引物纯化方法介绍

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引物纯化方法介绍
1) RPC 纯化，它对DNA 有特异性的吸附，可以被有机溶液洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分，但是它不能有效去除比目的片段短的小片段。

这种方法处理的产物中虽然含有比目的片段少5'端一个或两个或多个碱基的产物，却一般不会对普通PCR 反应产生影响。

但是对于需要用于测序、用于克隆的引物不能使用这个级别。

2) OPC 柱纯化，OPC 柱中装有对DMT 具有亲和力的树脂，合成DNA 片段时保留5'端最后一个碱基上的DMT，所有合成产物吸附在O PC 柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有DMT 的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有DMT 的片段吸附能力弱，被洗脱。

然后用三氟乙酸TFA 或三氯乙酸TCA 脱去DMT 基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。

这种方法的优点是快速，简易。

但是其专一性吸附DMT 能力有限，不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。

特别是对长于25碱基以上的片段纯化效果不好。

3) HPLC 纯化，这是国外厂家常常使用的办法。

它是依据不同大小的片段带有的净荷多少来分离产物的。

合成粗产物中不同长度的DNA 片段决定了它带有不同的净电荷，较长的片段带有高电荷比带电荷低的短片段在离子交换柱中流动得慢。

先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。

它的优点是自动化程度高、省人力；缺点是纯化量小、不能纯化长片段(对于长于40碱基的片段，无法纯化)。

4) PAGE 纯化，几乎所有专业书籍上介绍的最佳纯化方法。

它是依据DNA 片段在变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时的迁移率不同来分离大小片段的。

由于各分子所带电荷和大小不同，综合影响其在凝胶中的迁移速度，大片段迁移得慢，经过一定时间的电泳，大小片段会分开，然后停止电泳，剥离凝胶，置于荧光TLC 板上在紫外灯下切割目的条带，浸泡碎胶，并从泡胶的盐溶液中回收目的DNA。

优点是纯化效果很好、尤其是纯化长链效果更好、而且是可以直观看见DNA 片段合成情况的质控环节。

通常认为的缺点是实验室水平的PAGE 纯化实验步骤多费人工、电泳及后处理过程样品损失量大、电泳装置局限或电泳时间如果不够会影响纯化效果。

但这些缺点完全可以克服。

我们通过扩大规模流水作业使实验过程便于掌握和节
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省人力；在粗样品中加入尿素饱和液增加样品比重减少电泳上样的损失；改用C18柱回收产物，使得回收效率大大提高；通过特制电泳装置，增加凝胶厚度和长度来增加负载量和分离效果等等。

所以我们一直使用PAGE 纯化方式保证合成产物的纯度。

为了保障后续实验，最好选用PAGE 纯化产品。