ATP含量检测试剂盒(可见分光光度法)使用说明

ATP含量检测试剂盒（可见分光光度法）使用说明

注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

货号：BC0300

规格：100T/48S

产品内容：

组分规格保存

试剂一底物液Ⅰ粉剂×1瓶室温保存

底物液Ⅰ配制：用时加10mL煮沸双蒸水溶解，并沸水浴使溶解完全；临用前观察如有结晶，可沸水浴溶解后置于37℃保存待测。

试剂二底物液Ⅱ20mL×1瓶4℃保存

试剂三促进剂粉剂×2支-20℃保存稀释液760μL×2

瓶

4℃保存

试剂三应用液（促进剂）配制：临用前取1支试剂三稀释液加入1支试剂三粉剂中，充分溶解备用。

试剂四沉淀剂液体 5.5mL×1瓶4℃保存

试剂五显色剂

甲液7mL×4瓶4℃保存

乙液6mL×4瓶4℃保存

显色应用液的配制：用时取一瓶显色剂甲液加入一瓶显色剂乙液中，充分混匀4℃待用，现用现配。

试剂六终止剂50mL×1瓶室温保存

试剂七ATP标准品粉剂×2支4℃保存

5mmol/L ATP标准品贮备液配制：用时加双蒸水定容至1mL，制备5mmol/L ATP标准品贮备液。

1mmol/L ATP标准品应用液配制：将标准品贮备液与双蒸水1:4稀释，即5倍稀释。

产品说明：

三磷酸腺苷（adenosine5'-triphosphate，ATP）是生物体内能量转换最基本的载体,其含量的变化直接关系到各器官的能量代谢。ATP作为最重要的能量分子在细胞的各种生理、病理过程中起着重要作用。ATP水平的改变，会影响许多细胞的功能。通常细胞在凋亡、坏死

或处于一些毒性状态下，ATP水平会下降，而高葡萄糖刺激等对于一些细胞可以上调细胞内ATP水平。通常ATP水平的下降表明线粒体的功能受损或下降，在细胞凋亡时ATP水平的下降通常和线粒体的膜电位下降同时发生状态。ATP含量测定试剂盒可以用于检测红细胞或组织内的ATP水平。

自备仪器和用品：

分光光度计、水浴锅、可调式移液枪、台式离心机、研钵和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本前处理：

1、红细胞：抗凝全血取下层积压红细胞，一般按1:4的体积比加双蒸水进行稀释，再混匀使溶血完全，制备成溶血液。将制好的溶血液加入玻璃试管中沸水加热煮10分钟，取出混匀抽提1分钟，4000转/分钟，离心10分钟，取上清液待测。

2、组织样本：准确称取组织重，按质量（g）：体积(mL)为1：9的比例加入9倍体积的沸双蒸水，制成10%的匀浆液，再置于沸水中煮10min，取出混匀抽提1min，3500转/分钟，离心10min，取上清液待测。

3、培养细胞：先离心处理将细胞核培养上清分离，弃上清，得到下层沉淀细胞（一般细胞数量达到106个），将收集好的细胞加入300-500μL的热双蒸水，置于热水浴（90-100℃）中匀浆破碎后，将细胞悬液于沸水浴中加热10min，取出混匀抽提1min（涡旋混匀），即可用于测定。（如果存在大块细胞碎片，需离心后取上清测定）

二、操作步骤

试剂名称(μL)测定管对照管标准管空白管

样本3030

1mmol/L标准液3030

试剂一100100100100

试剂二200200200200

试剂三3030

蒸馏水3030

充分混匀，37℃水浴30min

试剂四50505050

充分混匀，4000rpm离心5min，取上清液300μL测定

样本上清液300300300300

试剂五500500500500

混匀，室温静置2min

试剂六500500500500

混匀，室温静置5min，波长636nm，光径0.5cm，双蒸水调零，测定各管吸光值。

注意：在比色前比色皿用自来水洗10次，再用蒸馏水洗4-5次，以免磷污染。

如果样本量大，建议将试剂混合后再按照该表操作

1混合试剂配制：

工作液A：按试剂一：试剂二：试剂三=100:200:30的比例配制，现用现配，按需配制。工作液B：按试剂一：试剂二=100:200的比例配制，现用现配，按需配制。

2、试剂配好后按下表操作：

试剂名称(μL)测定管对照管标准管空白管

样本3030

1mmol/L标准

3030

液

工作液A330330

工作液B300300

蒸馏水3030

充分混匀，37℃水浴30min

试剂四50505050

充分混匀，4000rpm离心5min，取上清液300μL测定

样本上清液300300300300

试剂五500500500500

混匀，室温静置2min

试剂六500500500500

混匀，室温静置5min，波长636nm，光径0.5cm，双蒸水调零，测定各管吸光值。

注意：在比色前比色皿用自来水洗10次，再用蒸馏水洗4-5次，以免磷污染。

ATP含量计算：

1、红细胞中ATP含量计算

ATP含量(μmol/gHb)=[(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白)]×标准品浓度（1×10 3μmol/L）×样本测定前稀释倍数÷血红蛋白浓度（gHb/L)

2、组织、细胞中ATP含量计算

3、ATP含量(μmol/gprot)=[(A测定管-A对照管)÷(A标准管-A空白)]×标准品浓度（1×103μmol/L）×样本测定前稀释倍数÷待测样本蛋白浓度（gprot/L)

注意：

1.要求不能有任何磷污染，建议最好用一次性塑料试管。

2.显色应用液配好后，不可放置太久，一般可保存5天，最好现配现用。

3.组织匀浆宜用2%-5%浓度的匀浆上清，若样本浓度过高，则底色过深（对照管OD过高），需稀释测定，一般通过预实验将对照OD值控制在 1.0以下。