04第四章植物组织培养技术(四)
植物组织培养技术第四章：植物离体培养体系2
修剪外植体
接种
盖好瓶塞
外植体的灭菌处理
• 外植体灭菌流程 • 常用灭菌剂 • 灭菌关键性问题
– 适当的搭配 – 适当的浓度 – 适当的时间
外植体灭菌流程
材料的预处理 (剪切、清洗)
75%酒精 (20 s)
0.1%升汞 (15 min)
无菌水冲洗 （6次）
沥干
接种
外植体的预处理
对外植体进行修整,去掉不要的部分,在 流水下冲洗干净.
化的方法与技能。
一、外植体的种类与选择
1、外植体的种类
– 外植体是指植物离体培养中的各种接种材料。 包括植物体的各个器官、组织、细胞和原生质 体等。因此，可以作为培养对象的所有植物器 官、组织、细胞、原生质体等均是可选择的对 象。
常见外植体类型
• 茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高， 不易发生遗传变异，但取材有限）
消毒注意事项
1、表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒 剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。
2、在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以 除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。
3、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其 切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质 的吸收。
第二节： 无菌外植体的选择与处理
本节主要内容
• 外植体的种类与选择 • 外植体的消毒 • 外植体的接种 • 外植体的初代培养与观察
–培养条件 –外植体的污染及其防治 –外植体的褐化及其防治 • 外植体的继代培养 –培养物的分化诱导培养：愈伤组织的诱导与分化；不
定芽的诱导与分化。 – 试管苗的增殖与生根诱导培养 – 试管苗的玻璃化与防治
4、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或 先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组 织培养。
植物组织培养技术
楚雄师范学院化学与生命科学系生物技术专业《植物组织培养技术》课程教学大纲一、课程基本信息课程代码：031106014课程中文名称：植物组织培养技术课程英文名称：Plant Tissue Culture Technology课程性质：专业选修课使用专业：生物技术专业、葡萄与葡萄酒工程专业开课学期：第7学期总学时：36+27总学分：3预修课程：植物学、植物生理学课程简介植物组织培养技术是将植物的离体材料器官、组织、细胞、原生质体等）无菌培养，使其生长、分化，进而再生完整植株的无性繁殖技术，是实践性较强的专业课之一。
本课程在介绍了组织培养的含义、特点及其意义；组织培养的概念、类型、特点；组织培养技术的基本原理及操作规范；组织培养的发展简史、发展趋势及其应用。
通过本课程的学习，使学生掌握组培实验室、家庭组培室、组培育苗工厂的组成、设计原则与设计要求；熟练掌握各种培养基的特点与应用；熟练掌握茎尖、茎段、叶及花器官培养消毒灭菌、接种及培养的技术；理解种质资源离体保存的意义，掌握种质资源离体保存常用方法；掌握一些常见植物的组培脱毒与快繁技术的应用。
教材建议《植物组织培养原理与技术》，李胜、李唯主编，化学工业出版社，2008年。
参考书《植物细胞组织培养》，刘庆昌编著，北京：中国农业大学出版社，2002年，标准书号：7-81066-529-4。
《植物组织培养（第三版）》，潘瑞炽编著，广州：广东高等教育出版社，2003年，标准书号：7-5361-2501-1。
《植物组织培养教程》，李浚明编著，北京：中国农业大学出版社，1996年，标准书号：7-81066-466-2。
《高等植物组织离体培养的形态建成及调控》，黄学林编著，北京：科学技术出版社，1995 年，标准书号：7-03-004377-4。
《植物组织培养》，王水琦编著，北京：中国轻工业出版社，2007年，标准书号：978-7-5019-5818-4。
《植物组织与细胞培养》，陈耀锋编著，北京：中国农业出版社，2007年，标准书号: 978-7-109-11844-7。
第四章植物组织培养技术
（二）丛生芽发生型(器官型)
丛生芽发生型是指使外植体携带的顶芽或 腋芽在适宜培养环境中不断发生腋芽而生根培养基中，诱导生根成苗的繁殖方法。
丛生芽发生型是大多数植物快繁的主要途 径，它不经过愈伤组织，能使无性系后代保持原 品种的特性，在生产中普遍应用。
四、移栽驯化
试管小植株的移栽驯化是试管苗从异养到自 养的转变，有一个逐渐适应过程。移栽前需对试 管植株进行高光强炼苗，使植株生长粗壮，并打 开瓶口，降低湿度，使其逐渐适应外界环境。 • 1.移栽 • 2.驯化管理
１.移栽
• 首先应洗去小植株根部附着的培养基，避免微生物 的繁殖污染，造成小苗死亡。
• 原球茎是短缩的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官， 它可以增殖，形成原球茎丛。由茎尖或腋芽外植体诱导产生原球茎，切 割原球茎进行增殖，或停止切割使其继续培养而转绿，产生毛状假根， 叶原基发育成幼叶，将其转移培养生根，形成完整植株。
II植物快繁程序
植物快繁的程序包括四个阶段： –无菌（或初代）培养的建立 –繁殖体增殖 –芽苗生根 –小植株的移栽驯化
（2）生产计划的实施 生产计划实施的步骤为：①准备繁殖材料。②合
格繁殖材料的快速增殖。 存瓶增殖总瓶数＝月计划生产苗数／每个增殖瓶月
可产苗数 月计划生产苗数＝每个操作人员每天可接苗数×月
工作日×人员数 控制试管苗生产中的增殖总瓶数，便于在一个周
期内全部更新一次培养基，使增殖材料处于不同生长 阶段的最佳状态，提高其质量。
IV 植物快繁的商业化应用
植物快繁最重要的用途是进行植物的商业化生产。 世界上快繁商业化开始于上个世纪美国的兰花工 业。我国的香蕉快繁苗占全国组培苗的2/3。其次 有甘蔗、兰花、马铃薯、甘薯等。
植物组织培养技术
2种激素5种浓度的实验组合 6-BA mg/L） 0 NAA 0 (mg/L) 0.5 2.5 5 10 0.5 1 6 11 16 21 2.5 2 7 12 17 22 3 8 13 18 23 5 4 9 14 19 24 10 5 10 15 20 25
• 完全试验方案试验因子越多，处理数越多，试验越复杂，消耗的 精力、物力越多。为了减少试验处理，但又能准确全面地获得试 验信息，通常采用正交试验。例如，采用正交设计，在使用此表 时就可以安排4个因子，3种水平的试验，一共做9种不同搭配的试 验，其结果相当于做了27次种种搭配的试验。正交试验虽然是多 因素搭配在一起的试验，但是在试验结果的分析中，每一种因素 所起的作用却又能够明白无误地表现出来。因此，一次系统的试 验结果，就可以把问题分析得清清楚楚，用有限的时间取得成倍 的收获。在组织培养研究中，可用于同时探求培养基中适宜的几 种成分的用量，如细胞分裂素、生长素、糖和其他成分的用量。
四、广谱实验法
• 在广谱实验法中，把培养基中所有组分分为4大类：无 机盐、有机营养物质(蔗糖、氨基酸和肌醇等)、生长素、 细胞分裂素。对每一类物质选定低(L)、中(M)、和高 (H)3个浓度。4类物质各3种浓度的自由组合即构成了 一项包括81个处理的实验。在这81个处理中最好的一 个可用4个字母表示。例如，一个包含中等浓度无机盐， 低等浓度生长素、中等浓度细胞分裂素和高等浓度有 机营养物质的处理即可表示为MLMH。达到这个阶段， 再试用不同类型的生长素和细胞分裂素即可找到培养 基的最佳配方。这是因为不同类型的生K素和细胞分裂 素对不同植物的活性有所不同。
• 不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的(表 2—1)，大多在5、6．5左右，一般培养基皆要求5.8， 这基本能适应大多植物培养的需要。 • pH值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同。以 硝态氮作氮源和以铵态氮作氮源就不一样，后者较高 一些。一般来说当pH值高于6．5时，培养基全变硬； 低于5时，琼脂不能很好地凝固。因为高温灭菌会降低 pH值(约0.2—0.3个pH值)因此在配制时常提高pH值 0．2—0．3单位。pH值大小调整可用0．1M的NaOH和 0．IM的HCI来调整。lml的NaOH可使pH值升高0．2单 位，lml的HCl可使pH值降低0．2单位。调节时一定要 充分搅拌均匀。
植物组织培养技术(四)
三、叶的培养
很多植物（非洲紫罗兰、香叶、天竺葵、 秋海棠等）的叶片具有很强的再生能力， 由于取材方便，数量多且均一性较强， 可以作为适宜的外植体。
基本培养过程
取叶片 表面消毒 平放在固体培养基上培养
大多植物的叶组织在离体培养条件下先形成愈伤 组织，再分化出胚状体、茎、叶和根。
1.将叶表面洗干净，70％乙醇浸泡30秒表面消毒， 用0.1％升汞浸泡数分钟。 2.叶片在培养基上的生长状况大多依赖于离体时 的成熟程度，幼叶比近成熟的叶生长潜力大。
图示茎段培养过程
去叶片用自来水冲洗 健康植株上选健壮的枝梢
0.1%升汞
MS培养基 再生 培养
75%酒精1分钟1Biblioteka 次氯酸钠4、茎的培养发育方向
腋芽萌发 脱分化后产生胚状体（原球茎） 离体繁殖
脱分化后直接产生不定器官
•脱分化后形成愈伤组织 建立悬浮系或 分化胚状体及 不定芽
蝴蝶兰腋芽萌发
5、影响发育方向的因素
第八章
器官培养
器官培养（Organ culture ）定义：
植物某一器官的全部或部分或器官原基的离体 培养，包括根、茎、叶、花、果实、种子等。 特点：
能保持器官所具有的特征性结构。
一、茎的培养
1、类型
茎尖培养： 10-100m的茎尖分生组织（脱毒） 茎段培养：带有腋(侧)芽或叶柄、长几厘米的
茎节段进行离体培养（快繁）
举例：非洲紫罗兰嫩叶离体培养的过程
叶片诱导丛生芽生根培养移栽。
非洲紫罗兰嫩叶，70％酒精略蘸一下，再0.1％升 汞溶液消毒5-8 min，无菌水冲洗数次，切成0.5-1 cm的小块接种于 MS + 1 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA
植物组织培养技术
体细胞从合子的有丝分裂产生，也具全能性，有遗传信息的传递、转录和翻译 能力。完整植株上某一部分体细胞只表现一定形态，承受一定功能，是受具体器官或 组织所在环境束缚，其遗传潜质并没消失，一但脱离束缚，条件适宜即表现全能性。
二. 植物组织培养的技术建立阶段
1933年李继侗培养银杏离体胚（3mm的胚），添加胚乳、种子、果实提取 物。 1934年美国White由番茄根建立第一个无性繁殖系，28年继代1600代。并 研究光、温度、通气、pH值、培养基组成的影响，于1937年建立第一个综合培养基， 定名为White培养基。 1934年Gautherer提出B族维生素和生长素的作用，于1939年培养胡萝卜根 形成层获成功。同年White由烟草种间杂种的瘤组织， Nobecourt由胡萝卜建立连 续生长的培养物。因此，Gautherer，White和Nobecourt一起誉为组培学科奠基人。 现在所用培养方法和培养基，基本由这三位科学家建立。 1943年White发表《植物组织培养手册》，使组培成为新兴学科。 40年代Skoog和崔徵明确腺嘌呤与生长素比例是控制芽根形成的主要条件。 比例高-芽，低-根；相等则不分化。 1956 Miller等人发现激动素可代替腺嘌呤，效果可增3万倍。上述模式变为 激动素与生长素比例。这一发现有力推动组培发展。 1952年Morel和Martin首次获得无病毒植株。 1958年，英国科学家Steward 等用胡萝卜根愈伤组织细胞悬浮培养，成功诱 导出胚状体并分化为完整植株，使细胞全能性理论得到证实，且为组培技术程序奠定 基础。
植物组织培养技术
植物组织培养技术植物组织培养技术是一种在无菌条件下通过培养组织和细胞的方式来繁殖和研究植物的方法。
它可以被广泛应用于植物育种、生产和研究等领域。
本文将介绍植物组织培养技术的基本原理、培养基组成和培养过程，并简要介绍其在实际应用中的一些重要方面。
一、基本原理植物组织培养技术基于植物细胞的分裂和分化能力。
在无菌条件下，取自植物的幼嫩组织、芽尖、胚乳或种子中的胚或胚乳端胚发育相对较低的部分，通过体外培养的方法，将其置于适当的培养基中，利用培养基中的植物生长激素和营养物质，可以诱导组织再分化和器官发生，从而实现对植物的繁殖和研究。
二、培养基组成植物组织培养过程中的培养基主要由无机盐、有机物、糖类和植物生长调节剂等组成。
无机盐提供了植物细胞所需的矿质元素，有机物则作为植物细胞的能量来源和原料。
糖类则提供能量和调节物质，植物生长调节剂在培养基中的加入可以调节细胞分裂、分化和器官发生等过程。
三、培养过程植物组织培养过程一般分为前处理、组织分离、无菌处理、培养和转地培养等几个步骤。
1. 前处理前处理包括新鲜植株的选择、幼嫩组织或胚的提取、洗涤和消毒等步骤。
新鲜植物材料能提供较高的活力和分裂能力，幼嫩组织或胚则更易于培养。
2. 组织分离在无菌条件下，通过手工或酶解的方法将所需的幼嫩组织或胚提取出来。
组织分离需要注意操作的轻柔和对组织的保护，以确保分离出的细胞和组织能够在后续的培养中保持较高的生活力。
3. 无菌处理在培养过程中，保持无菌状态是一项关键工作。
这包括对器皿、培养基和工具等进行高温高压处理或酒精灯烧烤，同时采取合适的工作台、手套箱、无菌技巧等。
4. 培养和转地培养将提取的幼嫩组织或胚块置于含有适当生长激素和营养物质的培养基中，暴露于合适的光照和温度条件下。
在培养过程中，可以通过调整培养基的成分和组织的处理方式来促进细胞分裂和分化，实现器官发生和植株生长。
如果需要将培养物转移到土壤中，还需要进行转地培养的处理，以适应土壤环境。
《植物组织培养技术》 知识清单
《植物组织培养技术》知识清单一、什么是植物组织培养技术植物组织培养技术，简单来说，就是在无菌的条件下，将植物的离体器官、组织、细胞或原生质体等，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，使其长成完整植株的技术。
这一技术的出现，为植物的快速繁殖、品种改良、脱毒培养等方面提供了强有力的手段。
二、植物组织培养技术的原理植物细胞具有全能性，这是植物组织培养技术的核心原理。
所谓全能性，是指每个植物细胞都包含着该物种的全部遗传信息，在一定条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。
就好像一颗小小的种子，包含了长成参天大树的所有“密码”，只要给予合适的环境和营养，它就能逐步生长、分化，最终成为一棵完整的植物。
而植物组织培养就是人为地创造出适宜的条件，激发细胞的全能性，让它们按照我们期望的方式生长和发育。
三、植物组织培养技术的基本步骤1、外植体的选择与消毒外植体是指用于培养的植物离体部分，比如茎尖、叶片、茎段、花器官等。
选择健康、无病虫害的外植体至关重要。
在选取后，需要对其进行严格的消毒处理，以去除表面的微生物，常用的消毒剂有酒精、升汞等。
2、培养基的制备培养基就像是植物细胞的“营养餐”，为它们的生长和分化提供必要的营养物质和生长调节物质。
常见的成分包括大量元素、微量元素、有机成分、植物激素等。
不同的植物和培养目的，需要的培养基配方也有所不同。
3、接种在无菌操作台上，将消毒后的外植体小心地接种到培养基上，这个过程要确保无菌，避免污染。
4、培养接种后的培养容器要放置在适宜的环境中进行培养，通常包括温度、光照、湿度等条件的控制。
根据培养的目的和植物的特点，培养方式可以分为固体培养和液体培养。
5、继代培养当外植体在培养基上生长一段时间后，需要将其转移到新的培养基上进行继代培养，以促进细胞的分裂和生长。
6、生根与炼苗当培养的芽或愈伤组织生长到一定阶段，需要诱导生根，形成完整的植株。
生根后的植株要经过炼苗，逐渐适应外界环境，然后才能移栽到土壤中。
植物组织培养技术
植物组织培养技术第一章绪论第二章植物组织培养实验室组成、仪器设备及无菌操作技术第三章植物组织培养基本原理第四章器官培养技术第五章植物胚胎培养第六章花粉及花药培养第七章细胞及原生质体培养第八章组培培养技术在中药学上的应用第一章绪论一、植物组织培养的概念1. 概念植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。
2.主要特征（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。
（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。
二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。
1、根据培养材料不同分为：（1）完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。
（2）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。
（3）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。
（4）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。
（5）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。
（6）原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。
2、根据再生途径分为：（1）器官发生途径（Organogenesis）：直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱导。
如茎尖培养。
间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）过程而形成新的组织和器官的过程。
植物组织培养教案
植物组织培养教案第一章：植物组织培养概述1.1 植物组织培养的定义1.2 植物组织培养的发展历程1.3 植物组织培养的应用领域1.4 植物组织培养的优点与局限性第二章：植物组织培养的原理与技术2.1 植物组织培养的原理2.2 植物组织培养的技术步骤2.3 植物组织培养的注意事项2.4 植物组织培养的设备与材料第三章：植物组织培养的实践操作3.1 植物组织培养的实验设计3.2 植物组织培养的实验操作步骤3.3 植物组织培养的实验注意事项3.4 植物组织培养的实验结果与分析第四章：植物组织培养在农业中的应用4.1 植物组织培养在作物育种中的应用4.2 植物组织培养在植物繁殖中的应用4.3 植物组织培养在作物栽培与管理中的应用4.4 植物组织培养在农业环境保护中的应用第五章：植物组织培养在生物科技领域的拓展5.2 植物组织培养在细胞工程中的应用5.3 植物组织培养在植物生物反应器中的应用5.4 植物组织培养在其他生物科技领域的应用第六章：植物组织培养在医药领域的应用6.1 植物组织培养在中药生产中的应用6.2 植物组织培养在珍稀药用植物繁殖中的应用6.3 植物组织培养在细胞产物的工业化生产中的应用6.4 植物组织培养在药物研发与评价中的应用第七章：植物组织培养在环境保护中的应用7.1 植物组织培养在植物修复中的应用7.2 植物组织培养在生物降解中的应用7.3 植物组织培养在生物过滤中的应用7.4 植物组织培养在生产生态材料中的应用第八章：植物组织培养在生物多样性保护中的应用8.1 植物组织培养在濒危植物繁殖中的应用8.2 植物组织培养在基因资源的保存中的应用8.3 植物组织培养在人工种子生产中的应用8.4 植物组织培养在植物育种中的作用第九章：植物组织培养的最新研究进展9.1 植物组织培养技术的最新发展9.2 植物组织培养在基因编辑中的应用9.4 植物组织培养在其他新兴领域的应用第十章：植物组织培养的未来发展趋势10.1 植物组织培养在可持续农业中的作用10.2 植物组织培养在生物产业的发展前景10.3 植物组织培养在生物技术领域的挑战与机遇10.4 植物组织培养在教育与普及中的意义重点和难点解析一、植物组织培养的定义与发展历程：理解植物组织培养的基本概念，以及其从最初发现到现代技术的发展历程。
植物组织培养(全)
胚培养是器官培养的一种。选用的外植体是成熟或未成熟的胚进行离体无菌培养。其具体方法是将取出放在液体或固体培养基上培养，由于胚包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是将胚珠和子房放在培养基上培养。
胚培养用途：1.拯救胚2.研究胚的发育营养研究3.一些特殊的领域的研究。
(4)细胞和原生质体培养
二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。
全能性体现的两个过程
一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历两个过程，即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。
再分化的过程有两种方式：
一是器官发生方式 二是胚胎发生方式
2.激素（植物生长调节剂）调控
后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。
⑤1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。
当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培养基上以后，将可使侧芽解除休眠状态，而且，能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些既存于原来茎尖上的腋芽，此外，还有由原来的茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转够到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。
奠基阶段（从20世纪30年代中至20世纪50年代末）
30年代中期，植物组织培养领域两个重要的发现，其一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素--一种天然的生长调节物质。
高中生物精品资源第四章 植物细胞培养与次生代谢产物的生产课件高中生物竞赛
的速度蓬勃发展。
药用植物及其制成保健食品、化妆品等每年进,药用植物细胞大量培养技术正成为 国际上名贵珍稀天然药物开发的新目标,目前已经从400多种植物建立了组 织和细胞培养体系,从中分离出600多种代谢产物,其中40多种化合物在数量 上超过或等于原植物
玫瑰鲜花在清晨摘下后24小时内即取出黄褐色的玫瑰精油，大约五吨 重的花朵只能提炼出两磅的玫瑰油，所以是全世界最贵的精油之一
茉莉精油被称为“精油之王”。茉莉精油产量 极少因而十分昂贵，其具有高雅气味，可舒缓 郁闷情绪、振奋精神、提升自信心，同时可护 理和善肌肤干燥、缺水、过油及敏感的状况， 淡化妊娠纹与疤痕，增加皮肤弹性，让肌肤倍 感柔嫩。
悬浮培养基本分为：分批式、流加式、连续式、半连续式培养
1)分批培养(batch culture) 是指在培养过程中，既不向系统中补加培养基， 也不从系统中排出培养物（包括培养基和细胞），也就是说一次性加入培养 基，在一定条件下培养一段时间后，一次性收获。
国内外细胞培养的研究进展
1）重点放在细胞培养上（过去） 细胞培养的优点是生物量生长快，但也有次生代谢产物的含量不稳定
和不易与大田栽培接轨等明显的缺点。
2）植物组织和器官培养具有更重要的意义。
初级代谢物、次生代谢物对细胞、植物的意义 植物合成次生代谢产物的目的是其自身生理代谢的需要，在细胞阶段，往往不 需要合成，但到了组织和器官阶段，合成的需要就会加强。因此，培养药用植 物的组织和器官，更容易获得次生代谢产物。
第四章 植物组织培养生产次生代谢产物
一、植物组织培养生产次生代谢物质的目的意义 二、植物细胞培养生产次生代谢产物
植物组织培养技术第四章：植物离体培养体系
• 其他物质
– 玻璃纤维 滤纸桥 海绵等
辅助性物质
• 抗生素类物质
– 种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等 – 用量：5－20mg/L。 – 作用：防污染，减少材料损失 – 注意：抗生素对组织生长有抑制作用，使用要慎重。
• 抗氧化物
– 常用抗氧化剂：半胱氨酸、PVP、VC – 用量：50－200mg/L – 作用：防止氧化褐变 – 注意：可用抗氧化剂洗涤外植体伤口表面。
MS 有机物
C6H12O6 ·2H2O NH2 ·CH2·COOH C12H17ClN4OS ·HCl C8H11O3N ·HCl NC5H4COOH
激素类—培养基的关键性物质
• 激素影响到植物的细胞分化、分裂、发育 • 激素影响到植物的形态建成、开花、结实、
成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等的生理 生化活动 • 所以植物生长调节物是培养基的关键物质， 对植物组织培养起着决定性作用
植物离体培养体系建立的五大技术模块
• 植物离体培养的营养条件----培 养基的配制
• 外植体的选择 • 外植体的灭菌与接种 • 外植体的培养技术 • 炼苗移栽技术
第一节：植物离体培养的营养条件 —培养基
• 主要内容
– 培养基的营养组成 – 常用培养基的类型与筛选 – 培养基母液的配制 – 培养基的配制、消毒与保存
生长素
• 诱导愈伤组织形成 • 诱导根的分化 • 促进根、茎、芽的生长
组培中常用的生长素类调节剂
• 种类：NAA(萘乙酸)；IAA(吲哚乙酸)；IBA(吲哚 丁酸)；2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)。
• 活性强弱与活性比：2，4-D>NAA>IBA>IAA； 活性比：IAA∶ NAA∶2，4-D = 1∶10∶100。
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3. 培养温度的选择
离体培养的花药(花粉)在培养初期对温度比较 敏感，大多需要在25〜28°C下培养
4. 生长调节物质的选择
• 在花药和花粉培养的脱分化阶段，生长调节物质 的选择是最重要的坏节。
• 花药和花粉培养的主要内容是生长调节物质的筛 选，包括生长调节物质的种类、浓度及配比。生 长调节物质的选择，主要根据植物种类和植株再 生方式来进行。
5. 碳源的选择
碳源的选择包括碳源浓度和各类的选择，以适应不同 植物种类离体花药和花粉小孢子脱分化过程中对渗透和异 养能源物质的要求。
一般来说，单子叶植物比双子叶植物要求更高浓度的 碳源，前者一般5%以上，高者可达到15%，后者一般3% 左右。
大多数情况下，采用蔗糖作为碳源都可获得较好的结 果，但采用其他糖作为碳源可或多或少提高培养的效果。
（一）花药和花粉植株的倍性
1. 由花药和花粉培养获得的植株，倍性多样。 2.花药植株倍性混杂的原因： ①体细胞组织的干扰。 ②生殖细胞的自发加倍
（二）花药和花粉植株倍性鉴定
1. 形态鉴定 （1） 一般情况下，单倍体植株的形态为植株瘦
弱、叶片窄小、花小柱头长，而多倍体植物的形态 为植株健壮、叶片宽大、花大柱头短
（三）外植体制备
花药和花粉培养中的表面灭菌通常先用70%－75% 乙醇浸润花蕾30s左右，然后在孢和漂白粉溶液(上清 液)中浸泡10-20min，或在0.1%氯化汞溶液中处理510min，之后用无菌水漂洗3-5次。由于花药和花粉 粉培养所取材料是未开放的花蕾，其内部的花和花粉 实际上处于无菌状态，表面灭菌在能杀灭花蕾表面微 生物的前提下，处理的强度以尽可能轻为好。花蕾经 表面灭菌后，需在无菌条件下录取花药，接种在培养 基上。
第四节 植物花药和花粉培养
花药培养和花粉培养： 指离体培养花药和花粉，使花粉改变原来的配子体
发育途径，转向孢子体体发育途径，形成花粉胚或花粉 愈伤组织，最后形成花粉植株从中鉴定出单倍体植株并 使之二倍化的细胞工程技术
单倍体的应用潜力
①克服后代分离，缩短育种年限； ②选择效率高； ③有利于隐性基因控制性状的选择； ④快速获得纯合自交系； ⑤其他：复壮；远缘杂交；进行花粉发育等的 理论研究。
• 花粉培养来说，需制备花粉外植体： ①自然释放法。 ②研磨过滤收集法。 ③机械游离法。 ④磁拌法。
二、植株再分化 （一）脱分化培养
1. 培养方式的选择 2. 基本培养基的选择 3. 培养温度的选择 4. 生长调节物质的选择 5. 碳源的选择 6. 其他添加成分
1. 培养方式的选择
（1）固体平板培养：固体培养基上进行培养 （2）液体培养：在液体培养基表面进行培养 （3）双层培养 ：在固体——液体双层培养基进行
一、培养材料的选取与制备
（一）材料选择 （二）预处理 （三）外植体制备
（一）材料选择
1. 基因型：培养材料的基因型是影响花药培养诱 导单倍体成功的最重要因素之一。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2. 花粉发育时期 3. 生理状态
（二）预处理
1. 低温处理：将花蕾用湿纱布包裹后再用塑料 袋封装，放在冰箱中冷藏
2. 高温处理（热激处理） 3. 高温和低温交替处理 4. 黑暗处理 5. 高糖液处理 6. 激光照射 7. 其他方法
1. 胚状体途径
（1）通过胚状体途径再生植株的，都是那些很容易做 花药(花粉)培养的基因型或从极佳生理状态的母株上 取到的处于最适宜发育时期的花药(花粉)
（2）对于直接胚状体途径来说再分化培养一般只是将 完成了诱导脱分化的花药和花粉进行转管培养。在少 数情况下，转管培养所用的培养基成分和培养方式可 以和脱分化培养阶段完全相同，多数情况下，这种转 管培养要做有别于脱分化培养阶段的适当调整
6. 其他添加成分
（1）活性炭 （2）水解酪蛋白 （3）维生素C （4）维生素A （5）聚乙烯吡哆酮 （6）硝酸银 （7）三十烷醇
（三）再分化培养
1. 胚状体途径 （1）直接胚状体发生：从离体培养的花药和花粉
直接产生胚状体 （2）间接胚状体发生：离体培养的花药和花粉先
形成胚性愈伤组织，然后再由胚性愈伤组织分 化出胚状体 2. 器官发生途径
培养 （4）分步培养：花药-花粉分步培养 （5）条件培养：用预先培养过花药的液体条件培
养基再次进行花药培养
（6）看护培养：
（7）微室培养
2. 基本培养基的选择
（1）常用的培养基有MS、Nitsch、B5、N6、H、 Miller培养基等
（2）基本培养基的影响实质上是无机盐离子浓度、 氮源总浓度、铵态氮和硝态氮的浓度和比值等差 异造成的
3. 染色体数目鉴定 采用涂片法(或压片法)和去壁低渗法，通过检
查根尖或茎尖染色体数目，排除嵌合体的干扰， 可同时对根尖以外的细胞，如嫩叶细胞、花粉母 细胞等的染色体进行观察。
4. 遗传标记鉴定 （1）生化标记鉴定：以基因表达产物蛋白质为主
的一类标记系统，常用的是同工酶标记。 （2）分子标记鉴定：标记检测的是植物基因组
2. 器官发生途径
通过器官发生型途径再生植株的分化培养中. 最重要的是选择适宜的生长调节物质类、浓度和 配比。生长素和细胞分裂素共同作用调控愈伤组 织形态发生的模式可以用来指导花药和花粉培养 中愈伤组织分化器官的培养。
（四）炼苗和移栽
三、单倍体植株鉴定和染色体加倍
（一）花药和花粉植株的倍性 （二）花药和花粉植株倍性鉴定 （三）花药和花粉单倍体植株的染色体加倍
（2）显微镜下观察叶片气孔保卫细胞的长度，是 近年来采用较多的细胞倍性鉴定法。一般情况下， 倍性越高气孔越大，单位面积气孔数目越小。
2. 结实性鉴定 单倍体植株、三部体植株和非整体植株虽然
都能开花但不结实；二倍体植株则开花结实都正 常；四倍体植株虽能开花和结实，结实性不良， 但经过长期选择淘汰，其结实性可能提高。
DNA水平的差异
5. 流式细胞仪鉴定法
（三）花药和花粉单倍体植株的染色体 加倍
1. 在常规条件下处理 用0.02%〜0.4%秋水仙素处理花药和花粉单倍体
植株 2. 在组织培养条件下处理
用秋水仙素加倍也可在组织培养条件下进行。常用 的方法有两种：一是在培养基中加入秋水仙素进行培 养；二是在培养过程中单独用秋水仙素溶液浸泡培养 材料，然后置于不含秋水仙素的培养基中培养。