2 反相高效液相色谱测定厌氧反应上清液中挥发性脂肪酸_孙绪顺

总之，建立一种快速、简单、有效的测量挥发性 脂肪酸的方法是非常有意义的。 反相高效液相色谱 测量挥发性脂肪酸具有快速、预处理简单、分析结果 准确等优点。 因此本文拟建立使用反相高效液相色 谱方法分离、测定挥发性脂肪酸的方法，并且测定厌 氧反应系统中的挥发性脂肪酸含量。
1 实验部分
1.1 主要仪器及试剂
净水技术 WATER PURIFICATION TECHNOLOGY
Vol. 28, No. 5, 2009
October 25th, 2009
用于非挥发性脂肪酸的测定。 气相色谱是现在应用比较普遍的一类测量挥发
性脂肪酸的方法。 在毛细管色谱柱技术发展之前使 用气相色谱法测定脂肪酸时， 常常因为脂肪酸的高 极性、 高沸点， 难气化而需要对其进行繁琐的预处 理，将挥发性脂肪酸酯化，然后通过测定酯的含量来 间接的测定脂肪酸的含量[4]。 这种方法的缺点是酯 化时间漫长，影响了测量的时间，同时增加了测试 前的步骤，增加了误差产生的概率，精确度得不到 保证 。 [3、5] 随着毛细管色谱柱技术的发展 ，使用气相 色谱测定挥发性脂肪酸可以不经过衍生、 酯化而直 接进行测定。虽然免去了繁琐复杂的预处理，气相色 谱 测 定 挥 发 性 脂 肪 酸 还 存 在 以 下 几 种 困 难 ：（1）选 择 特定检测器以消除样品中水对测定结果的影响，测 定 挥 发 性 脂 肪 酸 一 般 选 用 氢 火 焰 离 子 检 测 器 。（2）因 为挥发性脂肪酸的具有强极性，容易产生拖尾问题。 为了解决拖尾问题， 一般选用程序升温控制温度并 且选用合适的极性色谱柱。（3）挥发性脂肪酸具有强 烈的挥发性，因此要使用弱酸酸化待测样品。且选用 弱酸不破化色谱柱为原则[3]。 由此我们可以得出，虽 然气相色谱测定挥发性脂肪酸已经不需要太过繁琐 的预处理，相对于传统的测定方法已经比较快速，可 是在使用气相色谱过程中还有太多的限制。
标准曲线
y = 0.076 9x + 7.641 6 y = 0.191 5x + 9.028 7 y = 0.112 2x + 2.899 9 y = 0.042 4x - 6.594 6
R2
0.997 3 0.999 1 0.999 4 0.999 5
检出限 /(mg·L-1)
3.17 4.78 2.56 2.59
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荧光法、薄层色谱法、气相色谱法等方法。 使用比色 法、滴定法等传统常规的化学方法具有直观的优点， 在液相色谱和气相色谱等方法未普及之前得到了广 泛的应用。同时因为比色法、滴定法传统化学方法所 需预处理方法复杂、实验时间漫长、分析结果误差大 以及实验劳动量大等缺点限制了此类方法的进一步 使用，另外比色法、滴定法等传统化学方法只能分析 待测溶液中挥发性脂肪酸的总量，无法分离、测定不 同种类挥发性脂肪酸的浓度数据， 因此无法满足现 代实验对挥发性脂肪酸分类分析的要求。 荧光法测 定挥发性脂肪酸原理是将挥发性脂肪酸转化成具有 强烈荧光特性的物质， 通过荧光分光光度测定挥发 性脂肪酸。 此方法因为需要挥发性脂肪酸可以转化 成带有强烈荧光特性的物质，因此不能够广泛使用。 薄层色谱法是将待测样品涂布与玻璃板、 塑料或其 他材料上，成一层均匀薄膜，反应一段时间后与对照 物的色谱图进行对比得出结果。 因此此类方法只适
净水技术 2009，28（5）：64-66
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Water PuVrifoilc.a2t8io, nNoT.e5c, h20n0o9logy !!!!!!"
分析与监测
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反相高效液相色谱测定厌氧反应上清液中挥发性脂肪酸
பைடு நூலகம்
孙绪顺，褚春凤，李春杰
（上 海 交 通 大 学 环 境 科 学 与 工 程 学 院 ，上 海 200240）
紫外检测波长 210 nm[6]。 进样量 10 μL。 1.2.2 色谱条件的优化
（1）流动相缓冲溶液浓度的优化 理论上缓冲溶液浓度的高低会直接影响挥发性 脂肪酸在流动相中的存在形式及离子强度， 从而影 响色谱的分离效果。缓冲溶液的浓度越高，挥发性脂 肪 酸 在 流 动 相 中 以 酸 分 子 形 式 存 在 稳 定 性 越 高 [6]。 如缓冲液浓度过高则会导致挥发性脂肪酸在流动相 的本底吸收过大，影响色谱检出灵敏度，同时还会减 小色谱柱的使用寿命，增加实验成本。 为了能够更好的分离各种挥发性脂肪酸， 同时 又可以保护色谱柱，进行大量的预实验。预实验结果 表明流动相浓度的改变对挥发性脂肪酸的分离效果 影响不大。 但考虑过高的流动相盐浓度可能会影响 色谱系统、减小色谱柱的使用寿命。 因此，本实验选 择磷酸二氢钠浓度为 10 mmol/L 的流动相。 （2）流动相中缓冲溶液与甲醇比的优化 流动相中含有少量甲醇能够较好的改变峰型， 并且可以减少挥发性脂肪酸的保留时间。 甲醇含量 过少， 则对峰型与挥发性脂肪酸保留时间的改变不 明显，达不到实验预期效果。 如甲醇含量过高，则会 使各种不同种类的挥发性脂肪酸保留时间间隔太 小，导致不同种类的脂肪酸峰面重叠，同样不能较好 的分离各种脂肪酸。 经过大量的预实验， 对比在不同缓冲溶液与甲 醇比的情况下，各种脂肪酸的分离情况。本文选定盐 与甲醇的体积比为 78∶22 时作为实验条件。 （3）流动相 pH 的优化 pH 是决定挥发性脂肪酸在流动相中以何种形 态存在的重要因素。 参照前人的研究经验 ， [6-10] 本实 验选择 pH＝2.5 的缓冲液作为流动相。 按照以上优化条件，具体色谱分析图为图 1。
使用上述建立的方法测定甲酸、乙酸、丙酸、正
丁酸标准溶液中脂肪酸的含量， 取噪音峰值的 2 倍
作为此方法的最低检出限。 四种酸的标准曲线以及
相关系数见表 1。
表 1 四种挥发性脂肪酸测定参数
Tab.1 Parameters of four VFAs
脂肪酸
甲酸 乙酸 丙酸 正丁酸
保留时间 /min 3.112 3.991 6.258 7.902
Abstract Volatile fatty acids(VFA) are important parameters in the anaerobic fermentation reaction system. Accurate understanding of various types of volatile fatty acids content is an important step to ensure the normal operation of anaerobic fermentation reaction. The experiment set up a method by high performance liquid chromatography (HPLC) to determine the formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid. The result shows that the recoveries of four VFAs are larger than 87 %, detection limits and RSD ranged from 2.56 mg/L to 4.78 mg/L and 8.23 % to 10.31 %. It proved that this measurement can be accomplished to determine the content of VFA smoothly and exactly. Key words high performance liquid chromatography(HPLC) volatile fatty acids(VFA) anaerobic reaction
1.1.1 仪器 岛津 2010A 型高效液相色谱仪。 CLASS-VP 色谱工作站。
1.1.2 试剂 磷酸、磷酸二氢钠、甲酸、乙酸、丙酸、正丁酸均
为国产分析纯药品。甲醇采用进口色谱纯试剂，实验 用水均为超纯水。
1.2 实验条件
1.2.1 色谱条件 色谱柱使用岛津公司出产的 C18 反相色谱柱。
流动相使用磷酸盐缓冲溶液（PBS），pH＝2.5。 磷酸二 氢钠浓度为 10 mmol/L。 流速 1 mL/min。 柱温 30 ℃。
1.3 样品的处理
本实验所使用厌氧发酵液样品为本实验室 CSRT 系统厌氧发酵上清液。
样品采集后使用离心机 3 500 转离心 15 min 取 离心后的上清液使用。 为避免 HPLC 色谱柱的堵塞 使 用 0.45 μm 的 微 孔 滤 膜 将 离 心 后 的 上 清 液 过 滤 去除悬浮物和微生物。 而后把处理好的样品存放在 0 ℃的冰箱里以待测试。 从采集样品到使用 HPLC 测试样品时间间隔不超过 3 d。
挥发性脂肪酸（volatile fatty acids, VFA）是厌氧 过程酸化阶段的主要产物， 是厌氧过程中一种重要 的中间产物。有机物在厌氧过程中首先经过水解、发 酵作用产生挥发性脂肪酸， 产甲烷菌利用厌氧反应 过程中产生的挥发性脂肪酸产生甲烷。 有研究显示 在厌氧过程中产甲烷菌利用脂肪酸产生甲烷的过程 是 厌 氧 反 应 的 一 个 重 要 的 控 制 过 程[1]，因 此 在 厌 氧 反应系统中系统的失衡常常伴随着挥发性脂肪酸的 积 累[2]，即 在 厌 氧 反 应 过 程 中 适 时 的 监 控 系 统 中 脂 肪酸的含量可以有效了解系统中甲烷菌的活跃程度 和反应器的运行情况[3]。 所以在厌氧反应中，挥发性 脂肪酸是反应系统的一个重要的指标。
2 实验结果
2.1 标准曲线的测定
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孙绪顺，褚春凤，李春杰. 反相高效液相色谱 测定厌氧反应上清液中挥发性脂肪酸
Vol. 28, No. 5, 2009
a: formic acid b:acetic acid c:propionic acid d:butyric acid 图 1 四种挥发性脂肪酸色谱图 Fig.1 Chromatogram of four VFAs