引物纯化方式选择指南设计

引物纯化方式选择指南2012-2-16 10:24:14

容导读

一、DNA合成的方法和原理

二、引物纯化的方法原理及其效果

三、纯化方法与应用指南

四、常见问题的原因分析及相应的对策

一、DNA合成的方法和原理

目前引物合成主要采用固相亚磷酰胺三酯法进行。基于该方法的DNA合成仪有多种，由ABI/PE 公司生产的高通量DNA自动合成仪得到了广泛的应用。各合成仪进行引物合成的原理基本相同，主要区别在于合成产率的高低、试剂消耗量和单个循环用时等。生工公司采用的合成仪主要机型为全新的ABI3900高通量合成仪。

固相亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是在固相载体上完成DNA链的合成的，DNA化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5’→3’方向延伸，而是由3’端开始，相邻的核苷酸通过3’→5’磷酸二酯键连接。具体的反应步骤如图一。

1、脱保护基(Deblocking)

用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA) 脱去连结在CPG (Controlled Pore Glass) 上的核苷酸的保护基团DMT (二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5'-羟基端，以供下一步缩合反应。2、活化(Activation)

将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。

3、连接(Coupling)

亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。

4、封闭(Capping)

缩合反应后，为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。

图1: DNA合成原理示意图（固相亚磷酰胺三酯法）

5、氧化(Oxidation)

缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。

经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5'-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基，合成的Oligo在脱去保护基后，目的Oligo纯度是比较低的，其中含有大量的杂质。主要杂质有：所脱下的保护基与氨形成的苯甲酸氨和异丁酸氨，腈磷基上脱下的腈乙基，以及合成时产生的短链等。以至于粗产品中全长Oligo DNA含量仅为25%左右。尽管合成时每一步的效率都在98%～99%，但累积的效率并不高。这些杂质成分，尤其是存在于粗产品中的大量盐和短链，不但造成定量不准，还会影响下一步的反应。因此必须对Oligo DNA进行纯化、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。

二、引物纯化的方法原理及其效果

基于以上合成的原理和步骤，目前，常见的几种纯化方法如C18柱、OPC或HAP、PAGE、

HPLC。生工公司采用HAP、ULTRA PAGE、HPLC三种纯化方法，其纯化的原理及其效果分别如下，我们建议客户应根据不同的实验需求，选择合适、经济并有效的纯化方法。

1. HAP纯化方法

HAP（HighAffinityPurification）是生工生物自主开发的新型oligoDNA纯化方法。该方法已取得国家专利（专利号：200310208040.X）。其原理是利用合成引物5'-端DMT基团对HAP树脂专一性吸附，而不含DMT的短链DNA不被吸附，从而达到分离纯化的目的。

HAP纯化柱中装有对DMT 具有亲和力的树脂，合成DNA 片段时保留5'端最后一个碱基上的DMT，所有合成产物吸附在柱上以后，用稀的有机溶剂洗柱，带有DMT 的片段吸附能力强，不易被洗脱，不带有DMT 的片段吸附能力弱，被洗脱。然后用三氟乙酸TFA 或三氯乙酸TCA 脱去DMT 基团，再用浓一点的有机溶剂洗脱DNA。这种方法具有多快好省的特点。制品纯度可达到80~90%，可以满足杂交探针、测序、常规PCR（不再做进一步克隆实验）等用途了。但是因为其专一性吸附DMT 能力有限，不免仍然有短片段带入的可能，而且负载量小。特别是对长于39 碱基以上的片段纯化效果不好。此级别只提供长度在10-39mer以下的合成oligo DNA制品。序列更长时，制品的纯度得不到保证。若考虑节约经费，对于要求较低的实验，如简单的PCR反应，则采用HAP纯化即可。

2. ULTRA PAGE纯化方法

PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis)，该方法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化基于尺寸和构象分离全长产物和失败序列，可以分离相差一个碱基的引物(120碱基以)，从而提供高纯度的引物。纯化后的DNA纯度大于90%，相比与其他两种方法，PAGE纯化对长链Oligo DNA (大于50 mer)的纯化特别有效，制品纯度保证90 ~ 95%。如订购的DNA欲用作RT-PCR引物、各种探针，或用于PCR克隆测序、定点突变等，请选用PAGE纯化制品。

ULTRA PAGE：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。经过PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，上样量都是非常大，电泳时的条带往往比较宽，带与带之间有重叠，分辨率有所下降，电泳后割带回收目的引物时，导致割的条带有时可能比较宽，很难避免割到差别仅一个或几个碱基的引物。因此生工生物为了给客户更好解决以上问题，将原有的PAGE纯化方式升级优化为现在的ULTRA PAGE纯化方式，即在PAGE纯化的同时配合质谱对DNA进行定性分析，以保证回收片段的正确性。

3. HPLC纯化方法

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)是使用高效液相色谱的原理，依据DNA的疏水性来分离产物的。合成粗产物中不同长度的DNA 片段的疏水性不同，一般来说较长的片段具有较强的疏水性，AT含量高的片段也具有较强的疏水性。先将粗产物检测主峰位置，再增加加样量，回收主峰位置的部分。该方法用于分离纯化时能达到很高的纯度和灵敏度，可以有效的去除大部分N-短片段，因而可以除去失败序列或未结合的标记物，从而对DNA片段进行纯化。同时配合质谱对DNA进行定性分析，以保证回收片段的正确性。由于HPLC产品的纯度非常高，使用本法纯化的DNA制品可适用于各种基因工程实验。主要用于PCR克隆、定点突变、人工合成基因、长链和修饰引物的纯化等。它的优点是自动化程度高、省人力；弱点是纯化量通量小、成本较高。

三、纯化方法与应用指南

表1: HAP、ULTRA PAGE和HPLC三种纯化方法的特点比较