引物篇
引物相关知识点总结
引物相关知识点总结引物的选择引物的选择是PCR反应成功的关键之一，引物的选择会直接影响到PCR的特异性、敏感性和扩增效果。
引物的选择主要需要考虑以下几个方面：1. 引物的特异性引物必须与靶标的序列完全互补，不能与非靶标的序列发生杂交扩增。
因此，在选择引物时需要对靶标进行充分的序列比对，确保引物的特异性。
2. 引物的长度引物通常为20-25个核苷酸长，长度不宜太长或太短。
太短的引物可能导致杂交扩增，太长的引物会降低PCR的特异性。
3. 引物的G-C含量引物的G-C含量应在40%-60%之间，过高或过低的G-C含量都会影响引物的特异性和PCR扩增效果。
4. 引物之间的互补性引物之间的互补性要尽量避免，避免引物自身发生二聚体或多聚体，影响PCR扩增效果。
5. 引物的位置引物要尽可能选择在靶标序列内部，避免位于重复序列或其他非特异性区域，以提高PCR扩增的特异性。
6. 引物的富集引物的富集需要考虑引物之间的位置分布，避免引物聚集在同一区域，导致PCR扩增的偏倚性。
引物的设计引物的设计是引物选择之后的关键步骤，合理的引物设计能够提高PCR扩增的特异性和效率。
引物的设计主要需要考虑以下几个方面：1. 引物的序列比对在进行引物设计之前，需要对靶标进行充分的序列比对，确保引物与靶标的序列完全互补，具有良好的特异性。
2. 引物的避免区域在引物的设计过程中需要避开重复序列、低复杂度序列和其他非特异性区域，避免影响PCR扩增的特异性。
3. 引物的长度和G-C含量引物的长度和G-C含量需要根据靶标的序列特点进行合理设计，确保引物的特异性和PCR 扩增效果。
4. 引物的末端设计引物的末端设计需要尽量避免形成二聚体或多聚体，确保引物的稳定性和特异性。
5. 引物的交叉检验设计好的引物需要进行交叉检验，确保引物的特异性和效率。
引物的应用引物在分子生物学和生物技术领域有着广泛的应用，主要包括PCR、原位杂交、序列分析等。
下面将分别介绍引物在这些实验中的应用。
引物常识
引物的应用常识引物的原理引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。
因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。
这个3’-羟基由相配的引物提供。
在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA取代。
在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。
1. 不同实验要求的引物选择在开始设计引物之前，必须弄清以下几点：（1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等）（2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA）（3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假基因等）2.引物设计的重要因素有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。
引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。
引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。
目前生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus，•引物长度和专一性常见的引物长度为18-30个碱基。
短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。
较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。
同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。
•平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域引物的GC含量应介于40%～60%之间。
应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。
聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。
DNA的PCR引物设计
DNA的PCR引物设计PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
在PCR过程中，引物是至关重要的组成部分，它们在DNA两条链的特定位置结合，并指导聚合酶在该区域进行扩增。
正确设计引物对PCR的成功非常重要，本文将介绍PCR引物设计的原理和方法。
PCR引物设计的原理主要基于下面几个方面：1.引物长度：合适的引物长度通常为18-30个碱基对，较长的引物可以提高特异性，但也容易产生不特异扩增的产物。
2.引物Tm值：引物的熔点（Tm值）是在PCR反应中引物和目标DNA 的解离温度。
通常，引物的Tm值应在58-62℃之间，以保证合适的结合和扩增。
3.引物序列：引物的序列应具有足够的特异性，以确保只扩增目标DNA片段。
在设计引物时，应避免引物之间的序列重复和互补。
PCR引物设计的方法主要包括以下几个步骤：1.目标序列选择：根据实验需求选择要扩增的目标DNA序列。
目标序列的长度和特异性对引物设计至关重要。
2. 引物设计软件：使用专业的引物设计软件进行引物设计。
常见的软件包括Primer3、OligoAnalyzer和NCBI Primer-BLAST等。
这些软件可以根据给定的目标序列自动生成一对合适的引物。
3.引物特异性检验：在引物设计后，应使用引物特异性检验工具检查引物与非目标DNA序列的匹配情况。
这可以帮助排除潜在的不特异扩增。
4.多重引物设计（可选）：有时候，为了提高PCR扩增的特异性和准确性，可以设计多重引物。
多重引物PCR可以同时扩增多个目标DNA片段，但需要更复杂的优化和验证。
5.引物合成：设计好的引物可以通过合成方法获得，通常可以通过商业化的DNA合成公司进行合成。
此外，还有一些其他的PCR优化技术也可以用于引物设计：1.引物修饰：引物修饰可以改变引物的性质，如增加引物的特异性或稳定性。
例如，在引物的末端加入磷酸基团或胺基基团可以增加引物的特异性。
2.引物标记：引物标记可以用于追踪PCR扩增产物或使用其他技术进行进一步分析。
引物相关知识点总结大全
引物相关知识点总结大全一、引物的概念引物是指用于核酸杂交、PCR、定量PCR、DNA测序以及RNA分子的反向转录（RT）等实验技术中的一种短链DNA或RNA，通常是15-30个核苷酸的长度。
引物的主要作用是与目标序列中的互补序列形成双链结构，从而引发特定的生物学反应。
在实验室中，引物通常由合成核酸技术制备而成。
二、引物的分类根据引物作用的目标序列不同，引物可分为DNA引物和RNA引物两种。
DNA引物主要用于PCR、序列特异性分析等实验中，而RNA引物则主要用于RT-PCR等实验技术中。
根据引物的长度和作用位置不同，引物可以分为引导引物和扩增引物。
引导引物通常用于核酸杂交、PCR等实验中，用于可选择的结合目标序列，一般长度为15-30个碱基。
扩增引物则主要用于PCR实验中，其长度和序列将直接影响到PCR扩增的结果。
三、引物的设计原则1. 引物的互补性：DNA引物或RNA引物与待扩增的目标序列的互补性是引物设计的基本原则，引物与目标序列要求完全互补，并且在同一温度下具有相似的Tm值。
2. 避免引物二聚体和含量：引物的设计应避免引物自身的二聚体和寡聚体的产生，并且要避免引物的富含量，以提高PCR扩增的效率和特异性。
3. 引物的特异性：引物的设计要求尽量确保引物特异性，即引物只与目标序列特异性结合，不与其他非靶标序列结合。
4. 引物长度和GC含量：引物的长度和GC含量对PCR扩增的特异性和效率有一定的影响，一般长度在18-25个碱基，GC含量在40-60%之间。
5. 引物的5’端末修饰：引物的5’端末修饰，如磷酸化和生物素化等，可以增强引物与酶和材料的连接性和稳定性。
四、引物的应用引物作为实验室技术中的重要工具，在许多生物学实验中都扮演着重要的角色。
其主要应用包括：1. PCR扩增：PCR扩增是引物最常见的应用之一，引物特异性与目标序列的互补性可以实现PCR扩增特定基因或序列。
2. DNA测序：引物也常用于DNA测序技术中，引物和DNA降解酶一起作用可以在酶刻蚀DNA链的末端，并且通过引物的特异性与酶反应的DNA片段在随后的扩增和测序中得到全面和特异性的测序结果。
qPCR 引物篇(7)-----BIOTN引物现货查询
BIOTN引物现货查询
BioTNT本公司拥有数十年的PCR引物设计和筛选经验，有大批量可以直接进行实验的引物对，种属涉及人，大鼠，小鼠，兔，豚鼠，羊，猪等。
现货引物具有以下优点：经过上千次实验验证，客户拿到上手就可以直接进行正式实验，缩短了实验周期；严格的质量把控，特异性好，在引物设计参数尽量均一化，使不同的基因能够在同一条件进行实验。
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常用内参基因：b-actin，GAPDH，18sRNA，
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miRNA cDNA第一链合成试剂盒： A2010B0B04 120T
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血清/血浆样本中microRNA抽提：miRNeasy Serum/Plasma Kit（50）217184。
qPCR引物篇（5）BioTNTmRNA引物筛选，引物定制或specificprimer..
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引物知识点总结
引物知识点总结引物是生物技术和分子生物学研究中常用的一种技术手段，它在DNA复制、DNA测序、PCR扩增、基因克隆等方面起着关键的作用。
引物通常是一段单链核酸分子，它能够与目标DNA序列特异性结合，并作为起始点进行DNA复制、PCR扩增等。
在引物设计和使用过程中，需要考虑引物的长度、序列特异性、GC含量、Tm值等因素，以确保引物的特异性和效率。
本文将对引物的相关知识点进行总结，包括引物的设计原则、引物的特异性、引物的长度和GC含量对PCR扩增的影响、引物的Tm值计算方法、引物的修饰和标记等内容。
1. 引物的设计原则引物的设计是进行PCR扩增、DNA测序、基因克隆等实验的关键步骤，引物的设计原则直接影响到实验的准确性和效率。
在设计引物时，需要考虑以下几个原则：（1）特异性：引物应当具有良好的特异性，能够特异性地结合到目标DNA序列上，而不结合到其他非目标DNA序列上，避免出现假阳性结果。
（2）长度：引物的长度通常在18-25个核苷酸左右，过长或过短的引物都会影响PCR扩增的效率和特异性。
（3）GC含量：引物的GC含量应当适中，一般在40%-60%之间为宜，过高或过低的GC 含量都会影响PCR扩增的效果。
（4）Tm值：引物的Tm值应当合适，保证引物和模板DNA的结合和解离能够在PCR反应温度下正常进行。
（5）避免自身二聚体和非特异性结合：引物设计时需要避免引物之间的自身二聚体和非特异性结合，以确保PCR反应的特异性和准确性。
2. 引物的特异性引物的特异性是指引物与目标DNA序列结合的特异性，通常通过引物与非目标DNA序列结合的情况来评价。
特异性引物设计的关键在于选择合适的序列，在常见的实验中，通常采取以下几种方法来评估引物的特异性：（1）BLAST比对：利用NCBI的BLAST工具对引物序列进行比对，查看引物与非目标DNA序列的同源性，以评估引物的特异性。
（2）序列比对：利用生物信息学软件对引物的序列进行比对，查看引物与非目标DNA序列的异同，以评估引物的特异性。
qPCR 引物篇(2)PCR 设计引物时如何查询基因
PCR 之引物设计--------基因序列查询篇•确定目标基因的形态：DNA or RNA•查找目标基因•比对目标基因同源性和特点•选取目标基因序列•选取目标基因的目标区段第一步：如何查基因：1、mRNA 序列的查询；以查大鼠cort为例；/search 选择11、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，Copy该ｍＲＮＡ序列作为软件查询序列的候选对象。
该mRNA文件的命名：Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA；NM_012835：是唯一的编号；把以下序列存成ｔｘｔ文件：Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA* Comment* Features* SequenceLOCUS NM_012835 438 bp mRNA linear ROD 11-FEB-2008DEFINITION Rattusnorvegicuscortistatin (Cort), mRNA.ACCESSION NM_012835VERSION NM_012835.1 GI:6978682KEYWORDS .SOURCE Rattusnorvegicus (Norway rat)ORGANISM RattusnorvegicusEukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;Mammalia; Eutheria; Euarchontoglires; Glires; Rodentia;Sciurognathi; Muroidea; Muridae; Murinae; Rattus.REFERENCE 1 (bases 1 to 438)AUTHORS Xidakis,C., Mastrodimou,N., Notas,G., Renieri,E., Kolios,G.,Kouroumalis,E. and Thermos,K.TITLE RT-PCR and immunocytochemistry studies support the presence ofsomatostatin, cortistatin and somatostatin receptor subtypes in ratKupffer cellsJOURNAL Regul.Pept. 143 (1-3), 76-82 (2007)PUBMED 17481746REMARK GeneRIF: RT-PCR and immunocytochemistry studies support the presence of cortistatin in rat Kupffer cells.REFERENCE 2 (bases 1 to 438)AUTHORS Bourgin,P., Fabre,V., Huitron-Resendiz,S., Henriksen,S.J., Prospero-Garcia,O., Criado,J.R. and de Lecea,L.TITLE Cortistatin promotes and negatively correlates with slow-wave sleepJOURNAL Eur. J. Neurosci. 26 (3), 729-738 (2007)PUBMED 17686045REMARK GeneRIF: The capacity of CST-14 to increase SWA, together with preprocortistatin's inverse correlation with time spent in SWS, suggests a potential role in sleep homeostatic processes.REFERENCE 3 (bases 1 to 438)AUTHORS Deghenghi,R., Avallone,R., Torsello,A., Muccioli,G., Ghigo,E. and Locatelli,V.TITLE Growth hormone-inhibiting activity of cortistatin in the ratJOURNAL J. Endocrinol. Invest. 24 (11), RC31-RC33 (2001)PUBMED 11817718REFERENCE 4 (bases 1 to 438)AUTHORS de Lecea,L., Criado,J.R., Prospero-Garcia,O., Gautvik,K.M., Schweitzer,P., Danielson,P.E., Dunlop,C.L., Siggins,G.R.,Henriksen,S.J. and Sutcliffe,J.G.TITLE A cortical neuropeptide with neuronal depressant andsleep-modulating propertiesJOURNAL Nature 381 (6579), 242-245 (1996)PUBMED 8622767COMMENT PROVISIONAL REFSEQ: This record has not yet been subject to final NCBI review. The reference sequence was derived from U51919.1.Summary: inhibits growth hormone secretion; may act as aneuropeptide to mediate signaling via a somatostatin receptorsubtype [RGD].FEATURES Location/Qualifierssource 1..438/organism="Rattusnorvegicus"/mol_type="mRNA"/strain="Sprague-Dawley"/db_xref="taxon:10116"/chromosome="5"/map="5q36"gene 1..438/gene="Cort"/note="cortistatin"/db_xref="GeneID:25305"/db_xref="RATMAP:41189"/db_xref="RGD:2383"CDS 30..368/gene="Cort"/note="Preprocortistatin"/codon_start=1/product="cortistatin"/protein_id="NP_036967.1"/db_xref="GI:6978683"/db_xref="GeneID:25305"/db_xref="RATMAP:41189"/db_xref="RGD:2383"/translation="MGGCSTRGKRPSALSLLLLLLLSGIAASALPLESGPTGQDSVQDATGGRRTGLLTFLAWWHEWASQDSSSTAFEGGTPELSKRQERPPLQQPPHRDKKPC KNFFWKTFSSCK"sig_peptide 30..110/gene="Cort"mat_peptide 324..365/gene="Cort"/product="cortistatin-14"ORIGIN1 aaagcacagacttcaggtctccaaggaggatgggtggctgcagcacaagaggcaagcggc61 cgtcagccctcagtctgctgctgctgctgctgctctcggggatcgcagcctctgccctcc121 ccctggagagcggtcccaccggccaggacagtgtgcaggatgccacaggcgggaggagga181 ccggccttctgactttccttgcctggtggcatgagtgggcttcccaagacagctccagca241 ccgctttcgaagggggtaccccggagctgtctaagcggcaggaaagaccacccctccagc301 agcccccacaccgggataaaaagccctgcaagaacttcttctggaaaaccttctcctcgt361 gcaagtagcccgagcctgaccggagcctgaccggccaccctgtgaatgcagccgtggcct421 gaataaagagtgtcaagt//其中origin后面的序列，是我们用来设计的序列。
pcr实验中的引物
pcr实验中的引物PCR（聚合酶链反应）是一种重要的基因分析技术，广泛应用于基因组学、遗传学、疾病诊断等领域。
在PCR实验中，引物起着至关重要的作用。
引物是PCR反应中的两个单链DNA分子，它们通过与待扩增DNA序列互补配对，引导DNA聚合酶合成新的DNA链。
PCR反应的准确性、特异性和灵敏度取决于引物设计的好坏。
引物设计应考虑以下几个因素：1. 引物的长度引物的长度通常在18至30碱基对之间，最佳长度一般为20至25碱基对。
引物过短容易产生非特异扩增产物，引物过长可能导致特异性降低。
2. 引物的互补性引物与待扩增DNA序列的互补性是PCR反应的基础。
引物的互补碱基配对应尽量避免带有不稳定结构的碱基对，如G-C碱基对和A-T碱基对。
此外，互补碱基对的数目和位置也需要合理设计，以确保引物能够特异性地与待扩增DNA序列配对。
3. 引物的熔解温度（Tm）引物的熔解温度是指在PCR反应中引物解离的温度。
引物的Tm取决于其碱基组成及互补性，通常根据引物的碱基组成来计算。
引物的Tm应当在PCR反应的温度范围内，避免引物形成二聚体或与其他非特异性序列结合。
4. 引物的GC含量引物的GC含量也是引物设计的重要考虑因素。
GC含量过高或过低都可能影响引物的稳定性和特异性。
一般而言，引物的GC含量在40%至60%之间较为理想。
5. 引物的特异性引物的特异性是指引物只与待扩增DNA序列特异性地结合。
为确保引物的特异性，设计引物时需要进行比对分析，避免与其他潜在非特异性序列相互作用。
6. 引物的纯度引物的纯度是指它不应含有杂质或附带序列。
在引物合成或购买前，应进行质量检测和纯化，确保引物的纯度。
综上所述，PCR实验中的引物设计应综合考虑引物长度、互补性、熔解温度、GC含量、特异性和纯度等因素。
合理的引物设计可以提高PCR反应的准确性和特异性，为后续分析提供可靠的基础。
参考文献：[1] Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., & White, T. J. (2012). PCR protocols: a guide to methods and applications. Academic press.[2] Dieffenbach, C. W., Lowe, T. M., & Dveksler, G. S. (1995). General concepts for PCR primer design. PCR methods and applications, 3(3), S30-S37.。
引物设计步骤与要点
引物设计步骤与要点引物（primer）是在 DNA 或 RNA 聚合酶链式反应（PCR）或逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）中使用的短的 DNA 或 RNA 片段。
引物通过与目标序列的互补配对，为 PCR 或 RT-PCR 提供起始点，使得复制过程能够在目标序列上进行。
引物的设计是 PCR 或 RT-PCR 的关键步骤，影响其特异性和效率。
下面将介绍引物设计的步骤与要点。
引物设计的步骤如下：1.确定目标序列：首先要明确所需扩增的目标DNA或RNA序列。
例如，目标序列可以是特定基因的编码区域，或者是需要检测的病原体的DNA片段。
2. 引物长度：引物的长度通常在 18-30 bp 之间。
长度较长的引物可能会导致非特异性扩增，而较短的引物可能会导致不够稳定，产生非特异性扩增产物。
在设计引物时，应注意避免引物间或引物与模板间的互相互补性。
3.GC含量：引物的GC含量应在40-60%之间。
GC含量过高可能导致引物之间的二聚体形成，而GC含量过低可能导致引物的稳定性不足。
4.特异性：引物应与目标序列的特定部分互补配对，以确保特异性扩增。
在设计引物时，通常选择序列中的保守区域作为互补匹配的区域，以确保其在各物种或基因型中的适用性。
此外，可以通过使用在线工具，如NCBIBLAST，对引物进行特异性检测，以避免与非目标序列互补匹配。
5. 引物之间的互补配对：在 PCR 扩增中，引物通常成对使用，所以引物之间不应存在互补配对，以避免二聚体形成。
另外，引物对之间的距离应合适，通常在 100-300 bp 之间。
6.引物的末端设计：引物的末端设计直接影响PCR的效率和特异性。
在设计引物时，应注意避免末端的一些特定的串扰序列，如GGGG、CCCC、AAAA、TTTT等。
此外，引物的末端可以添加一些特定的序列，如引物标记和引物序列的识别序列，以便进一步的实验操作。
引物设计的要点如下：1.使用专业软件或在线工具进行辅助设计：可以使用一些专业的引物设计软件或在线工具来辅助引物的设计。
高中生物引物定义
高中生物引物定义
引物（Primer）是一种用于PCR（PolymeraseChainReaction）或其他DNA扩增技术中的核酸碱基片段。
引物是由聚苯乙烯和核苷酸组成的寡核苷酸，具有合成、扩增或其他特定功能。
它们广泛用于生物和医学实验中，以鉴定基因、突变和特征标记。
引物由两个由碱基链组成的子序列构成，子序列之间以20-30个碱基对照形成。
子序列减少了长度，使其可以以定向的方式进行新序列的联结。
每个子序列必须包含4种核苷酸，这称为正交脱氧核苷酸，以便在不同的碱基上正确结合。
有不同类型的引物，包括弱结合引物、热松香引物、强结合引物和外源引物。
弱结合引物在PCR反应中表现出良好的特性，它们可以复制任何DNA序列，特别是在可变的温度条件下。
热松榍引物通过热松榍酶的活性使DNA保持在低温条件下，热松香引物通常比弱结合引物更灵敏，但不能在可变温度条件下进行复制。
强结合引物可以在高温条件下扩增DNA，使用这种引物更容易得到高质量的产物。
外源引物由外源核苷酸组成，只能在低温条件下复制。
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引物的高考知识点
引物的高考知识点引物是在DNA分析中广泛使用的一种技术手段，它可以帮助鉴别个体的亲缘关系、疾病的遗传性以及犯罪的嫌疑人。
在高考中，引物是一个重要的知识点，下面将从引物的定义、作用、种类以及应用等方面进行论述。
一、引物的定义引物（primer）是在DNA分析中使用的一种短链寡核苷酸，它的作用是寻找并结合到待分析的DNA序列上，从而使其能够被扩增、分析和鉴定。
二、引物的作用1. 特异性结合：引物能够与待分析的DNA序列中的目标区域进行特异性结合，确保只扩增目标序列而不扩增其他无关的DNA片段。
2. 启动扩增：引物通过结合到目标区域，作为DNA复制的起点，启动聚合酶链式反应（PCR），实现目标序列的扩增。
3. 标记检测：引物可以标记各种化学荧光或酶等物质，使得扩增后的目标序列能够被直接或间接地检测和分析。
三、引物的种类引物根据其功能和分子结构的差异可以分为以下几类：1. 引物I：称为扩增引物，用于PCR反应，能够引导DNA在特定区域的复制。
2. 引物II：称为测序引物，用于测序反应，将PCR扩增后的片段进行测序。
3. 引物III：称为探针引物，用于探针技术，结合标记物与特定的目标序列进行结合和检测。
四、引物的应用引物在生物领域中有着广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 亲子鉴定：通过引物技术可以确定父母和子女之间的亲缘关系，对于解决争议、确认身份等具有重要意义。
2. 疾病诊断：引物技术在遗传性疾病中的应用十分重要，通过分析引物与疾病相关基因的结合情况，可以进行疾病的早期筛查和诊断。
3. 犯罪侦查：引物技术可以应用于犯罪嫌疑人的DNA检测和比对，帮助警方追踪和确定作案者，提供有效的证据。
4. 基因工程：在基因工程领域中，引物技术可以用于基因定点突变和插入等操作，为分子生物学研究提供重要的工具。
综上所述，引物作为DNA分析的重要工具，在高考中是一个需要重点掌握的知识点。
了解引物的定义、作用、种类和应用等相关知识，不仅可以帮助我们理解生物学原理，还能够拓宽我们对DNA分析技术的认识和应用。
选修三生物引物知识点总结
选修三生物引物知识点总结选修三生物引物知识点总结引物是生物技术中常用的试剂，用于在DNA分离和复制过程中的特定位置进行放大，并在许多实验中起着关键作用。
选修三生物引物是生物学专业的重要课程之一，掌握这门课程的知识对于培养学生的实验技能和科学素养至关重要。
在本文中，将总结选修三生物引物的相关知识点。
一、引物的基础知识1. 引物的定义和功能：引物是一种通过与目标DNA序列特异性结合来引导DNA复制或扩增的寡核苷酸序列。
在PCR（多聚酶链反应）和其他分子生物学技术中，引物通常用于放大特定基因片段。
2. 引物的设计原则：引物设计的原则包括长度、碱基组成、GC含量、熔解温度等方面。
引物的长度通常在18-30个碱基对之间，碱基组成需要避免多聚基和寡聚基出现。
GC含量的选择要合适，一般在40-60%之间，以保证引物的稳定性。
熔解温度是指引物序列的两条链在PCR反应的温度条件下解离的温度，合适的熔解温度有利于引物与目标序列的特异性结合。
二、引物的合成和净化1. 引物的合成方法：引物的合成通常采用化学合成的方法，通过连接单个的核苷酸单元来逐渐构建出完整的引物序列。
合成的引物需要经过全面的质量控制，包括引物长度的确认、浓度的测定等。
2. 引物的净化方法：引物的净化是为了去除合成过程中的杂质和未反应的核苷酸单元，常用的方法包括乙醇沉淀法、凝胶过滤法、离心柱纯化法等。
净化后的引物应该是纯净、有效的，以保证后续实验的可靠性。
三、引物的特异性检测1. 引物的特异性检测方法：引物的特异性检测是为了避免引物和非特异性位点结合，常用的方法包括BLAST分析、体外扩增反应、限制性内切酶切割等。
这些方法可以帮助确定引物与目标序列之间的特异性，并排除可能的假阳性结果。
2. 引物的检测指标：引物的特异性检测可以从多个方面进行评估，包括扩增效率、特异性扩增产物的长度、熔解曲线和DNA浓度等。
检测指标的合格与否直接影响引物的质量以及实验结果的准确性。
引物
引物（primers)设计知识介绍引物（primers)引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。
引物的重要性在整个PCR体系中, 引物占有十分重要的地位。
PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。
引物设计原则1.引物长度引物长度一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。
2.碱基分布的均衡性同一碱基连续出现不应超过5个GC含量一般40-60%GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性GC含量太高也易于引发非特异扩增。
3.引物Tm值一般要求：55℃-65℃。
计算：对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G C) 2(A T)来粗略估算对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。
Tm = △H/(△S R * ln (C/4)) 16.6 log ([K ]/(1 0.7 [K ])) - 273.154.引物二级结构引物二聚体尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补发夹结构尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。
5.引物3’端引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。
考虑到密码子的简并性，引物3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。
6.引物5’端引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。
5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。
pcr引物知识点总结
pcr引物知识点总结引言聚合酶链式反应（PCR）是一种用于在体外合成DNA的技术。
PCR可以在短时间内扩增一小段DNA序列，从而产生大量的特定DNA片段。
PCR引物是PCR反应中不可或缺的组成部分，是在PCR反应中实现特异性扩增的关键因素。
本文将从引物的设计原则、引物的性质、引物的应用以及引物的优化等方面对PCR引物知识点进行总结。
一、引物的设计原则1. 引物长度PCR引物的长度通常在18-30个碱基对之间，推荐引物长度为20-25个碱基对。
过短的引物可能无法很好地与靶序列结合，导致扩增效率低；过长的引物会增加引物与非特异性模板的结合可能性，降低扩增的特异性。
2. 引物GC含量引物的GC含量应在40-60%之间，这样有利于引物与靶序列的稳定结合。
高GC含量可提高引物与靶序列的结合力，但也会增加引物与非特异性模板的结合可能性。
低GC含量的引物则可能导致与靶序列的结合力过低，影响扩增效率。
3. 引物的Tm值引物的Tm值是引物与靶序列结合时形成双链DNA的温度。
引物的Tm值应该尽量接近反应的最优温度，通常在50-65°C之间。
过高或过低的Tm值都会导致引物与靶序列的结合不稳定，影响PCR扩增效率。
4. 引物的特异性引物的特异性是指引物与靶序列结合的特异性。
引物在设计时要尽量避免与非靶序列的相似区域结合，避免产生假阳性结果。
为了保证引物的特异性，可以利用生物信息学工具对引物进行序列比对，确保引物只与目标序列结合。
5. 引物的配对引物的配对是指两个引物在PCR反应中共同引物化。
引物之间的相互作用应遵循一定的配对规则，避免引物之间的二聚体或引物之间的互相结合，影响PCR反应的效率和特异性。
二、引物的性质1. 引物的结构PCR引物通常为单链DNA，包括前向引物和反向引物。
前向引物是与靶序列的5'端相对应的引物，反向引物是与靶序列的3'端相对应的引物。
引物的设计需遵循前向引物与反向引物相互配对的原则，确保引物在PCR反应中的特异性与效率。
研究生必备---设计引物篇
研究生必备---设计引物篇一、引物设计step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。
2、用Primer Premier5搜索引物①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。
点击Primer，进入引物窗口。
②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。
在Search Parameters里面，可以设定相应参数。
一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300～500bp.③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。
④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或 CCC，否则容易引起错配。
此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。
该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。
若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。
最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。
引物设计原则
引物设计原则引物设计是分子生物学实验中的关键步骤，特别是在PCR（聚合酶链反应）和测序等应用中。
引物的设计质量直接影响到实验的成败和结果的准确性。
本文将详细介绍引物设计的原则，并以实例说明这些原则的应用。
一、引物长度引物的理想长度一般在18-25个核苷酸之间。
过短的引物可能与非目标序列发生互补配对，导致非特异性扩增；而过长的引物则可能降低PCR效率，因为它们需要更高的温度才能完全熔解。
然而，在某些特殊情况下，比如GC含量极高或极低的情况下，可能需要调整引物长度。
二、Tm值Tm值是指DNA双链达到50%解离时的温度，它是衡量引物与模板结合强度的一个重要参数。
理想的Tm值应该在55-65℃之间。
如果Tm值过高，可能会导致引物无法有效退火；如果Tm值过低，则可能导致非特异性扩增。
三、GC含量GC含量也会影响引物的Tm值。
一般来说，GC含量越高，Tm值也越高。
理想的引物GC含量应在40%-60%之间。
过高或过低的GC含量都可能导致引物性能不佳。
四、引物二级结构引物不应含有自身互补的序列，否则会形成发夹结构，影响引物与模板的结合。
因此，应尽量避免引物内部的二级结构。
五、3'端稳定性引物的3'端决定了它是否能有效地与模板结合并进行延伸。
因此，3'端应尽可能稳定，避免存在弱的氢键或者错配。
六、避免跨外显子设计在设计用于检测基因表达的引物时，应避免跨外显子设计，因为这可能导致由于剪接变异而导致的扩增失败。
七、避开重复序列引物应避免包含重复序列，因为这可能导致非特异性扩增。
八、软件辅助设计现在有许多软件可以帮助我们设计引物，如Primer3、OligoAnalyzer等。
这些软件可以自动计算Tm值、GC含量、二级结构等参数，并帮助我们优化引物设计。
九、验证引物最后，无论我们多么小心地设计引物，都需要通过实验来验证其性能。
我们可以先用已知的目标序列进行PCR，看看引物是否能够有效地扩增出目标片段。
引物的种类及应用
引物的种类及应用引物是一种用于检测和扩增DNA序列的短链核酸序列。
其作用是在PCR（聚合酶链式反应）和其他DNA分析技术中诱导一段特定的DNA序列的复制。
引物能够与目标DNA序列的两个端点配对，并通过DNA聚合酶的催化作用引导DNA链的合成，从而扩增目标序列。
根据其长度和功能，引物可以分为以下几种类型，并在不同的应用中发挥着重要的作用：1. 寡核苷酸引物（Primer）：最常见和基础的引物类型。
它们是短序列（一般为18-25个碱基），通过与目标序列的互补配对来引导DNA合成。
一般情况下，PCR反应需要一对引物，包括一个向前扩增目标序列的“前向引物”和一个向后扩增目标序列的“反向引物”。
这些引物在PCR分析、基因克隆、DNA测序等研究中广泛应用。
2. 温度递减引物（Hot-start primers）：这种引物是一种改良型的应用于PCR 反应中的引物。
它们含有一个附加的特殊序列，该序列与引物相耐。
通过设计这样一个序列，引物在低温条件下保持折叠状态，从而防止在PCR反应混合液室温下的无特异性扩增。
温度递减引物在底物富含的PCR反应中能够提高选择性和特异性。
3. 探针（Probe）：与引物相比，探针是具有荧光标记、化学修饰等特殊功能的人工合成DNA或RNA序列。
探针能够与目标序列的特定区域发生互补配对，并用来检测特定的突变、基因表达水平、DNA甲基化等。
根据不同的检测技术和应用，探针包括荧光共振能量转移探针（FRET）、荧光素酶探针、MGB探针和Scorpion探针等。
探针广泛应用于定量PCR、FISH（荧光原位杂交）技术、癌症相关基因检测等领域。
4. MGB（Minor Groove Binding）引物：这是一种特殊的寡核苷酸引物，由寡核苷酸序列和溴分子内的小沟结合区构成。
MGB引物能够增强引物-目标DNA 间的互补性，从而提高PCR反应的特异性。
由于MGB引物具有更强的结合能力，所以在设计引物时可以使用较短的引物序列，从而降低引物间的杂交和非特异性扩增。
引物篇(引物合成及各种问题总结)
引物篇1.引物是如何合成的?目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产,无论采用什么机器合成,合成的原理都相同,主要差别在于合成产率的高低,试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的,合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的,相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应,脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基;第二步,合成DNA的原料,亚磷酰胺保护核苷酸单体,与活化剂四氮唑混合,得到核苷亚磷酸活化中间体,它的3'端被活化,5'-羟基仍然被DMT保护,与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步,带帽(capping)反应,缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%),用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应,这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步,在氧化剂碘的作用下,亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤,一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤,直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理,连接在CPG上的引物被切下来,通过OPC, PAGE等手段纯化引物,成品引物用C18浓缩,脱盐,沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮,测定OD260定量,根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些,如何选择?◆C18柱脱盐:有人称其为简易反相柱,它对DNA有特异性的吸附,可以被有机溶解洗脱,但不会被水洗脱,所以能有效地去除盐分。
引物篇：普通PCR
引物篇：普通PCR 和 QPCR 引物异同点Q问题：普通PCR 和 QPCR 引物是否⼀样？A 回答：⼆者的设计原则有相同也有不同；相同处：• 序列的查找是⼀致的；• 序列选取应在基因的保守区段；• 选取合适的扩增⽚段⼤⼩• 避免引物⾃⾝或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；• 避免引物⾃⾝形成环状发卡结构；• Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；• 引物之间的TM相差避免超过2℃；• 引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；不同处：Real time PCR 引物• PCR 产物长度；real-time PCR要求在300bp以内，⼀般⾸选80-150bp 之间；• 多对⽬的基因同时扩增，⽂献上查来的引物条件会不同，需要设计尽可能条件⼀致的引物；• ⽬的基因含量⽐较低时，需要设计灵敏度⽐较⾼的引物；• 相对电泳法，Real time PCR灵敏度⽐较⾼，对引物的要求更⾼，引物⼆聚体要少；熔解曲线要求单⼀产物；• Real time PCR的⽬的是进⾏定量或者相对定量，对扩增的效率有要求；对引物的⼆级结构要求⾼；普通PCR 引物：• 根据实验的要求不同，长度⼀般是从150bp到⼏千bp 不等；• 对⼆级结构要求没有real time PCR ⾼；• 对扩增效率要求不⾼；• 可以选⽤梯度PCR 仪，选择不同退⽕温度，对引物退⽕温度要求不需要⼀致；验证时不同：引物的特异性（相同点）：Ø 引物的特异性在使⽤前⽤blast 来保证；不同点：real time PCRØ 在实验结果中通过熔解曲线来验证；Ø PCR的特异性产物峰应与引物报告中的PCR product 相差在两度之内；普通PCR 通过产物的长度，跑条带，来鉴别产物的特异性；Real time PCR 可以通过扩增曲线，熔解曲线分析来鉴别产物的相对量，同时也可以对终产物进⾏电泳分析，更全⾯，更科学！。
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引物篇1.引物是如何合成的？目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
它不能有效去除比目的片段短的小片段。
实际上，它是一种脱盐的作用。
这种方法一般不会对普通PCR 反应产生影响。
对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。
◆OPC纯化： OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。
OPC法纯化的DNA纯度大于95%。
适用于40mer以下引物的纯化。
◆PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。
PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。
◆HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。
纯度可以大于99%。
主要用于短链和修饰引物的纯化。
该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。
3.引物的OD数如何定量？答：引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。
测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。
DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。
需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。
4.需要什么级别的引物？答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。
根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
应用引物长度要求纯度级别要求一般PCR扩增 < 45base OPC>45 base PAGE诊断PCR扩增 < 40base OPC, PAGEDNA测序 20base左右 OPC亚克隆，点突变等根据实验要求定 OPC, PAGE，HPLC基因构建（全基因合成）根据实验要求定 PAGE反义核酸根据实验要求定 PAGE修饰引物根据实验要求定 PAGE, HPLC5.最长可以合成多长的引物？答：引物越长，出现问题的概率就越大。
我们合成过120base的引物，但是产率很低。
除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。
6.需要合成多少OD数？答：根据实验目的确定。
一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。
如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。
但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD。
做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。
片段越长, 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。
超出需要之外的OD 数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。
7.如何检测引物的纯度？答：实验室方便的作法是用PAGE方法。
使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。
加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。
600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。
如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。
8.如何计算引物的浓度？答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。
引物一般配制成10-50pmol/ul。
溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。
如果不一致，请和我们联系。
我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。
一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数*（乘）33 *（乘）*（乘）20000 / (除) 引物的分子量。
引物的分子量可以从合成报告单上获得。
如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。
注意：1 OD260= 33 ug/ml.9.如何计算引物的Tm值？答：引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size公式中，Size = 引物长度。
Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.10.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？答：非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。
如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量。
或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（Nx * Wx）+( Ni* Wi) +16* Ns– 62. NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WC, WG, W, Wi分别为引物中碱基A 或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。
对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。
Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。
常规碱基分子量Base Molecular WeightA 313.21C 289.18G 329.21T 304.19I 314.2U 290.17常规修饰基团分子量5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.605’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.495’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.465’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.075’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.185’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.1211.如何溶解引物？答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。
根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。
溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。
12.如何保存引物？答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。
引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。
溶解后的引物-20度可以长期保存。
如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。
修饰荧光引物需要避光保存。
13.合成的引物5’端是否有磷酸化答：合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。
如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化，需要另外收费。
14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？连接反应需要引物的5’磷酸基团。
如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。
磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。