革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌、革兰氏阳性杆菌鉴定程序流程图

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革兰氏阴阳性菌鉴别方法

革兰氏染色基本原理：革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。

它是1884年由丹麦医师Gram创立的。

革兰氏染色法（Gram stain）不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G--表示。

细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。

革兰氏阳性菌（G+）革兰氏阴性菌（G-）革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（basic dye）初染液；媒染剂（mordant）；脱色剂（decolorising agent）和复染液（counterstain）。

碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫（crystal violet）。

媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘（iodine）是常用的媒染剂。

脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精（ethanol）。

复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G--两大类群，常用的复染液是番红。

溶液配制：1.结晶紫染色液：(1)甲液：结晶紫2g，95%乙醇20ml。

实验三细菌的革兰氏染色

假阳性？假阴性？
五、作业
• 绘图
• 1．革兰氏染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。
六、思考题
• 1、革兰氏染色成功与否需要注意哪些问题？为什么？ • 2、现有一株菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定是革兰氏阳
性菌还是革兰氏阴性菌，如何确定你的染色结果的正确性？ • 3.为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阴性？ • 4.你认为革兰氏染色中那个步骤可以省略，在什么情况下可以省
➢2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
➢3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。
Staphylococcus aureus
Escherichia coli Mixture of G+ and G- Bacteria
略？
革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，脂类含量高，所以当被脱色处理时，类脂质被乙醇溶解，细胞壁透性增加，使结晶紫 —碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
三、实验材料
1、涂片染色用的细菌培养物金黄色葡萄球菌、大肠杆菌（对数生长期） 2、染色液和试剂：结晶紫（crystal violet ）、碘液（Gram’s
iodine）、95%酒精、蕃红（safranin ）、香柏油（cedar oil)、擦镜液 3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、酒精灯、擦镜纸、接种环、镊子。
四、革兰氏染色的方法和步骤
➢1. 涂片：在载玻片的左、中、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，中间涂混合涂片，右边涂大肠杆菌。

革兰阳性菌的鉴定操作

根据溶血现象分类
⑴ α型溶血性链球菌菌落周围有不透明溶血环。多为条件性致病菌。 ⑵ β型溶血性链球菌菌落周围形成完全透明的无色的溶血环。致病力强。 ⑶ γ型链球菌不产生溶血素，菌落周围无溶血环，也称为不溶血性链球菌。无致病性，常存在于乳类和粪便中，偶尔引起感染。
形态与染色
球形或卵圆形，直径0.6-1.0um，呈链状排列，短者2-8个细菌组成，长者有20-30个细菌组成。部分幼龄培养物可见到透明质酸形成的荚膜。
形态与染色
肠球菌属的细菌为革兰氏阳性球菌，多数菌种成双或呈短链状排列；一般无芽孢，无荚膜，少数菌种有鞭毛，陈旧培养物或在厌氧状态下有时呈革兰氏阴性。
生化反应胆汁七叶苷试验（+） 6.5％NaCl生长试验（+） PYR试验（+）血清学分类属D群
粪肠球菌
G+球菌
肠球菌属
触酶－
七叶苷阳性、 6.5％Nacl阳性
5.β溶血菌落
5.葡萄糖发酵试验
阳性则转为上一个步骤试验；阴性报微球菌属
5.API板条试验
小、黄色菌落；镜下呈四联、八叠排列细菌，则做葡萄糖发酵试验：
6.七叶苷NaCl试验 6.CAMP试验 6.杆菌肽试验
七叶苷试验（阴性或阳性）6.5％Nacl试验阴性： 1.α溶血，做Optochin试验：敏感且G+矛头状双球菌、脐窝状菌落，则判断为肺炎链球菌（Optochin试验抑菌圈的直径 ≥14mm为阳性） 2.β溶血：2.1.杆菌肽试验敏感，则判断为A群链球菌 2.2.乳胶凝集或CAMP阳性，则判断为B群链球菌 2.3.其它上机 3.γ溶血则上机
6.Optochin试验
七叶苷试验阳性6.5％Nacl试验阳性，则判断为肠球菌属： 1.阿拉伯糖阴性、山梨醇阳性则判断为粪肠球菌 2.阿拉伯糖阳性、山梨醇阴性则判断为屎肠球菌

临微标本检验程序

一．临床常见兼性需氧革兰阳性球菌的简单鉴定流程图：革兰阳性球菌在空气中生长（+）（-）触酶厌氧球菌（+）（-）葡萄糖胆汁溶菌实验或奥扑托欣实验O F ( -) (+)微球菌葡萄球菌胆汁七叶泔肺炎链球菌DNA酶+ （-）血浆凝固酶D群链球菌溶血ɑ—+ 6.5% Nacl草绿色链球菌杆肽菌表皮葡萄球菌金黄色葡萄球菌新生霉素—S R —+马尿酸表葡腐生D群链球菌肠球菌属水解实验气球菌+ ——D群多糖抗原+ B群链球菌其他链PRY阴性球菌血清凝集牛链球菌D群链球菌抗原、形态排列+ _肠球菌属气球菌属注：杆菌肽试验的阳性结果是A群链球菌；由于排版设计不正式，因此打不出来，请同学们自己写上去!二．临床常见阴性球菌的简单鉴定程序：革兰阴性球菌空气中生长—+韦荣球菌属DNA酶_ +奈瑟菌属卡他布汉菌TM培养基上生长—+其他奈瑟菌ONPG 乳糖+ —解乳糖奈瑟菌葡萄糖麦芽糖+ —淋病奈瑟菌脑膜炎奈瑟菌三．临床常见革兰阳性杆菌的简单鉴定程序：革兰阳性杆菌抗酸染色+—分枝杆菌属芽孢诺卡菌属+ —（气生菌丝）—+ 空气中生长动力+ —分枝杆菌属诺卡杆菌需氧芽孢梭状芽孢杆菌杆菌（慢生长）（快生长）结核分枝杆菌快速生长分枝杆菌+ —李斯特菌属空气中生长七叶甘（+）+ —触酶（+）葡萄糖发酵（+）MR（+）、VP（+）棒状杆菌属丙酸杆菌属丹毒丝菌属李斯特菌属糖发酵触酶（+）棒状杆菌丹毒丝菌属（G+ ，易脱色）四．临床常见革兰阴性杆菌的简单鉴定程序：革兰阴性杆菌—氧化酶+葡萄糖O/F 嗜血杆菌属葡萄糖O/FF O 军团菌属伯克霍尔德菌属 F O 肠杆菌科不动肝菌属色杆菌科窄食单胞菌气单胞菌假单胞菌属弧菌属无色杆菌邻单胞菌属金色杆菌巴斯德菌属不利用色杆菌属金氏杆菌属弯曲菌属不利用洛菲不动杆菌副百日咳鲍特菌产碱杆菌属腐蚀艾肯菌布鲁杆菌产碱假单胞菌鲍特菌属无色杆菌属四．血液及骨髓标本的细菌学检验：血液、骨髓标本硫酸镁葡萄糖肉汤（需氧培养）硫乙醇酸钠肉汤（厌氧培养）培养瓶子每日观察培养瓶中细菌生长情况无细菌生长有细菌生长现象继续培养7天仍无生长现象分离培养涂片革兰染色羊血琼脂平板（需氧培养）羊血琼脂平板（需氧培养）巧克力琼脂平板（二氧化碳培养）厌氧血琼脂平板（厌氧培养）真菌培养盲目接种发涂片结果报告同时做初步药敏试验观察菌落形态涂片、染色观察发初步药敏结果报告无菌生长革兰阳性球菌革兰阴性杆菌触酶实验氧化酶实验、O-F实验、KIA、MIU 阴性报告生化鉴定、血清学鉴定、药敏试验五．尿液标本的细菌学检验：尿液标本定量培养离心沉淀快速检验分离培养革兰染色抗酸染色直接计数菌落计数纯培养血琼脂平板麦康凯平板硝酸盐还原实验TCT试验菌落特征、涂片染色初步报告生化反应血清学鉴定初步报告初步报告药敏试验最终报告六．生殖道标本检验程序：生殖道标本细菌培养涂片检查其他检查革兰染色免疫荧光染色血平板衣原体抗原检测暗视野镜检巧克力平板衣原体分离培养镀银染色支原体培养基初步报告最终报告最终报告七．粪便标本的细菌学检验程序：粪便标本或肛拭子直接涂片检查需氧培养革兰染色单染色增菌培养直接分离动力观察及制动实验碱性胨水GN增菌液或亚硒酸盐增菌液SS平板副溶血性弧菌TCBS平板或麦康凯平板选择性其他碱性平板分离或中国蓝平板平板或EMB初步报告结果菌落形态菌落形态菌落形态血清凝集血清凝集生化反应生化反应生化反应最终结果报告八．呼吸道标本的检验程序：鼻咽拭子直接涂片检查常规检查白喉棒状杆菌培养百日咳杆菌培养革兰染色异染颗粒染色血平板血清斜面培养基鲍-金培养基巧克力平板鸡蛋培养基35℃3-5d麦康凯平板35℃8-10小时直接镜检35℃18-24小时菌落形态、涂片染色观察，初步报告初步报告亚碲酸钾血平板培养菌落形态、涂片染色生化反应、血清学鉴定九．痰液标本细菌学的检验程序：痰液及下呼吸道分泌物培养前处理肉眼观擦血平板巧克力平板麦康凯平板涂片染色观察普通培养CO2培养普通培养初步报告35℃18-24h 18-24h 35℃18-24h菌落形态和涂片染色生化反应、血清学鉴定、药敏试验最终报告十．脑脊液标本的细菌学检验：脑脊液标本革兰染色抗酸染色墨汁染色血平板巧克力平板罗-琴氏沙保弱培养基培养基显微镜镜检菌落、形态、生化、血清学鉴定药敏试验最终报告十一．脓液及穿刺的细菌学检验程序：脓液、创伤分泌物及穿刺液涂片需氧培养厌氧培养革兰染色血平板（巧克力平板）隔绝氧气运送抗酸染色EMB或麦康凯厌氧琼脂平板初步报告菌落观察涂片、染色、纯培养、生化反应最终报告十二．组织标本的细菌学检验程序组织标本涂片或印片组织捣碎或匀浆器组织包埋革兰染色组织悬液美蓝染色荧光染色涂片染色增菌培养初步报告分离培养菌落鉴定生化鉴定最终报告。

临床微生物学检验

出鉴定结果
粪便中细菌（肠道粪便菌）鉴定流程图
接种 24h MAC 无色、透明半透明菌落 KIA、MIU 可疑志贺菌诊断学清凝集 SS 中心黑色菌落扁平无色半透明蜡滴状蓝绿色 24h 米泔水样便
TCBS
黄色菌落
革兰染色 G-,鱼群排列的弧菌
疑似霍乱弧菌疑似副溶血上机诊断学清凝集
可疑沙门菌
涂片固定初染经火焰固定
目的：1、杀死细菌；2、使菌体与玻片粘附牢固；3、菌体蛋白变性，易于着色。
使各成分着色
石碳酸复红溶液， 5min，水洗甩干
酸性酒精溶液， 2min，水洗甩干亚甲基蓝溶液， 30s，水洗甩干
脱色
使各成分脱色，抗酸杆菌不易脱色
复染
镜检
复染各成分成蓝色
蓝色背景下，染成红色细长或略带弯曲的杆菌，并有分支趋向。
涂片目的：1、杀死细菌；2、使菌体与玻片粘附牢固；3、菌体蛋白变性，易于着色。使细菌各成分着色其作用是增强染料与细菌的亲和力，更好地加强染料与细胞的结合。帮助染料从被染色的细胞中脱色。利用细菌对染料脱色的难易程度不同，而将细菌加以区分。革兰阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰阴性细菌则易被脱色。目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱色菌进行比较。革兰阴性菌革兰阳性菌
干粉培养基 1.5ml超纯水充分溶解阴性孔加50ul 棉拭子于培养瓶中搅动数次
石蜡油液封
每空吸取50ul
混匀
取出棉拭子，弃去
置35-37℃温箱孵育24小时
观察结果
结果判断
沙眼衣原体抗原检测
• 检验原理：用抗衣原体脂多糖单克隆抗体和羊抗鼠IgG多克隆抗体分别固定于固相硝酸纤维素膜，并和胶体金标记的另一抗衣原体脂多糖单克隆抗体及其他试剂和原料制成，应用胶体金免疫层析技术，采用双抗体夹心的形式建立的衣原体检测方法，用于女性宫颈和男性尿道中沙眼衣原体抗原的检测。结果判读

菌种鉴定标准操作规程

菌种鉴定标准操作规程目的：建立菌种鉴定标准操作规程范围：适用于******鉴定标准操作职责：内容：1整体操作步骤1.1纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。

1.2挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。

1.3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。

如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。

1.4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。

如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。

1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。

1.6选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。

鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。

2革兰氏染色2.1染色剂的配制2.1.1结晶紫染色液：甲液：结晶紫 1.0g95%的酒精20ml乙液：草酸铵0.8g水80ml将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。

2.1.2碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g水300ml配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。

2.1.3稀石碳酸红溶液:碱性品红 1.0g石碳酸 5.0ml95%乙醇10.0ml配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。

2.2操作:2.2.1涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。

革兰染色法实验报告图

革兰染色法实验报告图
表及结果分析
实验目的：
通过革兰染色法对细菌进行分类和鉴定。

实验器材和试剂：
细菌培养基、青霉素、高锰酸钾、甲醇、碘酒、干净的平面玻片、显微镜。

实验操作：
1. 用细菌培养基将待测细菌培养至富有营养的生长期。

2. 取一块干净平面玻片，在玻片上均匀涂抹一层待测细菌培养基。

平衡后用酒精火消毒。

3. 取一支革兰染色剂，将细菌涂片中的细菌覆盖上染色剂，停留1分钟。

4. 用清水冲洗干净，接着滴上碘酒。

停留1分钟。

5. 流水冲洗过滤，将甲醇滴到细菌涂片上，待颜色变浅后再次
用流动水冲洗过滤。

6. 晾干细菌涂片，取一支高锰酸钾，滴于细菌涂片上，制成干
片即可。

实验结果：
革兰染色法将细菌分为两类：革兰阳性菌和革兰阴性菌。

革兰
阳性菌细胞壁表层为厚的胞壁，可在染色过程中吸收靛蓝染料溶液，看起来呈现紫色；而革兰阴性菌细胞壁表层薄，无法吸收靛
蓝染料溶液，染色后呈现红色。

实验结论：
通过本次革兰染色法实验，我们成功将细菌分为革兰阳性菌和
革兰阴性菌两类。

这种分类和鉴定方法可以较为准确地对细菌进
行鉴定，可广泛应用于医学和生物学等领域。

注：以上仅为范文，具体实验条件和结果请依据实验情况而定。

革兰氏染色试验

革兰氏染色实验革兰氏染色(Gram Staining)是用来鉴别细菌的一种方法：这种染色法利用细菌细胞壁上的生物化学性质不同,可将细菌分成两类,即革兰氏阳性(Gram Positive)与革兰氏阴性(Gram Negative).(这种染色法是由一位丹麦医生汉斯•克里斯蒂安•革兰于1884年所创造).未经染色之细菌,由于其与周围环境折光率差异甚小,故在显微镜下极难观察.染色后细菌与环境形成鲜明比照,可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征,而用以分类鉴定.革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌:革兰氏阳性菌：葡萄球菌属(主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等)、链球菌属(肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等)、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽抱杆菌等,其中,金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要的病原菌.革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸檬酸菌属、假单胞菌属〔绿脓杆菌等〕、莫拉菌属〔卡他莫拉菌等〕、奈瑟菌属〔淋球菌、脑膜炎双球菌等〕、不动杆菌属〔鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等〕、克雷伯菌属〔主要是肺炎克雷伯杆菌〕、沙门氏菌属、志贺氏菌属〔痢疾杆菌等〕、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属〔杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等〕、产气杆菌属、霍乱弧菌、阴沟肠杆菌等.革兰氏阴性菌在院内感染中的细菌感染中占了大约65%,且大多菌株容易对抗菌药物耐药,产生“新德里金属酶" 〔NDM-1〕的绝大多数细菌都是革兰氏阴性菌〔主要是大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯杆菌〕.革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌是利用革兰氏染色法来鉴别的两大类细菌.大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌,它们能产生外毒素使人致病,而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌,它们产生内毒素, 靠内毒素使人致病.细胞形态和结构细胞的根本结构包括细胞壁和原生质体两局部.原生质体位于细胞壁内,包括细胞膜〔细胞质膜〕、细胞质、核质和内含物.另外细胞还含有有些特殊结构,主要有荚膜、芽抱、鞭毛和菌毛等4种.1 .细胞壁革兰氏染色的机理主要是抓住了革兰氏阳性细菌与阴性细菌在细胞壁的结构与组成上的不同,具体比拟见下表：进一步的,革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖和包括磷壁酸的酸性多糖构成,细胞外表整体带负电的局部原因就是由于磷壁酸带负电.同时,磷壁酸赋予了革兰氏阳性细菌以特异的外表抗原.总的说来,细胞壁结构的差异导致了染料吸收的差异,也导致了很多生理特性的不同.2 .非细胞壁结构性性一兰早明性郛菌•兰氏阴性细菌外壁层结构Hl# nm)Z-J0三房飞三、M配/F冬吟日T5%汪单位交联,正箔益密上图华巳翔阳碑位空於瞬曲城沱=1阴m性美系腾箍二汩性1毛『|』口%福如5%; “ D%土蜜〔龄一蛔王五宅法天五蛋E五一或无无fi指雪龙三存11S-22%在非细胞壁结构中,革兰氏阳性细菌和阴性细菌主要的区别在于是否有芽抱和鞭毛与性菌毛的不同上.芽孢是某些细菌菌体发育过程中的一个阶段,在一定的环境条件下由于细胞质和核质的浓缩凝集形成的一种特殊结构.革兰氏阴性细菌中没有会形成芽抱的菌种,而局部革兰氏阳性细菌可以.另外,在鞭毛和性菌毛方面两者也有不同.鞭毛和性菌毛都是附属物.某些细菌外表伸出的细长、波曲的附属物称为鞭毛.革兰氏阳性细菌的鞭毛上根本着生两个环,革兰氏阴性细菌那么根本着生四个环.性菌毛只见于革兰氏阴性菌,参与细胞间称作接合作用的交配过程.生理特性以下是关于革兰氏阳性细菌和阴性细菌在生理特性方面的比拟. 两者的不同从本质上来说,还是主要是由细胞结构的不同所决定的.用日虽兰对日性细菌革兰氏阴性和菌对机械力的抗性强弱至1胞壁抗花菌南弱〔砂感〕理〔不原感,*对青毒春、磷胺钻感不勘感*对链霉素、氯霉素、哩F素八城魅前感对碱性霜的抑菌作用强弱*对阴离子去污剂敏感不敏感*对叠氨叱论颍感不勖感对一曜血性强疝件弱代卅抱壁最外层中脂务雄阻碍流阕诙、亩牛叁.染料、去污各I等式十分千番入步骤：革兰氏染色法一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤,具体操作方法是：〔1〕制片.取菌种培养物常规涂片、枯燥、固定.要用活泼生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性；火焰固定不宜过热〔以玻片不烫手为宜〕.〔2〕初染.滴加结晶紫〔以刚好将菌膜覆盖为宜〕染色1-2min,水洗.〔3〕媒染.用碘液冲去残水,并用碘液覆盖约1min,水洗.〔4〕脱色.用滤纸吸去玻片上的残水,将玻片倾斜,在白色背景下,用滴管流加95%的乙醇脱色,直至流出的乙醇无紫色时,立即水洗.乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节：脱色缺乏,阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度,阳性菌被误染成阴性菌.因而脱色时间一般为 20-30S.〔5〕复染.用番红液复染约2min,水洗.〔6〕镜检.枯燥后,用油镜观察.菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌, 被染成红色的为革兰氏阴性菌.明第名燃料S扇港U疑isr：i生五丸红匕用说也染#1；i月等红化江电韭闲箱状.亚色t用酒新瑞色原理:通过结晶紫初染和碘液媒染后,在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物,再用95%乙醇脱色.革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密,故遇乙醇或丙酮脱色处理时,因失水反而使网孔缩小,再加上它不含类脂,故乙醇处理不会出现缝隙,因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内,使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差,在遇脱色剂后,以类脂为主的外膜迅速溶解,薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出,因此通过乙醇脱色后仍呈无色,再经沙黄等红色染料复染,就使革兰氏阴性菌呈红色 [1].染色的差异主要是阴性与阳性细菌细胞壁的差异所引起的.①革兰氏阳性细菌的细胞壁G+细菌细胞壁具有较厚〔20-80nm〕而致密的肽聚糖层,多达50层,占细胞壁成分的40%〜95%,它同细胞膜的外层紧密相连〔图2-9〕.有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸〔teichoic-acid〕,也称胞壁质〔murein〕,它是甘油和核糖醇的聚合物,磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在.由于磷壁酸带负电荷,它在细胞外表能调节阳离子浓度.磷壁酸与细胞生长有关,细胞生长中有自溶素〔autolysins〕酶类起作用,磷壁酸对自溶素有调节功能,阻止胞壁过度降解和壁溶.如果细胞壁的肽聚糖层被消溶,G+细胞成为原生质体(protoplasts),细胞壁不复存在,而只存留细胞膜.除链球菌外, 大多数G+细菌细胞壁中含极少蛋白质.②革兰氏阴性细菌的细胞壁G一细菌细胞壁比G+细菌细胞壁薄(15〜20nm)而结构较复杂, 分外膜(outer membrane)和肽聚糖层(2〜3nm)(图2-10).在细胞壁和细胞质膜之间有一个明显的空间,称为壁膜间隙(periplasmic space).外膜G—细菌细胞壁外膜的根本成分是脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),它同细胞质膜相同之处也是双层类脂,但除磷脂外还含有多糖和蛋白质.LPS的多糖局部包括核心多糖和O-特异多糖.O-特异多糖由重复分支的碳水化合物分子组成,含有已糖(葡萄糖、半乳糖和鼠李糖) 和二脱氧已糖.由于糖的种类不同,使各种G—细胞具有不同特性的LPS.核心多糖(core polysaccharide)的主要组分是酮脱氧辛酸(ketodeoxyoctonate, KDO).外膜中还含有几种蛋白,如脂蛋白、通透蛋白.有些蛋白具有通孔作用(porin),调控外界分子进入细胞；有的蛋白分子可以作为噬菌体的受体；许多G—细菌对高等生物有致病性是由LPS的成分决定的,它的毒性组分常称为内毒素(endotoxins).肽聚糖层G—细菌细胞壁的肽聚糖层很薄,在大肠杆菌和其它细菌中仅有单层.肽聚糖层和外膜的内层之间通过脂蛋白连接起来.壁膜间隙G—细菌细胞壁的外膜与细胞质膜之间存在明显的壁膜间隙,一层薄的肽聚糖处于其间,肽聚糖层和细胞质膜之间的间隙较宽,肽聚糖层至外膜之间的间隙较窄.大肠杆菌的壁膜间隙宽度为12〜15nm,呈胶胨态.其间含有三类蛋白质：水解酶,催化食物的初步降解；结合蛋白,启动物质转运过程；化学受体(chemoreceptors), 在趋化性中起作用的蛋白.染色结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色,革兰氏阴性菌呈红色.。

革兰氏染色实验步骤

.；. 革兰氏染色一．实验流程：1、取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。

涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。

2、涂片：液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。

固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。

3、晾干：让涂片在空气中自然干燥。

4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。

5、染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。

6、水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。

简单染色结束可观察细胞形态。

7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。

8、脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。

9、复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。

至此，革兰氏染色结束。

二．染色结果：革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。

备注：1.革兰氏阳性菌：葡萄球菌属（主要是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等）、链球菌属（肺炎链球菌、草绿色链球菌、肠球菌等）、白喉杆菌、炭疽杆菌、破伤风杆菌、蜡样芽孢杆菌等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要等病原菌。

2.革兰氏阴性菌：埃希氏菌属、枸橼酸菌属、假单胞菌属（绿脓杆菌等）、莫拉菌属（卡他莫拉菌等）、奈瑟菌属（淋球菌、脑膜炎双球菌等）、不动杆菌属（鲍曼不动杆菌、罗菲不动杆菌等）、克雷伯菌属（主要是肺炎克雷伯杆菌）、沙门氏菌属、志贺氏菌属（痢疾杆菌等）、黄杆菌属、变形杆菌属、军团菌属、耶尔森菌属、嗜血杆菌属（杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌等）、产气杆菌属、霍乱弧菌、阴沟肠杆菌等。

革兰氏染色法的步骤

详细阐叙革兰氏染色法的步骤浏览次数：174次悬赏分：0 |解决时间：2011-5-25 17:44 |提问者：肖箫2011shaw最佳答案革兰氏染色一、目的：在细胞发放之前，利用标准的革兰氏染色法对即将发放的细胞悬液进行检测，判断细胞悬液中是否含有革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。

二、原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

三、实验用品准备：灭菌玻片、10-100ul移液器、10-100ul灭菌移液吸头、100ul-1000ul移液器、100ul-1000ul移液吸头、接种环、酒精灯、打火机、革兰氏染色液、吸水纸、显微镜、香柏油、擦镜纸、计时器四、操作：1 涂片：取灭过菌的载玻片于实验台上，用移液枪吸取10ul待检样品滴在载玻片的中央，用烧红冷却后的接种环将液滴涂布成一均匀的薄层，涂布面不宜过大。

2 干燥：将标本面向上，手持载玻片一端的两侧，小心地在酒精灯上高处微微加热，使水分蒸发，但切勿紧靠火焰或加热时间过长，以防标本烤枯而变形。

3 固定：固定常常利用高温，手持载玻片的一端，标本向上，在酒精灯火焰处尽快的来回通过2-3次，共约2-3秒种，并不时以载玻片背面加热触及皮肤，不觉过烫为宜（不超过60℃），放置待冷后，进行染色。

4 初染：在涂片薄膜上滴加草酸铵结晶紫1-2滴，使染色液覆盖涂片，染色约1min。

5 水洗：斜置载玻片，在自来水龙头下用小股水流冲洗，直至洗下的水呈无色为止。

革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌、革兰氏阳性杆菌鉴定程序流程图

革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌、革兰氏阳性杆菌鉴定程序流程图-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌、革兰氏阳性杆菌鉴定程序流程图一、临床常见革兰氏阳性球菌的鉴定%NaCL葡萄糖血清凝集分群②－②+/－草绿色链球菌D群链球菌血浆凝固酶肠球菌属气球菌属精氨酸－－革兰氏阳性球菌需氧培养溶血溶血①OP ①杆菌肽①胆汁七叶苷②胆汁七叶苷②CAMP ②③%NaCI ③胆汁七叶苷②－②－②＋③－③－③＋/－①＋②＋③＋均－A群 B群 D群其他链球菌肺炎链草绿色链 D群链球球菌气球菌属山梨醇 /坚忍肠球菌①阿拉伯糖②甘露醇③山梨醇－粪肠球菌屎肠球菌坚韧肠球菌表皮葡萄球菌（新生霉素S）腐生葡萄球菌（新生霉素R）+非肠球菌属乳糖马肠链球菌二、临床常见革兰氏阴性杆菌鉴定见图观察平板上菌落特征（特殊形态、漫延生长、拉丝、溶血、荧光、色素等）②— 革兰氏阴性杆菌氧化酶（—） KIA 葡萄糖O/FO/-）肠杆菌科动力①苯丙氨酸②VP 试验②－ ②－②麦芽糖迅速分解 ③甘露醇④DNA 酶（G-球杆菌）（25%氧化酶+）②＋ ②－ ③－ ③+ ④＋ ④－嗜麦芽窄食单胞菌洋葱伯克霍尔德氏菌（93%氧化酶阳性）埃希菌属变形杆属菌克雷伯氏菌属志贺氏菌属（漫延生长）（动力-）沙门氏菌属普罗威登氏菌属沙雷氏菌属枸橼酸杆菌属摩根摩根氏菌（DNA 酶+）迟缓爱德华菌 (吲哚+，尿素+，哈夫尼亚菌属耶尔森氏菌属糖醇反应差）（蜂房哈夫尼亚）（G-短小杆菌肠杆菌属37℃动力（—）25℃动力（+）尿素（+）4℃生长糖醇分解/黄色素阴沟肠杆菌聚团多源菌产气肠杆菌板畸肠杆菌革兰氏阴性杆菌氧化酶（+） KIA 葡萄糖O/FO/-）弧菌科动力①嗜盐试验 ②肌醇 ③O/129敏感试验 ④TCBS 生长（端鞭毛）（菌落产生亮黄色色素）莫拉氏菌（G-球杆菌，SS 不生长，菌落细小，不分解任何糖类）①－ ①－ ①＋/－②－ ②＋ ②－ ④－ ④－ ④＋③R ③S/R ③S 气单胞菌属邻单胞菌属弧菌属（76%有β溶血）（无β溶血）（周鞭毛，蛋白胨肉汤中以上不分解任何糖类）三、临床常见革兰氏阳性杆菌鉴定革兰氏阳性杆菌抗酸染色（18℃--20℃有动力，倒伞形，狭窄溶血环,H 202+）李斯特氏菌＋－＋/－＋＋－普通血平板生长芽胞杆菌梭状奴卡氏菌（血平板呈粉末状生长，菌落不易挑起，有菌丝）（G+着色不匀，有异染颗粒，毒力试验阳性，结合临床症状考虑是否为白喉棒状杆菌）红斑丹毒丝菌（G 染色易脱色，H 2S+ 感染特征）丙酸杆菌棒状杆菌红斑丹毒丝菌糖分解/触酶。

革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌、革兰氏阳性杆菌鉴定程序流程图

革兰氏阴阳性菌鉴别方法

实验三 细菌的革兰氏染色

革兰阳性菌的鉴定操作

临微标本检验程序

临床微生物学检验

菌种鉴定标准操作规程

革兰染色法实验报告图

革兰氏染色试验

革兰氏染色实验步骤

革兰氏染色法的步骤

革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌、革兰氏阳性杆菌鉴定程序流程图

实验三细菌的革兰氏染色