特殊细菌药敏试验规范化操作系列
药敏试验的步骤
药敏试验的步骤药敏试验药敏纸片法药敏纸片法是最常用的一种试验方法,能直接体现出抗菌药物的抗菌效用,其优点是：直观明显,对比鲜明，有一定的实验依据。
缺点是：仅表现体外抗菌效果,由于抗菌药物在体内受体液环境,代谢分布,组织扩散浓度,半衰期等因素的影响,个别药物并不能真实反应出实际的抗菌疗效。
下面介绍抗菌药物的药敏纸片法。
试验材料经分离和鉴定后的纯培养菌株(例如大肠杆菌、链球菌等),营养肉汤,琼脂平皿,棉拭子,镊子,酒精灯, 药敏纸片若干。
1.1药敏纸片的制作方法将要试验的抗菌药物按其有效浓度稀释成1mL备用，脂溶性的抗菌药物使用乙醇或丙酮溶解。
用打孔器将滤纸打成6mm直径的圆片100张高压灭菌，加入到抗菌药物有效浓度1mL稀释液中充分混合，阴凉处干燥备用。
多种联合的抗菌药物制剂以其成分中某种含量最高的抗菌药物为标准稀释成有效浓度。
抗菌中草药药敏纸片的制作：取中草药粉剂1g加适量的水充分浸泡煮沸，滤液浓缩成1mL，也加入100张纸片干燥备用。
1.2药敏试验的操作步骤1.2.1 取自然发病动物的病料心血、脾、肝脏、淋巴结或病变明显的组织无菌操作接种鉴别培养基37℃分离培养24h，选典型菌落备用。
1.2.2 将病料中分离出的病原菌用密集划线法或涂布法接种至专用琼脂平板培养基上，均匀的粘贴各药敏纸片，并记录每种抗菌药物药敏纸片的位置。
1.2.3 37℃培养12～18h，取出观察结果。
1.3判定结果1.3.1 量取各药敏纸片抑菌直径大小，并仔细观察抑菌圈的清晰度,通常直径小于10mm的判为该抗菌药物为低度敏感,10～15mm之间为中度敏感，15～25mm为高度敏感，25mm以上为极度敏感。
1.3.2 抑菌圈边缘分界清晰，内部洁净透明,说明该抗菌药物作用迅速，多半为杀菌剂；边缘十分清晰，内部朦胧说明该抗菌药物可能是慢效抑菌剂或有耐药的产生，或分解较快维持抗菌时间短。
1.3.3 抑菌圈中分层次形成同心年轮样，说明可能是联合使用抗菌药物或该抗菌药物失效过快或细菌产生了耐药性。
药敏试验操作方法
药敏试验操作方法
药敏试验操作方法一般包括以下步骤：
1. 菌株选取：选择适当的病原菌株进行测试，一般使用已知药敏性的参比菌株作为对照。
2. 菌液的制备：将菌株接种到培养基上培养，培养至菌量合适后，采用生理盐水调制成适宜浓度的菌悬液。
3. 菌液的稀释：取一定数量的菌悬液，根据草浆法或直接法进行适当稀释，使菌量达到目标细菌的浓度，一般为0.5-2×10^8个CFU/mL。
4. 抗生素的制备：按照制备好的抗生素试纸或试剂盒的说明，将抗生素溶液或药片溶解成合适浓度的抗生素溶液。
5. 稀释菌液的扩散：将已制备好的菌液均匀涂布在含有良好的抗生素稀释浓度梯度的培养基上。
6. 培养基的培养：将涂布了菌液的培养基在合适的温度（通常为35-37）下培养约16-20小时。
7. 结果的解读：通过观察培养基上微生物的生长情况，判断细菌对抗生素的敏
感性。
一般，对抗生素敏感细菌培养后，会在培养基上形成清晰的抑菌圈，直径会随着对菌体敏感程度的增加而扩大。
8. 数据记录和分析：记录抗生素的名称、浓度、菌株信息、抗菌圈直径等数据，并进行统计和分析。
需要注意的是，药敏试验的具体操作方法可能会因实验目的、试验样本、试剂等因素而有所不同，因此在进行药敏试验前应详细阅读试剂盒或试纸的使用说明，并按照说明书操作。
药敏试验操作方法
药敏试验操作方法药敏试验是一种常用的实验方法，用于确定某种药物对细菌的敏感性或抗性。
下面是药敏试验的一般操作方法：1. 菌株的培养与准备：首先，选择要测试的细菌株。
常用的菌株包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等。
将菌株从冻存状态中转移到琼脂平板上进行培养，然后选取单个菌落进行继续培养。
2. 制备药物浓度梯度：为了测试细菌对不同浓度药物的敏感性，需要制备一系列药物浓度梯度。
可以选择常用的抗生素，如青霉素、利福平等。
根据药物的最小抑菌浓度（MIC）确定所需药物的最高浓度。
3. 制备洗涤液：制备1倍洗涤液，一般使用生理盐水或缓冲液。
如要进行中药药敏试验，可根据实验需求选择适当的提取液。
4. 制备菌悬液：从培养得到的菌落中选择单个菌落，接种到含有洗涤液的试管或培养皿中。
使用比例约为1:100（菌悬液：洗涤液），均匀混合。
5. 药物与细菌接触：将制备好的菌悬液均匀涂布在琼脂平板上，然后使用定量器将一定量的药物滴在琼脂平板上。
确定滴药量时应根据具体药物的MIC进行调整。
6. 培养与观察结果：将涂有菌悬液和药物的琼脂平板进行孵育，时间和温度可以根据具体的实验目的和菌株要求进行调整。
观察培养后的平板上是否出现菌落生长，以及菌落的数量和形态特征。
7. 结果解读与分析：根据观察到的结果，分析不同浓度药物对细菌的抑菌效果，评估细菌对药物的敏感性。
可以根据菌落的出现与否、数量的多少和生长的形态特征来判断细菌是否对药物敏感。
总结：药敏试验是一种重要的实验方法，可以评估细菌对药物的敏感性或抗性。
操作时需要注意菌株的选择和培养方法、药物浓度的制备、菌悬液的制备和药物与细菌的接触方法，以及培养和观察结果等。
通过药敏试验的结果，可以帮助医生选择适当的药物治疗感染病情。
微生物检验实验室药物敏感性试验标准操作规程
微生物检验实验室药物敏感性试验标准操作规程1．目的规范药物敏感性试验标准操作规程，确保药敏结果准确。
2．原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后会不断的向纸片周围区域扩散，形成递减的浓度梯度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
3．试剂M-H培养基、无菌生理盐水、药敏纸片、无菌棉签、35℃孵育箱、标准比浊管或比浊仪。
4．质控4.1 常用细菌药敏质控标准菌株参见CLSI规定。
4.2 质控菌株每日随临床标本一起进行药敏试验，测定质控菌株的抑菌环。
质控菌株的抑菌环在允许范围之内，说明结果可信。
4.3 质控的频率由于纸片法药敏试验是很稳定的，在不失控的时候，可以每周作1～2次质控菌株的测定。
如果发现有失控的情况，就必须每日做1次，寻找失控的原因并予以纠正。
如果连续30日失控<3次的，可以恢复每周1次。
5.操作步骤5.1 挑取4～5个纯培养菌落，接种于3～5ml M-H肉汤（0.5麦氏单位）中，经35℃培养6～8h。
5.2 用无菌生理盐水或M-H肉汤校正菌液浊度，使其与标准比浊管的浓度相同。
5.3 用无菌棉拭蘸取校正过的菌液，在试管壁上挤压几次，压去多余的菌液，涂布整个M-H平板表面，再重复两次，每次旋转平板60°，使整个平板涂布均匀，最后用棉拭涂布平板四周缘一圈。
5.4 涂布菌液的平板于室温中干燥3～5分钟后，用纸片分配器或无菌镊子取药敏纸片，贴于平板表面，并用镊尖轻压一下纸片，使其贴平。
每张纸片的间距不小于24mm，纸片的中心距平板的边缘不小于15mm，直径90mm的平板宜贴6张药敏纸片。
5.5 将贴好纸片的平板置35℃孵育18～24小时后，用卡尺量取抑菌圈直径。
个别菌孵育温度，时间及条件应按照CLSI规定。
药敏实验的操作规程
药敏实验的操作规程
《药敏实验操作规程》
一、实验目的
本实验旨在测试不同药物对细菌的药敏性，为临床用药提供参考。
二、实验材料
1. 不同种类的药物
2. 革兰氏阳性细菌及革兰氏阴性细菌培养基
3. 培养皿、消毒酒精、移液器、离心机等常规实验器材
三、实验步骤
1. 将革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌分别分装于培养皿中，均匀涂布于培养基表面。
2. 在分装有不同药物的培养皿上分别滴加一定量的药物液体，确保液体能够均匀覆盖培养基表面。
3. 将处理好的培养皿置于恒温培养箱中，设置合适的温度和时间，培养细菌。
4. 观察培养皿上不同区域的细菌生长情况，记录并比较各种药物对细菌的影响。
四、实验注意事项
1. 操作过程需注意无菌操作，避免外界污染。
2. 按照实验要求使用药物，注意用药量和涂布均匀性。
3. 实验完成后，将培养皿和实验用具进行正确处理，避免对环境造成污染。
五、实验结论
通过对培养皿上不同区域的细菌生长情况观察和分析比较，得出不同药物对细菌的药敏性，并据此提供临床用药建议。
六、实验意义
药敏实验的结果对临床治疗中的抗菌药物选择，以及对细菌感染病症的诊断和预防具有重要的指导意义。
以上为《药敏实验操作规程》，希望实验者严格按照规程操作，确保实验结果的准确性和可靠性。
药敏试验操作方法
欢迎共阅药敏试验操作方法药敏试验根据美国临床标准委员会（NCCLS）推荐的K-B琼脂法进行，药敏纸片选择中国生物制品鉴定所药敏纸片，试验所选择药物必须包括下列抗生素：氨苄西林（AMP），阿莫西林/克拉维酸（AMC），头孢噻吩（CFT），头孢噻肟（CTX），庆大霉素（GEN），萘啶酸（NAL），诺氟沙星（NOR），四环素（TBT），利福平（RFA），复方新喏明（SMZ）。
1 操作方法：(1)将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养16～18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3ml生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。
以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。
(2)用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液。
用棉拭子涂布整个M-H培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。
(3)待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。
用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴就不可再拿起。
每个平板贴5张纸片，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。
在菌接种后15分钟内贴完纸片。
(4)将平板反转，孵育18～24小时后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录（附表5）。
抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。
有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。
结果判断依据鉴定所药敏纸片判定标准。
2 注意事项：(1)制备MH琼脂平板应用直径90mm平皿，在水平的实验台上倾注。
琼脂厚为4±0.5mm （约25-30ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱烤干平皿表面水滴。
倾注平皿前应用pH计测pH值是否正确(pH应为7.3)。
pH过低会导致氨基糖苷类，大环内酯类失效，而青霉素活力增强。
(2) 药敏纸片长期储存应于－20℃，日常使用的小量纸片可放在4℃，但应至于含干燥剂的密封容器内。
抗菌药物敏感性试验执行标准
抗菌药物敏感性试验执行标准抗菌药物敏感性试验是临床微生物学中非常重要的一项实验，它可以帮助医生选择最有效的抗菌药物来治疗感染性疾病。
执行标准的严格性和准确性对于试验结果的可靠性至关重要。
下面将介绍抗菌药物敏感性试验执行标准的相关内容。
首先，进行抗菌药物敏感性试验前，需要准备好所需的培养基、试验材料和各种试剂。
同时，要做好实验室的消毒和无菌操作，以确保试验的准确性和可靠性。
在进行试验时，需要按照严格的操作规程进行。
首先，要准备好待测菌株的悬浮液，然后按照一定比例将其接种到含有不同浓度抗菌药物的琼脂平板上。
接种后，要在恒温培养箱中进行培养，培养时间一般为16-18小时。
培养结束后，需要观察菌落的生长情况，并进行相关的数据记录和分析。
根据菌落的生长情况和抗菌药物的浓度，可以判断出菌株对抗菌药物的敏感性。
在记录和分析数据时，要注意细致入微，确保数据的准确性和可靠性。
在执行标准中，对试验结果的解释和判定也非常重要。
根据试验结果，可以判断出菌株对抗菌药物的敏感性、耐药性或者中间敏感性。
这些判定对于临床治疗具有指导意义，可以帮助医生选择最合适的抗菌药物来治疗感染性疾病。
此外，在执行标准中，还需要对试验过程中可能出现的干扰因素进行控制和排除。
比如，培养条件、试剂质量、操作技术等都可能对试验结果产生影响，需要在试验过程中进行严格的控制和调节。
总的来说，抗菌药物敏感性试验执行标准的严格性和准确性对于试验结果的可靠性至关重要。
在实验过程中，需要严格按照操作规程进行，确保试验过程的准确性和可靠性。
同时，对试验结果的解释和判定也非常重要，可以帮助医生选择最合适的抗菌药物来治疗感染性疾病。
在执行标准中，还需要对试验过程中可能出现的干扰因素进行控制和排除，以确保试验结果的准确性和可靠性。
抗生素药敏试验标准操作程序
抗生素药敏试验标准操作程序1规范药敏试验操作方法，保证药敏试验结果的准确、可靠。
22.12.1.1 制备接种菌液：用接种环挑取已分纯菌落，悬浮于生理盐水中，震荡混匀后与标准比浊管比浊 (0.5McFarland)，以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管相同。
2.1.2 接种平板：制备好的接种液必须在15分钟内使用。
用灭菌的棉拭子蘸取菌液，在管壁上旋转挤压，去掉多余菌液，用拭子涂布整个培养基表面(三个方向，每次将平板旋转 60 度，最后沿平皿周边绕两圈，保证均匀)。
2.1.3 贴纸片：半开平板的盖子，约 3~5 分钟(不可超过 15 分钟)，用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表面，用镊尖压一下，使其贴平，纸片一旦贴下就不可再拿起，因纸片中的药物已扩散到琼脂中。
每张纸片间距不少于 24mm，纸片中心距平皿边缘不少于 15 mm，或用纸片分配器按压。
2.1.4 孵育： 35℃孵箱孵育 18-24 小时后，读取结果。
2.1.5 判定结果：培养后取出平板，测量抑菌环的直径，根据 CLSI 标准判读结果。
2.1.6 质控程序见《微生物室室内质控操作程序》。
2.22.2.1 将鉴定/药敏板放在加样盘上。
2.2.2 在鉴定/药敏板上标记标本信息。
2.2.3 将 broth 试管放置在加样盘上; ID broth 放在左边；AST broth 放在右边。
2.2.4 用 ID broth 配置 0.5 McFarland 菌悬液。
a) 使用无菌棉签挑取菌落至 ID broth；b) 混匀 5 seconds.等待 10 seconds 使气泡消失；c) 使用 PhoenixSpec TM 比浊仪调整菌液浓度 (以 0.45-0.55 McFarland 为佳)。
2.2.5 在 AST broth 中垂直滴加一滴 AST indicator solution。
2.2.6 从 ID broth 中转移25µl 菌悬液至 AST broth，颠倒混匀，请勿震荡。
TDR-300系列操作规程
1 目的制定标准化的天地人TDR-300系列自动细菌鉴定及药敏测试仪操作规程，保证仪器的正常使用2 仪器简介天地人TDR-300系列自动细菌鉴定及药敏测试仪可用于细菌的鉴定和体外抗生素的药敏监测，测定采用天地人试验用的微量检测板，该板内含有培养基、生化试验及相应抗生素。
天地人TDR-300系列自动细菌鉴定及药敏测试仪重复性好、节省操作时间、结果稳定可靠，使实验室的操作达到标准化。
3 原理3.1、细菌鉴定原理TDR鉴定系统运用TDR专利（ZL97 107902.1）“双歧—矩阵法”精选试验组成最佳鉴定性状组合，采用新颖的不确定试验方法计算百分概率鉴定细菌结果，可鉴定葡萄球菌、肠球菌、链球菌、奈瑟菌/嗜血杆菌、肠杆菌科、弧菌科、芽孢杆菌、棒状杆菌、非发酵菌、酵母样真菌及厌氧菌在内的细菌。
3.2、药敏试验原理采用CLSI推荐的“微量肉汤稀释法”进行药敏试验，分别检测药物的敏感性及MIC值，并通过智能专家分析软件处理后得出报告结果，并提出合理的专家评价。
4 试剂4.1 生化反应试剂包括吲哚试剂、PD试剂、VP试剂、硝酸盐试剂、马尿酸盐试剂、淀粉酶试剂、糖氧化催化剂、同化试验稳定剂，均为天地人公司配套辅助试剂，0-4℃保存，有效期内使用4.2 试验卡及其配套试剂各类试验卡及其生化.药敏培养液等均为天地人公司辅助试剂，0-4℃保存，有效期内使用5 仪器操作步骤5.1 开机前检查5.1.1 电源是否连接好，主机、显示器电源是否连接。
5.1.2 检查打印机是否连接好，打印纸是否安装好。
5.1.3 仪器台面干净、无污物。
5.2 开机5.2.1 打开主机电源，启动操作系统；在显示器上打开显示器电源；5.2.2 打开仪器面板的分析判读电源开关；使判读装置自检复位。
5.2.3 打开打印机电源。
5.2.4 双击桌面“天地人微生物分析系统”，进入微生物分析系统。
6 患者信息录入6.1 在启动选择界面选择“细菌.酵母样真菌鉴定”进入“被检者资料”，点击“增加”，录入患者资料，输完后点“保存”；6.2如保存患者资料后，发现输入有误，可点“修改”，修改资料；6.3 注意送检日期以化验单上日期为准；6.4 如需查询以前患者的资料，在“被检者资料”的“搜索”处，可以任一条件查询。
药敏试验的操作方法
药敏试验的操作方法
药物敏感性试验是一种常用的药物敏感性检测方法，它可以评估不同药物对细菌的杀菌效果。
操作步骤如下：
1. 准备培养基：根据实验需要选择适宜的培养基，如Mueller-Hinton琼脂培养基等，并按照说明书的要求制备好培养基。
2. 细菌的孵育：将需要测试的细菌株均匀涂布在琼脂培养基的表面上，然后在37C下孵育24小时，使得菌落生长。
3. 制备药物试验片：将需要测试的药物稀释成不同浓度的溶液，通常是2倍稀释系列。
将药物溶液滴在试验片上。
4. 放置试验片：将制备好的试验片放置在含有菌落的琼脂培养板上，并轻轻压平，使得药物溶液能够与细菌接触。
5. 孵育试验片：将装有试验片的琼脂培养板置于37C下孵育24小时，使得细菌在药物的作用下生长或者抑制生长。
6. 结果的观察和解读：观察试验片上细菌的生长情况，根据细菌对药物的敏感性判断药物的杀菌效果。
常用的评估标准是观察试验片上出现最低抑菌浓度（MIC）。
7. 数据记录和分析：将观察到的结果记录下来，并根据试验片上出现的细菌生长情况分析药物的抗菌活性。
值得注意的是，药物敏感性试验只是一种体外实验，并不能完全代表细菌在体内的敏感性。
因此，对于真实应用中的治疗选择，还需要综合考虑其他因素，并结合临床实践进行判断。
药敏试验程序及步骤
药敏试验程序及步骤微生物标本的采集通常有血液、脑脊液、尿液、伤口的脓液、胸水腹水、粪便、痰液及泌尿生殖系统的分泌物。
1）采集的一般原则：a早期采集b 无菌采集注意对局部及周围皮肤的消毒，渎道底部采集的标本（外通道）正常菌群寄生部位采集的标本应明确目的菌，采用选择培养基。
C 不同菌不同采集方法D 采集适量标本，量不应过少，注意采集不同时间不同部位标本，要全面有特征E 安全采集2）标本处理2h送到检验处，部分菌应保温于一定环境中保存注意安全尤其对烈性传染病。
有时可以直接用抽取标本的注射器如尸检组织、支气管洗液、心包液、痰、尿等标本要保存于4℃环境中，脑脊液保存于25℃3）各部位标本的采集及注意事项A 血液皮肤消毒采血部位采血量采血次数采血时间不同动物有所不同血液应马上送检室温保存不可冷藏。
配置的培养基血液和肉汤比为1：5～1：10血液中常见的病原体引起的疾病有葡萄球菌菌血症，肠球菌菌血症、革兰隐性杆菌、厌氧菌菌血症真菌血症。
B 脑脊液采集脑脊液一般用腰椎穿刺术获得。
采集后立即送检，一般不要超过1h，避免凝固和混入血液一般取3～5ml 35度保温送检不可至于冰箱保存做病毒检查时应放置冰块4度保存72h常见细菌性脑膜炎如流行性脑脊髓膜炎肺炎球菌脑膜炎，链球菌脑膜炎等真菌性脑膜炎常见隐球菌脑膜炎假丝酵母菌脑膜炎等特别是免疫功能低下和恶性疾病患者易并发。
如AIDS恶性肿瘤严重糖尿病等流行性乙型脑炎是一种人兽共患病肠道病毒可见多种病毒引起脑膜炎和肺炎c 脓液标本的采集首先用无菌生理盐水清洗脓液及病灶的杂菌，在采集标本，用针和注射器抽吸采取，再移入无菌容器立即送检也可用拭子在伤口深部采集渗出物，对于皮肤或下表皮的散播性感染，应采集病灶出边缘而非中央处的感染组织送检。
药敏试验操作
药敏试验操作实验步骤一、实验材料普通营养琼脂培养基：可去生化试剂店购买，做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基，如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦康凯培养基。
做沙门氏菌可选择血清培养基。
药敏试纸：购买或自制（详见实验准备）细菌：待做药敏试验的细菌仪器：接种环、酒精灯、打孔器、牛津杯、移液器、滴头二、实验准备2.1药敏片的准备：购买或自制2.1.1制备方法：取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。
取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。
经15磅15-20分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。
2.1.2抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。
同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。
切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期3-6个月。
2.2药液的制备（用于商品药的试验）：按商品药的使用治疗量的比例配制药液；如商品药百病消按其说明量治疗量0.01%饮水，可按这个比例配制药液，可取10毫克加入10毫升的水中混匀。
此稀释液即为用于做药敏试验的药液。
三、实验操作方法3.1药敏片法3.1.1在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。
具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。
然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。
（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。
要求涂布均匀致密）3.1.2将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。
为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。
为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要记住。
药敏试验的操作方法及注意事项
药敏试验的操作方法及注意事项
（1）M-H平板的制备：将在约56℃恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为90mm的平板，其厚度4mm。
（2）比浊管的配置：0.5麦氏比浊管的配置：取0.048mol/L的氯化钡溶液（1.175%w/v，BaCl2•2H2O）0.5ml，加至99.5ml0.18mol/L的硫酸溶液（1%v/v）中，不断搅拌使成混悬液。
取4～6ml硫酸钡混悬液，置与稀释菌悬液相同规格的具塞试管中，密封，室温避光保存。
（3）菌液的制备：A 肉汤法：无菌挑取菌落于MH肉汤中，摇菌2-6h；B 直接法：无菌挑取4-5个菌落于PBS中，混匀。
（4）比浊：将制备好的菌液与比浊液管置比色卡上对着光源比较，适当情况下可用无菌生理盐水或肉汤稀释菌悬液，使两者浊度一致，即菌悬液的浓度为0.5标准麦氏单位。
（5）涂菌：用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多的菌液。
棉签在三个方向均匀抹琼脂表面（每次转60℃）最后沿平板内缘涂抹一周，使菌液均匀分布。
（6）贴药敏片：用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂的表面，一旦纸片贴上，不能移动；一般一个平皿贴5-6个药敏片。
（7）培养：一般细菌：37℃培养16～18h；流感和副流感嗜血杆菌：5%CO2 37℃16-18h。
（8）用游标卡尺取抑菌环直径，根据CLSI标准。
判断待测菌对抗生素是敏感，中介还是耐药，选择敏感药物进行疾病治疗。
中介是一个缓冲区，若无敏感药物可提高中介药物的浓度来使用。
临床各种属细菌的药敏试验方法和试验条件
临床各种属细菌的药敏试验方法和试验条件1.采用自动化仪器法和梯度扩散法等进行药敏试验需遵照厂家说明书。
自动化仪器法通常只能用于常见细菌，而梯度扩散法可用于苛养菌和少见菌的药敏试验，但需要获得相关管理部门的批件。
2.检测达托霉素时，培养基加入50 mg/L的钙离子；检测磷霉素时，加入25 mg/L的6-磷酸葡萄糖；检测达巴万星和奥利万星时，加入0.002%的聚山梨醇酯-80。
3.纸片扩散法、琼脂稀释法和肉汤稀释法检测苯唑西林和万古霉素的敏感性宜孵育24 h。
纸片扩散法检测头孢西丁的敏感性和凝固酶阴性葡萄球菌对所有抗菌药物的敏感性孵育24 h。
4.检测葡萄球菌属对苯唑西林的敏感性，须在CAMHB加入2%NaCl。
5.嗜血杆菌属若检测甲氧苄啶或磺胺甲噁唑，培养基中加入0.2 IU胸苷磷酸化酶。
HTM 肉汤为CAMHB中加入15 mg/L的β-NAD、15 mg/L的牛血红素或猪血红素、5 g/L的酵母提取物。
6.淋病奈瑟菌可采用CAMHB或pH7.0 的0.9%的磷酸盐缓冲液配制菌悬液。
纸片扩散法1%的特定生长添加剂不宜含半胱氨酸；琼脂稀释法检测碳青霉烯类和克拉维酸时宜含半胱氨酸；检测其他抗菌药物，是否含有半胱氨酸对检测结果影响不大。
特定生长添加剂配制方法如下：将1.1 g左旋胱氨酸、0.03 g盐酸鸟嘌呤、0.003 g盐酸硫胺素、0.013 g对氨基苯甲酸、0.01 g维生素B12、0.1 g焦磷酸硫胺素、0.25 gNAD、1 g腺嘌呤、10 g左旋谷氨酰胺、100 g葡萄糖、0.02 g硝酸铁和25.9 g左旋半胱氨酸溶于1L无菌去离子水中，搅拌混匀。
7.嗜盐弧菌属采用0.85%NaCl溶液制备0.5 麦氏单位标准菌悬液。
8.幽门螺杆菌采用0.85%NaCl溶液配制成2.0 麦氏浊度单位菌悬液。
9.潜在生物恐怖病原菌送至生物安全II级BSL-2 以上的实验室进行操作。
对极易产生气溶胶的操作在BSL-3 实验室进行。
药敏试验操作方法
药敏试验操作方法药物敏感性试验是一种常见的实验方法，用于评估药物对细菌或其他微生物的敏感性。
下面我将详细介绍药敏试验的操作方法。
一、实验仪器和试剂准备1. 培养基：根据要测试的细菌种类选择相应的培养基，并按照说明书配制。
2. 抗生素：根据实验需求选择合适的抗生素。
可以是已知的抗生素，也可以是待测的新药物。
3. 细菌悬浮液：从培养物中挑取单一菌落，转接到培养基中培养一夜，然后取一定量的细菌悬浮液用生理盐水调制。
二、药敏试验步骤1. 稀释菌悬液：将细菌悬液稀释至适宜浓度，通常为0.5 McFarland 标准浓度，以确保实验准确性。
2. 制备琼脂平板：将培养基煎化至液态，待温度降至45-50时加入相应抗生素浓度，快速混合后倒入培养皿中。
3. 扩展细菌：将含有药物的琼脂平板倒扣在灭菌台上，用细菌悬液均匀涂抹在琼脂平板表面上。
4. 培养和观察：将培养皿放入恒温培养箱中，在适宜的温度下培养一段时间，通常为18-24小时。
培养结束后，观察菌落生长情况，并记录结果。
5. 结果解读：根据菌落的生长情况和直径大小，判断细菌对药物的敏感性。
通常，抗生素有效抑制菌落生长的区域称为抑制圈，其直径大小与药物对细菌的抑菌效果相关。
- 抗生素敏感（S）：抑制圈直径大于抗生素的最低抑菌浓度（MIC）；- 中度敏感（I）：抑制圈直径仅略大于MIC；- 抗生素耐药（R）：抑制圈直径小于MIC。
6. 结果记录和分析：将对应的药敏结果记录下来，并进行案例分析和数据统计。
7. 实验验证：如果需要，可以对少数样本进行二次验证以确保结果的准确性。
三、注意事项和常见问题1. 实验操作要严格遵守无菌技术，以防止外界细菌的污染。
2. 实验室工作人员应佩戴适当的个人防护装备，如实验手套、口罩等。
3. 实验仪器和试剂要经过严格的消毒和无菌处理。
4. 抗生素的选择要与实验目的和细菌种类相匹配，避免选择不当的抗生素。
5. 实验结束后，应正确处置培养皿和含有抗生素的废弃物，以避免对环境造成污染。
细菌药敏试验
细菌药敏试验实训细菌的药物敏感性试验教学⽬标使学⽣掌握细菌药物敏感性试验的操作⽅法，能够利⽤本试验⽅法选择敏感药物治疗兽医临床常见的细菌性传染病。
材料准备1．器材：温箱、天平、打孔机、滤纸、⽆菌试管及吸管、镊⼦、接种环、酒精灯等。
2．试剂：蒸馏⽔。
3．培养基：普通琼脂平板。
4．菌种：⾦黄⾊葡萄球菌及⼤肠杆菌的固体培养物。
5．药品：链霉素、⾦霉素、新霉素、红霉素等抗菌药物。
6．硫酸钡标准管：取1%~1.5%氯化钡0.5ml加1%硫酸溶液99.5ml，充分混匀即成，⽤前充分振荡。
⽅法步骤将抗菌药物置于接种待检菌的固体培养基上，抗菌药物通过向培养基内的扩散，抑制敏感细菌的⽣长，从⽽出现抑菌环。
由于药物扩散的距离越远，达到该距离的药物浓度越低，由此可根据抑菌环的⼤⼩，判定细菌对药物的敏感度。
（⼀）含药纸⽚的制备1．滤纸⽚最好选⽤新华1号定性滤纸，⽤打孔机打成直径6mm的滤纸⽚，放在⼩瓶中或平⽫中，在121.3℃灭菌15min，再置100℃⼲燥箱内烘⼲备⽤。
2．药液的配制⽤⽆菌蒸馏⽔将各药稀释成以下浓度：磺胺100mg/ml、青霉素100IU/ml、链霉素、⾦霉素、新霉素、红霉素、多粘菌素1000µg/ml。
3．含药纸⽚的制备将灭菌的滤纸⽚⽤⽆菌的镊⼦摊布于灭菌平⽫中，按每张滤纸⽚饱和吸⽔量为0.01ml计算，50张滤纸⽚加⼊药液0.5ml。
要不时翻动，使纸⽚充分吸收药液，浸泡1~2h后于37℃温箱中烘⼲备⽤。
对青霉素、⾦霉素纸⽚的⼲燥宜采⽤低温真空⼲燥法，⼲燥后⽴即放⼊瓶中加塞，放⼲燥器内或置-20℃冰箱中保存。
纸⽚的有效期⼀般为4~6个⽉。
（⼆）测验⽅法1．钩取⾦黄⾊葡萄球菌和⼤肠杆菌菌落各4~5个，分别接种于⾁汤培养基中，37℃培养4~6h。
2．⽤灭菌⽣理盐⽔稀释培养菌液，使其浊度相当于硫酸钡标准管。
装有以上两种成分的试管须相同，硫酸钡应⽤前需充分振动。
3．⽤⽆菌棉拭⼦蘸取上述⾁汤培养液，在试管壁上挤压除去多余的液体，在琼脂培养基表⾯均匀涂抹。
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特殊细菌药敏试验的规范化操作一、目前我国细菌药敏试验现状20年以来，我国在卫生部和各地临床检验中心和检验学会的共同努力下引进CLSI药敏系列标准，使全国微生物实验室能在同一标准下进行质量控制活动。
当前，微生物实验室对常见临床分离细菌的药物敏感试验的水平已有了显著的提高，但对特殊细菌的药敏试验的各个环节的规范操作还不能得到普及，对目前还无折点的细菌能否做药敏试验，以及如何判断细菌的药物敏感和耐药，仍然概念模糊，有待进一步规范和普及。
目前常见错误做法：（一）铜绿假单孢菌的药敏判断标准用于其他非发酵细菌；嗜血杆菌的标准用于卡他莫拉菌等的错误做法时有发生。
（二）借用同属细菌敏感标准（三）借用同类抗生素的敏感标准二、各菌属的药物敏感性报告及试验方法的CLSI药敏标准（一）“嗜麦芽”菌属药敏报告标准1.CLSI对“嗜麦芽”纸片药敏判断标准2.CLSI对“嗜麦芽”稀释法判断标准（二）无折点细菌的药物敏感试验报告1. 其他药物的敏感性报告: CLSI推荐的药物可以报告MIC值和敏感度（S、I、R），临床需要的其他药物的药敏试验报告可以直接报告MIC值但不报告S、I、R。
2. 不要用认为相近细菌的折点代替报告S、I、R，这会误导医生用药。
（三）洋葱伯克霍德菌的药物敏感试验1.CLSI 洋葱伯克霍德菌纸片法折点：2. CLSI洋葱伯克霍德菌稀释法折点：（1）氯霉素不常规报告结果,只有在尿路感染时分离的细菌才报告结果。
（2）在纸片法药敏中只允许报告表中4个药物的敏感性,对其他药物可用于临床治疗但还没有足够的研究建立纸片扩散的折点。
（四）莫拉菌属的药物敏感试验报告莫拉菌属至今尚无由CLSI颁布的标准操作方法和敏感性折点,该菌属是人体皮肤、黏膜、呼吸道正常细菌，很少会致病，有过报道的病例有该菌属引起的眼结膜炎、气管炎、肺炎、脑膜炎、脑脓肿、心包炎和心内膜炎。
实验室药敏报告只能报告MIC 值但不能报告敏感性。
文献报告的资料是推断性。
（五）金黄杆菌属的药敏试验报告脑膜败血性黄杆菌是最常见于临床标本，是条件致病菌，有文献报道的病例有新生儿脑膜炎，对成人很少致病，感染与插管有关。
CLSI未颁布标准操作方法和敏感折点，药敏试验可报告MIC值。
该菌属耐药特点：对氨基糖甙类、β-内酰胺类、四环素类、氯霉素类天然耐药；对治疗革兰阳性细菌药物利福平、红霉素、克林霉素、司帕沙星、复方新诺明和万古霉素敏感。
（六）丛毛菌属和食酸菌属的药敏试验推荐用肉汤稀释方法或E-test方法，报告MIC值，不适合用纸片药敏方法。
（七）产碱杆菌属、无色杆菌属和苍白杆菌属的药敏试验目前无药敏解释标准，建议采用稀释法药敏试验方法，报告MIC值，根据MIC和组织浓度判断敏感性。
1．粪产碱杆菌是产碱杆菌的代表株对氨苄西林、氨曲南和庆大霉素耐药。
2．木糖氧化无色杆菌木糖氧化亚种是临床常见的分离株，对氨苄西林、氨基糖甙类、非抗假单孢菌的头孢菌素、氟喹诺酮和氯霉素耐药，但对派拉西林、替卡西林/棒酸、亚胺陪南、复方新诺明及抗假单孢菌头孢菌素敏感。
3．人苍白杆菌是苍白杆菌属代表菌，对β-内酰胺类耐药，但对亚胺陪南、复方新诺明、氨基糖甙类、氟喹诺酮类和四环素敏感。
（八）布鲁杆菌属药敏试验不推荐做体外药敏试验，β-内酰胺类耐药和氟喹诺酮类有高的体外活性与临床疗效不一致。
热病推荐首选药物是多西环素加庆大霉素或链霉素。
（九）军团菌药敏试验目前无标准的试验方法和解释标准，肉汤稀释和E-test方法报告MIC值可作参考。
首选用药大环内脂类、喹诺酮类，对β-内酰胺类体外敏感但体内疗效差。
（十）弯曲菌科细菌的药敏试验1．弯曲菌科包括弯曲菌属、弓形菌属和螺菌属。
目前无解释标准。
CLSI M100-S16 2006年文件仅提供了质控菌株对部分抗生素的可接受范围和质量控制标准操作程序。
2．常寄生于人的牙周黏膜，可引起人胃肠炎和腹泻，胎儿弯曲菌可引起免疫低下患者菌血症。
热病推荐对空肠弯曲菌首选药物为红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、多西霉素和克林霉素。
幽门螺杆菌对克林霉素的折点是1ug/ml并与临床疗效一致，甲硝唑在体外敏感试验没有标准。
（十一）厌氧细菌的药敏试验由于大多数用于厌氧细菌感染的药物对临床有很好的预期效果，所以并不推荐做常规的厌氧菌药敏试验,但在严重厌氧菌感染而常规治疗疗效差的情况下有必要测定致病菌的MIC值,指导用药;在新药评价时需要做厌氧菌的药敏试验,用MIC值评价药效学。
随着厌氧细菌感染率的增长，厌氧细菌的耐药性也在不断增长，特别是脆弱拟杆菌已有报道对亚胺培南和甲硝唑的耐药株报道，几乎所有的脆弱拟杆菌均产生β-内酰胺酶，部分菌株产生超广谱β-内酰胺酶。
越来越多的梭杆菌产生β-内酰胺酶导致对β-内酰胺酶抗生素耐药。
（十二）真菌的药敏试验由于真菌药物敏感试验影响因素颇多，如真菌生长的速度、药物在体内的代谢、培养条件等，所以真菌药敏试验结果与疗效的一致性至今是本领域需要探讨的重要课题。
1.酵母样真菌药敏试验（1）酵母样真菌的药敏折点 1992年，NCCLS起草了《酵母菌的液体稀释法抗真菌药物敏感试验参考方案》文件名称为M-27P，用于检测引起深部感染的酵母样真菌，包括念珠菌、光滑球似酵母和新生隐球菌等菌对两新霉素-B（AmB）、5-氟胞嘧啶（5-FC）、氟康唑（FCZ）、伊曲康唑（ICZ）等的敏感性；1995年NCCLS对该草案作了修正，增加了微量稀释法起名为（M-27T）；1995-1997年NCCLS对终点判断方法进行了修定，形成了《酵母菌稀释法抗真菌药敏试验实施方案》（M-27A）；2002年NCCLS 统一了微量稀释法中24h和48h终点判断方法，增加了新的抗真菌泊沙抗唑（posaconazole）、雷夫康唑（ravuconazole）和伏力康唑（vuliconazole VCZ）的试验方法和MIC参照范围，并将该方案修定出版，名为M-27A2。
（2）CLSI对酵母样真菌现有的标准（3）CLSI对酵母样真菌纸片法判断标准2. 丝状真菌药敏试验（1）丝状真菌的药敏折点：初始方案产生于1998年，命名为M-38P，该方案包括微量稀释法和洪量稀释法，对曲霉菌、镰刀菌、波氏假阿利什曼等丝状真菌有较好的一致性；2003年NCCLS对某些最低抑菌浓度（MIC）判定方法及影响因素作了多中心的研究和修正，并增加了新三唑类药物的试验方案，从此产生了现在用于实验室药敏试验和新药评价的常规方法M-38A。
（2）丝状真菌药敏报告：CLSI颁布的M-38P是丝状真菌肉汤稀释法抗真菌药敏试验,内容并无丝状真菌敏感性折点，只是描述了测试方案，包括试剂配制、操作方法、质量控制等程序。
3．关于真菌药敏报告（1）Candida.Krusel(克柔假丝酵母)对氟康唑天然耐药,现已颁布的氟康唑对念珠菌的判断标准不适用，不管体外药敏结果均应报告耐药。
（2）AMB对念珠菌目前无判断标准。
（3）伊曲康唑的折点仅适用于黏膜念珠菌感染,对侵袭性感染时全身性用药并不适用，建议仅报告MIC不报告S、I和R。
（4）对5-FC现有的标准是基于联合用药情况下的敏感折点，如单独用药，该标准不适用。
（5）卡泊芬净至今无体内外相关性好和重见性稳定的药敏试验方法，至今无评定标准，但有报道可用MEC，即最低有效浓度（能使真菌形态发生改变的最低药物浓度），用于评价药物的有效性。
4．E-test方法适合哪些真菌的药敏试验E-test方法可适合多种真菌的药敏测试，包括酵母样真菌，如念珠菌、隐球菌状真菌，如曲霉菌、镰刀菌、毛霉菌、根霉菌、梨头霉、外瓶霉、帚霉等的药敏测试。
5.正确报告FUNGUS-3的规范方法（1）FUNGUS-3试条中氟胞嘧啶只有2个稀释浓度，一个高浓度，一个低浓度，报告以敏感度报告；（2）当两个浓度均有菌生长,并生长超过80%,报告耐药“R”。
（3）当高浓度真菌被抑制80%或以上,低浓度孔真菌完全生长或生长80%报告“SDD”。
（4）当两个浓度均无真菌生长报告敏感“S”。
（5）可通过肉眼判读或是使用ATB仪器自动判读来观察生长情况：肉眼判读前，建议把试条放在黑暗的背景下（可从bioMerieux得到ATB FUNGUS 3可视化判读器）。
对于每一个抗真菌制剂，从低浓度开始，与生长对照比较，在结果记录纸上记下每一个杯的生长得分。
（6）正确报告FUNGUS-3的药敏结果的方法：对于两性霉素B，最小抑菌浓度（MIC）是生长完全被抑制的测试杯的浓度（得分为“0”的测试杯）；对于氟康唑（FCA）, 伊曲康唑（ITR）和伏立康唑（VRC），鉴于可能存在拖尾生长，最小抑菌浓度（MIC）对应的测试杯得分可以是生长得分为“2”，“1”，或是“0”分。
需要注意的是：在杯状凹外围的生长迹象应记录为“0”或“1”分。
例ATB FUNGUS 2如下图三.MIC在真菌感染临床治疗中的指导意义在临床应用中，按日剂量与MIC比值大于50的剂量用于严重真菌感染，日剂量与MIC值比值为25的剂量用于一般真菌感染的原则被应用。
也有文献提示，临床实践证明当抗真菌药物MIC值大于2ug时，疗效差，死亡率高。
含MIC的真菌药敏报告对临床治疗更有价值。
（一）抗真菌药敏试验与临床的相关性ICZ法中MIC≤0.125ug/ml敏感，0.25-0.5ug/ml剂量依赖敏感，≥1.0ug/ml为耐药。
如给药400mg/d,MIC1.56ug/ml为耐药； MCZ治疗泌尿系统白念感染，如耐药，其MIC可上升100倍；KCZ治疗CMCC，白念如果耐药，对其他唑类可交叉耐药。
5-FC耐药的MIC为≥32ug/ml，敏感值为≤4ug/ml；AmB试验耐药菌株有白念、热带、葡萄牙念珠菌，MIC大于0.8ug/ml 可以死亡，NCCLS法不太适合。
但耐药一般为＞1.0ug/ml。
FCZ试验中一般剂量依赖耐药为16-32ug/ml，但64ug/ml即为耐药。
也可以说，组织药物浓度的测定是联系药敏试验和临床用药的桥梁。
以FLC为例：（二）体外抗真菌药敏试验与体内疗效的一致性NCCLS M27-A试验研究中：600余株念珠菌MIC值，分离自150余例AIDS的食管念珠菌病，一致性好；治疗失败者，MIC 值大于64 μg/ml，并显示MIC值与临床疗效成90-60原则，即：药敏试验敏感菌株：90%对治疗有效；药敏试验耐药菌株：60%对治疗有效（Mahmoud A.G, JCM 1996, 34:489-495；Rex J,CID 2002, 35: 982-989）。
体外抗真菌药敏试验指导用药，以FLC为例：（三）真菌药敏试验的应用原则当疾病为孤立的粘膜念珠菌病时，建议经验性治疗，不做药敏；当为复发的粘膜念珠菌病时，建议菌种鉴定，如果治疗失败应该考虑到药敏；当高危患者中念珠菌定植时，建议菌种鉴定，建立当地药敏试验流行病学资料，应该经验性治疗，当为念珠菌血症及深部感染时，建议鉴定，应用唑类药物时应该考虑药敏试验，并定期掌握当地药敏试验流行病学资料；当患者为深部感染需要延长治疗时，建议对所有菌株都测药敏（Hopenthal et al, Diagn Microb Infect Dis, 2004, 48:153-160）。