共聚焦显微镜

共聚焦显微镜

从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微镜[confocallaserscanningmicroscope(clsm或lscm)]在反射光的光路上加上了一块半反半透镜(dichroicmirror)，将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔(pinhole)的挡板，小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管

(photomultipliertube，pmt)。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。

激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有

划时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了

30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如ca2+、ph值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。能够进行活体细胞中离子和ph值变化研究（ratio），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（fish），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时pcr产物分析，荧光漂白恢复研究（frap），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和

三维重建等分析。

一.激光共聚焦显微镜系统应用领域：

涉及医学、动植物科研、生物化学、细菌学、细胞生物学、组织胚胎、食品科学、遗传、药理、生理、光学、病理、植物学、神经科学、海洋生物学、材料学、电子科学、力学、石油地质学、矿产学。

二.基本原理

传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管（pmt）或冷电耦器件（cd）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。

三.应用范围：

细胞形态学分析（观察细胞或组织内部微细结构，如：细胞内线粒体、内质网、高尔基体、微管、微丝、细胞桥、染色体等亚细胞结构的形态特征；半定量免疫荧光分析）；荧光原位杂交研究；基因定位研究及三维重建分析。

1.细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化

2.生物化学：酶、核酸、fish（荧光原位杂交）、受体分析

3.药理学：药物对细胞的作用及其动力学

4.生理学：膜受体、离子通道、细胞内离子含量、分布、动态

5.神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递、递质受体、离子内外流、神经组织结构、细胞分布

6.微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构

7.病理学及临床应用：活检标本诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病诊断、hiv等

8.遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断

四.激光共聚焦显微镜在医学领域中的应用a.在细胞及分子生物学中的应用1.细胞、组织的三维观察和定量测量2.活细胞生理信号的动态监测3.粘附细胞的分选4.细胞激光显微外科和光陷阱功能5.光漂白后的荧光恢复6.在细胞凋亡研究中的应用b.在神经科学中的应用

1.定量荧光测定

2.细胞内离子的测定

3.神经细胞的形态观察

c.在耳鼻喉科学中的应用

1.在内耳毛细胞亚细胞结构研究上的应用

2.激光扫描共聚焦显微镜的荧光测钙技术在内耳毛细胞研究中的应用

3.激光扫描共聚焦显微镜在内耳毛细胞离子通道研究上的应用

4.激光扫描共聚焦显微镜在嗅觉研究中的应用

d.在肿瘤研究中的应用

1.定量免疫荧光测定

2.细胞内离子分析

3.图像分析：肿瘤细胞的二维图像分析

4.三维重建e.激光扫描共聚焦显微镜在内分泌领域的应用1.细胞内钙离子的测定2.免疫荧光定位及免疫细胞化学研究3.细胞形态学研究：利用激光扫描共聚焦显微镜f.在血液病研究中的应用1.在血细胞形态及功能研究方面的应用

2.在细胞凋亡研究中的应用

g.在眼科研究中的应用

1.利用激光扫描共聚焦显微镜观察组织、细胞结构

2.集合特殊的荧光染色在活体上观察角膜外伤修复中细胞移行及成纤维细胞的出现

3.利用激光扫描共聚焦显微镜观察视网膜中视神经细胞的分布以及神经原的树枝状形态

4.三维重建

h.激光扫描共聚焦显微镜在肾脏病中的应用

可以系统观察正常人肾小球系膜细胞的断层扫描影像及三维立

体影像水平，使图像更加清晰，从计算机分析系统可从外观到内在结构，从平面到立体，从静态到动态，从形态到功能几个方面对系膜细胞的认识得到提高。共聚焦显微镜

基本原理

从一个点光源发射的探测光通过透镜聚焦到被观测物体上，如果物体恰在焦点上，那么反射光通过原透镜应当汇聚回到光源，这就是所谓的共聚焦，简称共焦。共焦显微镜在反射光的光路上加上了一块半反半透镜（dichroicmirror），将已经通过透镜的反射光折向其它方向，在其焦点上有一个带有针孔（pinhole），小孔就位于焦点处，挡板后面是一个光电倍增管（photomultipliertube，pmt）。可以想像，探测光焦点前后的反射光通过这一套共焦系统，必不能聚焦到小孔上，会被挡板挡住。于是光度计测量的就是焦点处的反射光强度。其意义是：通过移动透镜系统可以对一个半透明的物体进行三维扫描。这样