琼脂糖凝胶电泳详细过程与步骤
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5、所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。
6、琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；
不同类型琼脂糖的性质
琼脂糖类型
标准琼脂糖
高强度琼脂糖 修饰的低熔点/ 凝 点琼脂糖 超低熔点
低黏性低熔点琼脂 糖
凝结温度/℃ 35~38 40~42 34~43 25~35 35 8~15 25~30 38 30
贮存温度 4℃ 室温 4℃ 4℃
琼脂糖凝胶中DNA的检测
通过染色, 紫外灯下检测。
主要采用溴化乙锭（ethidium bromide, EB） 染色法。
使用EB染色注意事项
（1）EB被认为是一种强致癌物质 （2）EB可用来检测单链或双链核酸 （3）EB使用时的配制、贮存及使用
高强度(kຫໍສະໝຸດ Baidu) 低熔点(kb) 低黏度低溶 点(kb)
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3 0.05~1
0.5~1 0.1~0.5 0.01~0.1
7、电泳缓冲液
常用的电泳缓冲液
4℃ 保存备用.
TAE和TBE电泳缓冲液比较
琼脂糖凝胶电泳的优点
1. 因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2. 对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3. 凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、
核酸、病毒 等大分子物质。 4. 透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6. 样品易回收，常用于制备。
熔化温度/ ℃ 90~95
85~90
85~95 63~65
65 40~45
70
不同厂家生 产的不同商 品其凝结温 度和熔化温 度有一定差 异
85
75
不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围
浓度 （%）
0.3 0.5 0.8 1.0 1.2 1.5 2.0 3.0
4.0 6.0
标准 (kb) 1~50 0.7~25 0.5~15 0.25~12 0.15~6 0.08~4
琼脂糖凝胶电泳详 细过程与步骤
• 天 然 琼 脂 （ agar ） : 又 名 琼 胶 、 菜 燕 、 冻 粉 是从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线 状高聚物。
琼脂糖（agarose） 半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷
D-半乳糖
核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴 定和纯化DNA或RNA片段
12 3 M
DNA的迁移速率决定因素
1、DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对 数近似成反比； 2、琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快； 3、DNA的构象 同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状
4、凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、 刚性和长度增加。
缺点 1. 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2. 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3. 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定
染色。 4. 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。
一、实验目的
掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法
二、实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成 具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电 场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子 筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比 关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。 该过程可以通过把分子量标准参照物和样品 一起进行电泳而得到检测。
都是常用电泳缓冲液，二者相比： 1）TAE的缓冲容量较低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的
阳极一侧将发生酸性化； 2）TBE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量； 3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE中迁移快10%； 4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，对于低分
子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率 要好于TBE。
凝胶载样缓冲液
载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样 品相混合的一种缓冲液。
载样缓冲液有三个作用： 1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内； 2）使样品带有颜色便于简化上样过程； 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳
极迁移。
6×凝胶载样缓冲液
类型 I II
III IV
6 ×缓冲液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰 40% (m/V)蔗糖水溶液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰 15% 聚蔗糖(Type400)水溶液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰 30%甘油水溶液 0.25%溴酚蓝 40% (m/V)蔗糖水溶液
⑷ 用移液器吸取总DNA或质粒样品4μ l于封口膜上，再加 入2μ l 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。
⑸ 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝 条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。
⑹ 将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微 漂洗。
⑺ 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上 防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的 DNA条带。
四、实验步骤 ⑴ 1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。
在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60℃，加入
100μ l的0.5mg/ml EB，并摇匀。）
⑵ 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的 琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。
⑶ 充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中， 加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂 直向上拔出梳子。
溴化乙锭（Ethidium Bromide, EB）为扁平状 分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA 分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的 含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。
三、实验材料、器具及药品 质粒DNA样品。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫 外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTBE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X载样缓 冲液
6、琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；
不同类型琼脂糖的性质
琼脂糖类型
标准琼脂糖
高强度琼脂糖 修饰的低熔点/ 凝 点琼脂糖 超低熔点
低黏性低熔点琼脂 糖
凝结温度/℃ 35~38 40~42 34~43 25~35 35 8~15 25~30 38 30
贮存温度 4℃ 室温 4℃ 4℃
琼脂糖凝胶中DNA的检测
通过染色, 紫外灯下检测。
主要采用溴化乙锭（ethidium bromide, EB） 染色法。
使用EB染色注意事项
（1）EB被认为是一种强致癌物质 （2）EB可用来检测单链或双链核酸 （3）EB使用时的配制、贮存及使用
高强度(kຫໍສະໝຸດ Baidu) 低熔点(kb) 低黏度低溶 点(kb)
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3 0.05~1
0.5~1 0.1~0.5 0.01~0.1
7、电泳缓冲液
常用的电泳缓冲液
4℃ 保存备用.
TAE和TBE电泳缓冲液比较
琼脂糖凝胶电泳的优点
1. 因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2. 对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3. 凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、
核酸、病毒 等大分子物质。 4. 透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6. 样品易回收，常用于制备。
熔化温度/ ℃ 90~95
85~90
85~95 63~65
65 40~45
70
不同厂家生 产的不同商 品其凝结温 度和熔化温 度有一定差 异
85
75
不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围
浓度 （%）
0.3 0.5 0.8 1.0 1.2 1.5 2.0 3.0
4.0 6.0
标准 (kb) 1~50 0.7~25 0.5~15 0.25~12 0.15~6 0.08~4
琼脂糖凝胶电泳详 细过程与步骤
• 天 然 琼 脂 （ agar ） : 又 名 琼 胶 、 菜 燕 、 冻 粉 是从石花菜及其它红藻类植物提取出来的一种线 状高聚物。
琼脂糖（agarose） 半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷
D-半乳糖
核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴 定和纯化DNA或RNA片段
12 3 M
DNA的迁移速率决定因素
1、DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对 数近似成反比； 2、琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快； 3、DNA的构象 同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状
4、凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、 刚性和长度增加。
缺点 1. 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2. 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3. 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定
染色。 4. 与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。
一、实验目的
掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法
二、实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成 具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定。
DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电 场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与 分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子 筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比 关系。因而就可依据DNA分子的大小使其分离。 该过程可以通过把分子量标准参照物和样品 一起进行电泳而得到检测。
都是常用电泳缓冲液，二者相比： 1）TAE的缓冲容量较低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的
阳极一侧将发生酸性化； 2）TBE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量； 3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE中迁移快10%； 4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，对于低分
子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率 要好于TBE。
凝胶载样缓冲液
载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样 品相混合的一种缓冲液。
载样缓冲液有三个作用： 1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内； 2）使样品带有颜色便于简化上样过程； 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳
极迁移。
6×凝胶载样缓冲液
类型 I II
III IV
6 ×缓冲液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰 40% (m/V)蔗糖水溶液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰 15% 聚蔗糖(Type400)水溶液 0.25%溴酚蓝 0.25%二甲苯氰 30%甘油水溶液 0.25%溴酚蓝 40% (m/V)蔗糖水溶液
⑷ 用移液器吸取总DNA或质粒样品4μ l于封口膜上，再加 入2μ l 的6X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。
⑸ 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝 条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。
⑹ 将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微 漂洗。
⑺ 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上 防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的 DNA条带。
四、实验步骤 ⑴ 1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀。
在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60℃，加入
100μ l的0.5mg/ml EB，并摇匀。）
⑵ 用胶带将制胶板两端封好，插入适当梳子，将溶解的 琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。
⑶ 充分凝固后撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中， 加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂 直向上拔出梳子。
溴化乙锭（Ethidium Bromide, EB）为扁平状 分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA 分子形成EB-DNA复合物，其荧光强度与DNA的 含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。
三、实验材料、器具及药品 质粒DNA样品。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫 外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTBE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），6X载样缓 冲液