由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物的培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异，但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。
三、实验材料1、药品：牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂粉、1mol/L的NaOH和1mol/L HCl溶液。
2、仪器及玻璃器皿：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、酒精灯、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿和玻璃棒等。
3、其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、报纸、线绳和注射器等。
四、操作步骤（一）玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须用洗涤剂洗刷干净，然后用自来水冲净，置于烘箱中烘干后备用。
（二）牛肉膏蛋白胨培养基的配制1、培养基配制（1）称量：按培养基配方计算出各成分的用量，然后用电子天平进行准确称量后倒入一烧杯中。
注意：称量药品时，一定要用称量纸而不能用滤纸。
称药品用的药匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。
（2）溶解：用量筒称量所需体积的水（根据实验需要可用自来水或蒸馏水），倒入烧杯中，用玻璃棒搅动溶解即可。
（3）调pH：一般用pH试纸测定培养基的pH，可用1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液进行调节。
调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。
边加边搅拌，并不时用PH试纸测试，直至达到所需pH为止。
注意：pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
2、制备液体培养基（1）用量筒准确量取20ml培养基，倒入100ml三角瓶中，塞好棉塞，用报纸包好瓶口并用棉线包扎好，灭菌。
注意：倒溶液时不要把瓶口沾湿。
《微生物实验技术》课件
显微镜观察
通过染色技术，使微生物细胞着色，以便更清楚地观察其形态和结构。
染色观察
分类
根据微生物的形态、生理生化特性等，将其归入相应的分类单元的过程。
鉴定
利用各种方法和技术，对微生物进行种、属、种的鉴定，确定其具体分类地位。
03
微生物实验技术方法
总结词
对微生物基因组进行序列比对和分析，了解基因组的组成和结构。
基因组序列分析
利用生物信息学方法对微生物进行系统发育分析，了解其进化关系。
系统发育分析
通过预测基因功能，了解微生物的代谢和生命活动特点。
功能基因预测
04
微生物实验技术的应用案例
微生物检测
在食品工业中，微生物检测是确保食品安全的关键环节。通过实验技术，可以检测食品中的细菌、霉菌等微生物，评估食品的卫生质量。
微生物治理
05
微生物实验技术的安全与防护
A
B
C
D
建立实验室准入制度，确保只有具备相应资格和授权的人员才能进入实验室。
实验室准入制度
定期对实验室进行内务管理，确保实验室环境符合安全卫生要求。
实验室内务管理
根据微生物的危害程度，对实验室进行生物安全等级划分，并采取相应的管理措施。
生物安全等级管理
制定应急处理预案，并定期进行演练，确保在紧急情况下能够迅速、有效地应对。
应急处理措施
01
03
02
04
穿戴个人防护用品
在实验过程中，应穿戴符合要求的个人防护用品，如实验服、口罩、手套等。
避免直接接触
尽量避免直接接触微生物及其培养物，如需接触，应采取相应的防护措施。
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超薄切片技术
• 固定-- 脱水-- 包埋-- 切片--染色 – 固定：要求保持样品的形态结构不发生改变，常用固定剂为戊二 醛和锇酸等，通常在低温下固定。 – 包埋：使样品中各种细微结构在切片过程中都得到均匀良好的支 撑，使切成的超薄切片仍能保持连续完整并且有足够的强度，并 能耐受干燥以及观察时的电子轰击、高温和真空挥发。常用的包 埋剂为环氧树脂。包埋剂多与水不相溶，所以包埋前要经过一系 列脱水处理。 – 切片：厚度通常为40~50nm，常用玻璃刀。 – 染色：用重金属盐进行染色以形成明暗反差。样品中不同成分对 染料有不同亲和性（脂肪：锇酸；蛋白质：铅盐；核酸：醋酸铀）
分辨率
• 分辨率：指区分开两个质点间的最小距离。 D = 0.61λ/ (n·sinθ) D：分辨率 λ：波长 n：物镜与物体间介质折射率 2θ：物镜镜口角 N.A：即n·sinθ，数值孔径
• 2θ最大值 = 140℃，空气中n = 1，最短的可见光波长λ = 450nm，分辨率D = 292nm，约0.3um
• 原理：使用波长比可见光短得多的电子束作为光源（波长一般小于 0.1nm），用电磁透镜聚焦，电镜镜筒中要求高真空，图象需用荧光屏 来显示或感光胶片作记录。
• 分辨率：0.2nm；放大倍数106倍。 – 人眼分辨率0.2mm；光学显微镜分辨率0.2um，放大倍数1000倍。
• 基本构造 – 电子束照明系统：电子枪、聚光镜 – 成像系统：物镜、中间镜、投影镜 – 真空系统：用两级真空泵抽气，保持电子枪、镜筒及记录系统内的 高真空。 – 记录系统：用荧光屏显示或感光胶片作记录。
• 荧光： – 自发荧光：通过激发光使物体发出荧光，如叶绿素、维生素A – 诱发荧光：通过诱导剂作用而发出的荧光，如甲醛蒸汽处理诱发细 胞和组织中生物单胺类产生荧光 – 荧光染料染色荧光：丫啶橙对细胞DNA、RNA同时染色后，DNA 呈绿色荧光，RNA呈橙色荧光。
4. 电子显微镜技术 （electron microscopy）
• 冷冻蚀刻技术主要用来观察断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结 构，样品不需包埋、固定，能更好地保持样品的真实结构。
负染色技术
• 负染色：利用电子密度比标本高的重金属盐（如磷钨 酸钠、醋酸钠等）将生物标本包围起来，增强背景散 射电子的能力以提高反差，在暗的背景下显示标本的 形态结构。主要用于颗粒状标本（细菌、病毒、分离 的细胞器等）的研究。
– 利用一m）和蓝紫光（420nm），经过滤色系统， 作为激发光，激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后， 再通过物镜和目镜（石英玻璃制成）的放大进行观察，这种荧光在 显微镜下很容易辨认，敏感性高，能对细胞的特定物质进行定性、 定位和定量观察。
冷冻蚀刻技术
• 方法 – 冷冻 —快速低温冷冻法
• 将样品在液氮或液氦中迅速冷冻
– 断裂—低温下断裂 – 蚀刻：在真空中冰升华 – 复型
• 用铂、金等金属进行倾斜喷镀，以形成对应于凹凸的电子反差， 再经碳垂直于断面进行真空喷镀，形成一个连续的碳膜，然后用 消化液把样品本身消化掉，将剩下的碳膜及其构成图形的金属微 粒移到载网上进行电镜观察。
微生物实验技术（一）
一、显微镜技术
• 光学显微镜技术 – 普通光学显微镜技术 – 相差显微镜技术 – 荧光显微镜技术
• 电子显微镜技术
1.普通光学显微镜技术
（light microscopy）
• 结构 – 光学放大系统：物镜（油镜、高倍镜和低倍镜）和 目镜（10×、16×） – 照明系统：光源、反光镜和聚光器 – 机械和支架系统
• 油镜：n = 1.52，D = 0.2um
• 普通光镜的最大分辨率D = 0.2um
2. 相差显微镜技术
（phase-contrast microscopy）
• 相差显微镜与普通显微镜的区别：
– 在物镜后装有一块“相差板”，偏转的光线分别通过相差板的不同区 域，由于相差板上部分区域有吸光物质，使两组光线之间增添了新的 光程差，从而对样品不同密度造成的相位差起“夸大”作用。最后这 两组光线经过透镜又会聚成一束，发生互相叠加或抵消的干涉现象， 表现出肉眼可见的明暗区别。
二、常用的微生物染色法
• 简单染色法 • 革兰氏染色法 • 负染色法
细菌的观察方法
水浸片（压滴法）：在载玻片中央滴一滴无菌水，再
在其中加入少许菌体，使其均匀分布在无菌水中，盖 上盖玻片，镜检。
悬滴法：把要观察的含菌液体，滴在盖玻片上，然后
把它翻过来，放置在凹孔载玻片上，使液滴悬挂在凹 孔室内。
媒染 碘液
脱色 乙醇
G+ 复染 沙黄
G-
革兰氏染色法的原理
• 通过初染和媒染后，在细菌细胞的膜或原生体上染上 了不溶于水的结晶紫与碘的大分子复合物。G+细菌由 于细胞壁较厚、肽聚糖含量较高和其分子交联度较紧 密，在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔因脱水而明显收缩， 又由于其基本不含类脂，故在用乙醇处理时不会在壁 上溶出缝隙，因此结晶紫与碘复合物仍牢牢阻留在其 细胞壁内，呈紫色；G-细菌因其壁薄、肽聚糖含量低 和交联松散，用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔不易收缩， 加上其类脂含量高，乙醇把类脂溶解，在细胞壁上出 现较大缝隙，结晶紫与碘复合物极易被溶出细胞壁， 因此通过乙醇脱色后，细胞呈无色，再经沙黄等染料 复染后呈红色。
• 相差显微镜将光程差或相位差转换为振幅差，即明暗差别。 相差显微镜的样品不需染色，可以观察活细胞及细胞内的某 些细微结构。
– 光线通过不同密度的物质时，其滞留程度也不同，密度大则光的滞留 时间长，密度小则滞留时间短。
3. 荧光显微镜技术
(fluorescence microscopy)
• 仪器：点光源（高压汞灯），滤色系统 • 原理：荧光物质，激发光，发射光
染色法：观察细胞细致形态和主要构造。
→→→→ →→
1.简单染色法
• 简单染色法：只用一种染料处理菌体，适用于一般观察。
涂 干片 燥
干 镜燥 检
固 定
染 色
水 洗
革兰氏染色法
• 革兰氏染色法：由丹麦医生C.Gram于1884年创立，其基本操作分为 初染、媒染、脱色和复染四个步骤。
甲菌 乙菌
初染 结晶紫
电子显微镜与普通光学显微镜的基本区别
光学显微镜
分辨本领 光源
200nm
可见光
(λ:400-700nm)
100nm 紫外光
(λ约200nm)
透镜 玻璃透镜
玻璃透镜
真空 不要求
不要求
成像系统 利用样品对光的吸收形 成明暗反差和颜色变化
电子显微镜
约0.1nm
电子束 (λ:0.01~0.9nm)
电磁透镜
1.33×10-5~ 利用样品对电子的散 1.33×10-3Pa 射和透射形成明暗反