关于淋巴管内皮细胞的分离和鉴定
单核细胞向淋巴管内皮细胞转分化潜能的研究
单核细胞向淋巴管内皮细胞转分化潜能的研究摘要：传统的观点认为，单核细胞仅是吞噬细胞的前体细胞，在体内不同环境下能分化为巨噬细胞、树突状细胞、kupffer细胞、小胶质细胞。
但近几年的研究发现，单核细胞经诱导具有多向性的分化潜能。
本文将单核细胞向淋巴管内皮细胞转分化潜能的研究现状进行综述。
关键词：单核细胞；淋巴管内皮细胞；转分化。
干细胞替代治疗是近些年来医学研究领域的热点。
单核细胞参与血管新生一直是近些年来非常活跃的课题。
研究发现，单核细胞能受组织环境影响、发生不同方向的分化。
单核细胞不仅是巨噬细胞、树突状细胞的前体细胞，还能在特殊环境下分化成内皮祖细胞（endothelial progenitor cell， epcs）[1]，参与血管新生。
然而，单核细胞参与淋巴管新生的研究相对较少。
相对于血管内皮标志物，淋巴管内皮特异性标志物发现较晚，在1984年以后才陆续被发现[2]，因此对于淋巴管内皮的研究一直滞后于血管内皮。
近年来，随着研究者对于一些淋巴管内皮特异性标志物的发现，关于淋巴管在诸多领域的研究均有所突破。
因此，随着单核细胞向血管内皮细胞转分化的研究的深入，单核细胞向淋巴管内皮细胞转分化的研究已经有了初步进展，但至今仍未有定论。
目前这方面的研究，只能给单核细胞向淋巴管内皮细胞转分化的可能性提供一些依据。
一、单核细胞向血管内皮细胞的转分化从胚胎发育学看，淋巴管内皮细胞与血管内皮细胞具有同源性。
胚胎主静脉的一部分内皮细胞出芽形成淋巴囊，再由淋巴囊出芽形成成熟的淋巴管网络[3]。
所以，单核细胞向血管内皮细胞转分化的研究，能提示单核细胞向淋巴管内皮细胞转分化的可能性。
研究发现，从人类血中分离培养cd34-cd14+单核细胞，表达特异性内皮细胞表面标志物的细胞的比例随时间推移增加，到第4周时，表达vwf、ve-cadherin和e-nos的细胞比例分别达到94.2%，89.7%和58.8%，在三维基质胶中，这些细胞形成了条索状或管状结构，表明这些细胞聚集可能是参加血管生成的[4]。
淋巴细胞的分离及鉴定
淋巴细胞的分离及鉴定离⼼分离技术与淋巴细胞分离及鉴定【实验⽬的】1.了解离⼼分离技术的原理与分类。
2.掌握应⽤密度梯度离⼼法分离单个核细胞及B淋巴细胞鉴定的⽅法。
【实验原理】1.利⽤离⼼⼒将悬浮液中的悬浮微粒快速沉降，借以分离⽐重不同的各种物质成分。
因此⽤⽐重与被分离细胞⽐重相近的细胞分离液则可通过密度梯度离⼼⽅法，在分离液界⾯上收集到所需要的单个核细胞。
2.⽤过氧化物酶标记的抗IgM，在⼀定条件下与淋巴细胞混合，标记的抗IgM抗体可以与B细胞表⾯的IgM结合，通过DAB显⾊，在普通光学显微镜下观察可见细胞膜上出现特定染⾊。
【实验步骤】⼀.细胞分离1.将⼩⿏⽤颈椎脱⾅法处死，解剖左侧腹腔靠上部位，将腹膜剪开，找到并取出脾脏。
2.将脾脏置于培养⽫内100⽬筛⽹上，加⼊8ml的⽣理盐⽔，⽤磨棒磨碎脾脏后过滤，即获得脾细胞混合悬液。
3.1500rpm,5min,离⼼细胞混合悬液，弃部分上清，调整体积⾄4ml,重悬细胞。
4.取盛有3ml细胞离⼼液（⽐重1.088）的试管⼀⽀，⽤移液器加⼊细胞混合液4ml。
5.将试管离⼼1800rpm，（上升和下降率为2）20℃30min。
6.离⼼后取出试管，观察细胞分层，底层为红⾊的红细胞，依次向上为细胞分离液和⽣理盐⽔，在此之间可见⼀层淡淡地⽩⾊细胞层。
7.⽤尖吸管⼩⼼取出中层间的细胞到另⼀洁净离⼼管，并加2ml PBS洗涤⼀次，1500rpm离⼼5min后去上清。
8.再将细胞均匀悬浮于0.1ml PBS中，取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚上，⾃然⼲燥后，可进⾏细胞类型鉴定。
⼆.细胞鉴定1.分离出单个核细胞并取出10µl滴于黏附剂处理的载玻⽚左右各⼀滴涂⽚，⾃然⼲⽚2.在室温条件下，⽤甲醇固定细胞，⾃然⼲燥后⽤蜡笔标出细胞范围，蒸馏⽔洗三次。
3.配制封闭液。
室温浸泡30分钟，PBS洗3次。
4.滴加适当稀释（1:100）的过氧化物酶标记的兔抗⼩⿏IgM抗体于左侧涂⽚，滴加适量的封闭液于右侧涂⽚（做阴性对照），于37℃30分钟，PBS洗2分钟3次。
淋巴细胞的分离和功能检测
吸出白色云雾状单个核细胞层，洗涤3次备用
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7
密度梯度分离单个核细胞 （Ficoll分层液）
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8
细胞活性： ＞95%
单个核细胞纯度：＞95%
细胞获得率： ＞80%
最佳温度： 20℃
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Percoll分离法
属于连续密度梯度离心分离法
Percoll：包有乙烯吡咯顽酮的硅胶粒 特点：渗透压低、黏度小、无毒
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单核细胞去除法
粘附法
单核细胞37℃下能粘附在塑料或玻璃表面， 淋巴细胞则不能，将PBMC置于细胞培养 瓶中培养1小时，即可去除单核细胞。
淋巴细胞纯度：＞95%
活性：＞95%
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L-亮氨酸甲酯法
L-亮氨酸甲酯在溶酶体酶的作用下可转化成 有毒L-亮氨酸- L-亮氨酸甲酯，导致单核细胞破坏。 同时可去除NK细胞和Tc细胞。
alkaline phosphatase technique)
碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶桥联酶染色 法(APAAP法)，用兔抗鼠IgG起搭桥作用， 其中一个Fab段连接McAb ，另一个Fab段 连接APAAP复合物， 再通过复合物中的碱 性磷酸酶催化底物显色来判断抗原分子的 存在。
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APAAP酶免疫桥联法
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T细胞增殖功能测定
单向混合淋巴细胞培养
5. 计算相对反应（RR）
（实验组cpm－阴性对照组cpm） RR＝
阳性对照组cpm－阴性对照组cpm
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T细胞增殖功能测定
单向混合淋巴细胞培养
注意点
1. 细胞活力：使用冷冻细胞时，复苏后应检查细 胞活力。 2. 培养液中添加的血清：有的血清可能会刺激或 抑制反应。 3. 本底应小于2000 rpm，阳性对照组应大于 20000 rpm。
淋巴细胞分离实验报告
淋巴细胞分离实验报告淋巴细胞分离实验报告引言：淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，具有免疫应答和免疫调节的功能。
淋巴细胞分离实验是研究淋巴细胞功能的重要手段之一。
本实验旨在通过离心法和梯度离心法分离和纯化淋巴细胞，并验证其纯度和活力。
实验材料：- 血液样本- PBS缓冲液- 淋巴细胞分离液- Ficoll梯度离心液- 离心管- 移液管- 显微镜- 细胞计数板- 无菌培养皿- 37℃恒温培养箱实验步骤：1. 血液预处理：将新鲜的血液样本加入无菌离心管中，加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。
注意避免气泡的产生。
2. 离心分层：将离心管放入离心机中，以2000rpm的速度离心10分钟。
离心后，可观察到血液分为三个层次：上层为血浆，中层为白细胞和淋巴细胞，下层为红细胞。
3. 分离淋巴细胞：将中间层的白细胞和淋巴细胞转移至新的离心管中，加入等体积的PBS缓冲液。
轻轻混合后，以1000rpm的速度离心10分钟。
此步骤的目的是去除红细胞和血浆。
4. 梯度离心：将混合后的细胞悬液加入离心管中，并缓慢滴加Ficoll梯度离心液。
注意避免两种液体混合。
离心管中的液体应该形成明显的两层。
5. 离心分层：将离心管放入离心机中，以1500rpm的速度离心30分钟。
离心后，可观察到淋巴细胞在上层梯度液中形成一个白色的浑浊环。
6. 分离淋巴细胞：使用移液管将上层梯度液中的淋巴细胞转移至新的离心管中。
加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。
以1000rpm的速度离心10分钟，去除梯度液。
7. 洗涤淋巴细胞：将淋巴细胞沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，以去除梯度液和离心液中的残留物。
8. 细胞计数和活力检测：取适量的淋巴细胞悬液，用细胞计数板进行细胞计数，并观察细胞形态。
同时，使用显微镜观察细胞的活力和完整性。
结果与讨论：通过以上实验步骤，我们成功地分离和纯化了淋巴细胞。
在离心分层和梯度离心的过程中，红细胞和血浆被有效地去除，从而得到了较为纯净的淋巴细胞。
鉴定新生淋巴管的特异性的内皮标志物
鉴定新⽣淋巴管的特异性的内⽪标志物2019-06-13【摘要】在淋巴管新⽣的研究中，最后如何来确定新⽣的管道是否是真正的淋巴管，⼀⽅⾯就需要检测淋巴管内⽪细胞特异性标记物的表达。
淋巴管内⽪细胞特异性表达Prox-1，LYVE-1，Podoplanin和VEGFR-3，并且这些受体和因⼦对淋巴管的新⽣起重要的调节作⽤。
【关键词】淋巴管；淋巴系统；特异性；标志物淋巴管作为⼈体淋巴系统的⼀部分，发挥重要作⽤，⽐如，维持体内的微环境稳态，免疫反应和淋巴结转移等。
临床淋巴管先天性发育障碍、⼿术创伤等均会导致淋巴管的缺失或阻塞，导致引流不畅，是引发肢体慢性淋巴⽔肿主要的原因。
例如，近年来，乳腺癌的发病率正在上升，⽽乳腺癌根治术需要清扫腋窝淋巴结，切断了⼤批的淋巴管，导致并发上肢淋巴⽔肿的约占15%-20%[1]，轻者通过建⽴侧⽀循环⽽缓解，严重的则会导致上肢功能的障碍，影响他们的⽣活质量。
然⽽，长期以来，国内外，主要采⽤烘绑绷带、⼿术和其他治疗⽅法促进淋巴回流，很难从根本上治疗淋巴⽔肿。
其实，促进淋巴管的新⽣是治疗淋巴⽔肿的关键问题。
因此，研究淋巴管新⽣对于治疗淋巴⽔肿及相关疾病具有重要意义。
在研究中，最后在鉴定新⽣淋巴管时，需要检测淋巴管内⽪细胞特异性标记物的表达，本⽂就对⼏种重要的淋巴管内⽪特异性标志物进⾏概述。
1.Prox-1Oliver等⼈于1993年在⼤⿏中发现同源异形盒转录因⼦Prox-1，主要在发育中的中枢神经系统、视⽹膜、晶状体、胰腺、肝脏和⼼脏表达[2]。
1997年，Hassan等⼈⾸次从同源果蝇基因-普洛斯彼罗基因，克隆出Prox-1基因[3]。
Wigle and Oliver在后来的研究中表明，⿏胚胎发育的第9.5天，在主静脉腹侧部内⽪细胞的⼀个亚群出现Prox-1的表达；在实施Prox-1基因敲除的⿏胚胎，发育到11.5-12.0天时，淋巴管内⽪细胞停⽌从主静脉出芽，最终不能形成淋巴管，导致出⽣后不久死亡，但是，发现⾎管发育没有受到影响；因此，认为主静脉内⽪细胞出芽及细胞向淋巴管内⽪细胞转化的过程中，Prox-1的存在都是必需的，对于淋巴管的发⽣起关键作⽤[4]。
淋巴管实验报告
一、实验目的1. 观察淋巴管的形态结构。
2. 学习淋巴管与血管的区分方法。
3. 掌握淋巴管的分布特点。
二、实验材料与仪器1. 实验材料：人体解剖图谱、新鲜人体组织标本、显微镜、载玻片、盖玻片、染色液等。
2. 实验仪器：显微镜、解剖镜、剪刀、镊子、解剖盘、解剖针等。
三、实验步骤1. 观察淋巴管的形态结构（1）取新鲜人体组织标本，将其置于解剖盘上。
（2）用解剖针轻轻挑开皮肤，暴露出淋巴管。
（3）用剪刀剪取一段含有淋巴管的组织，将其置于载玻片上。
（4）用盖玻片覆盖，观察淋巴管的形态结构。
2. 淋巴管与血管的区分（1）观察淋巴管的管壁结构，血管壁由内膜、中膜和外膜组成，淋巴管壁较薄，主要由内皮细胞构成。
（2）观察淋巴管内的淋巴液，淋巴液呈乳白色，含有脂肪、蛋白质等物质，而血管内的血液呈红色。
3. 淋巴管的分布特点（1）观察淋巴管的分布，淋巴管广泛分布于人体各部位，如皮肤、肌肉、内脏等。
（2）淋巴管在器官内部呈网状分布，器官周围的淋巴管呈放射状分布。
四、实验结果与分析1. 淋巴管的形态结构观察结果显示，淋巴管呈管状，管壁较薄，主要由内皮细胞构成。
淋巴管内含有淋巴液，淋巴液呈乳白色。
2. 淋巴管与血管的区分通过观察，淋巴管与血管在管壁结构和淋巴液颜色上存在明显差异。
淋巴管壁较薄，淋巴液呈乳白色，而血管壁较厚，血液呈红色。
3. 淋巴管的分布特点淋巴管广泛分布于人体各部位，器官内部的淋巴管呈网状分布，器官周围的淋巴管呈放射状分布。
五、实验结论通过本次实验，我们观察了淋巴管的形态结构、淋巴管与血管的区分方法以及淋巴管的分布特点。
实验结果表明，淋巴管在人体内具有重要的作用，包括输送淋巴液、清除组织液中的废物和细胞碎片等。
了解淋巴管的形态结构和分布特点，有助于我们更好地认识人体淋巴系统的功能。
六、注意事项1. 实验过程中，注意操作轻柔，避免损伤组织标本。
2. 观察淋巴管时，注意区分淋巴管与血管，以免误判。
3. 实验结束后，妥善处理实验材料，保持实验室卫生。
淋巴管内皮细胞特异性标志物的研究进展
淋巴管内皮细胞特异性标志物的研究进展恶性肿瘤是危害人类健康和生命的重要原因之一。
肿瘤淋巴道转移是肿瘤发展的标志，而肿瘤淋巴管新生可以促进肿瘤淋巴道转移。
肿瘤细胞和其淋巴管内皮细胞间的相互影响在肿瘤淋巴道转移过程中起着重要作用。
近年来，随着一系列淋巴管内皮细胞特异性标志物的发现，关于肿瘤淋巴管的研究已成为阻断肿瘤细胞转移的新方向。
本文对淋巴管内皮细胞特异性标志物及淋巴管内皮细胞的生长调节因子做如下总结。
1淋巴管内皮细胞特异性标志物1.1淋巴管内皮细胞透明质酸受体-1( LYVE -1)LYVE-1 是透明质酸（HA）进入淋巴系统的淋巴特异性受体，存在于淋巴管腔内表面和外表面，主要在淋巴管内皮细胞上表达。
它在鉴别组织淋巴管有很高的特异性，可以用于免疫组织化学和蛋白质分析中，用形态学方法可以清楚的区分血管和淋巴管。
LYVE-1在正常组织及肿瘤相关的淋巴管内皮细胞上表达，在血管内皮中不表达[1]。
LYVE-1的表达增高与宫颈癌、大肠癌、胃癌、肝细胞癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢上皮肿瘤、甲状腺癌等的发展和转移有关，对于肿瘤相关淋巴管内皮细胞的标记和鉴定有重要价值。
1.2血管内皮生长因子受体-3( VEGFR-3)VEGFR称作血管内皮生长因子受体，是酪氨酸激酶受体家族成员之一。
它可以使淋巴管内皮细胞增殖、分化、迁移，对淋巴管发育及早期血管发育发挥重要作用[2]。
VEGFR-3在淋巴管生成过程中也发挥重要作用，VEGFR-3缺失可以引起淋巴管生成障碍，可以引起肢体水肿和腹水。
VEGRF-3是血管内皮细胞生长因子VEGF-C和VEGF-D的受体[3]。
肿瘤细胞可以自分泌或旁分泌VEGF-C和VEGF-D,通过配体VEGF-C、VEGF-D与受体VEGFR-3结合后激活MAPK和Akt信号转导通路，使VEGFR-3磷酸化，导致淋巴管内皮细胞产生趋化因子，进而使肿瘤细胞向淋巴管迁移，可以促进淋巴管内皮细胞增殖，诱导淋巴管内皮细胞新生，促进淋巴管新生和肿瘤细胞淋巴管转移。
淋巴管内皮特异性标志物LYVE-1在肿瘤淋巴管生成中的研究
淋巴管内皮特异性标志物LYVE-1在肿瘤淋巴管生成中的研究张志强;桑晶;韩玉贞【摘要】研究恶性肿瘤淋巴道转移发生、发展的机制在肿瘤的治疗中有着重要的价值.近来随着淋巴管内皮特异性标志物LYVE-1在肿瘤淋巴管生成中的广泛研究,有望在肿瘤淋巴结转移的研究中有重大突破,为临床抗肿瘤淋巴管生成的治疗提供新的理论依据.现对LYVE-1的结构和功能特点、表达的特异性以及在淋巴管生成中的作用进行综述.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2010(016)006【总页数】3页(P853-855)【关键词】LYVE-1;淋巴管生成;肿瘤转移【作者】张志强;桑晶;韩玉贞【作者单位】滨州医学院病理学教研室,山东,滨州,256603;滨州医学院病理学教研室,山东,滨州,256603;滨州医学院病理学教研室,山东,滨州,256603【正文语种】中文【中图分类】R365淋巴道转移是恶性肿瘤常见的转移方式,在肿瘤的研究中处于重要的地位。
由于长期以来缺乏淋巴管的特异性标记物,在鉴定组织中的淋巴管、分离纯化淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelium cell,LEC)上存在技术上的困难,鉴别淋巴管的方法只局限于形态学和繁琐的差别染色法,所以淋巴系统在分子生物学方面的研究始终没有长足的进步。
近来发现了多种淋巴内皮特异性标志物,如淋巴管内皮透明质酸受体 1(lymphatic vessel endothelial HA receptor-1,LYVE-1)、肾小球足细胞膜糖蛋白(podop lanin)、转录因子 Prox1等;尤其是 LYVE-1目前被认为是特异性最强的淋巴管内皮特异性标志物之一,现对其结构和功能的特点、在淋巴管内皮细胞表达的特异性以及在肿瘤淋巴管生成中的作用综述如下。
LYVE-1是 Banerji等[1]在研究透明质酸(hyaluronic acid,HA)在体内的代谢过程及其受体 CD44的结构和生理作用时发现的一种新的 HA受体。
内皮细胞成管实验步骤
内皮细胞成管实验步骤内皮细胞是一种具有重要生物学功能的细胞类型，其在血管形成和维持血管功能方面起着关键作用。
内皮细胞成管实验是一种常用的实验方法，用于研究内皮细胞的管腔形成能力和血管生成的机制。
下面将介绍内皮细胞成管实验的详细步骤。
步骤一：细胞培养和准备1.1 培养内皮细胞：从小鼠或人的血管组织中分离内皮细胞，并将其培养在含有内皮细胞培养基的培养皿中，细胞密度一般为1×10^4 - 1×10^5个细胞/ml。
1.2 细胞的准备：用内皮细胞培养基洗涤细胞，将细胞悬浮于含有血清的培养基中。
步骤二：细胞的涂层和培养2.1 准备基质涂层：在培养皿中加入适量的基质涂层溶液（如胶原、玻璃纤维基质等），在室温下静置1小时或在4°C下静置过夜。
2.2 细胞的涂层：将细胞悬液加入基质涂层的培养皿中，使细胞均匀分布在涂层表面。
2.3 培养细胞：将培养皿放入细胞培养箱中，以37°C、5% CO2的条件下培养。
步骤三：细胞的处理和观察3.1 添加适当的刺激物：在培养基中加入适当的刺激物（如VEGF、FGF等），以促进内皮细胞的管腔形成。
3.2 处理时间的控制：根据实验的需要，控制细胞处理的时间，通常为24-72小时。
3.3 细胞的观察：使用光学显微镜观察培养皿中的细胞形态变化，特别注意细胞的管腔形成情况。
步骤四：结果分析和图像获取4.1 细胞成管评价：根据观察到的管腔形成情况，使用成管指数等评价指标对细胞成管能力进行定量分析。
4.2 图像获取：使用显微镜和成像设备获取细胞成管的图像，用于结果展示和进一步分析。
步骤五：数据分析和结果呈现5.1 数据的统计分析：使用合适的统计学方法对实验结果进行分析，比较不同处理组之间的差异。
5.2 结果的呈现：将实验结果以表格、图表或图片的形式进行呈现，准确描述实验结果和得出的结论。
内皮细胞成管实验是研究内皮细胞生物学功能的重要方法之一。
通过对内皮细胞的培养、处理和观察，可以深入了解内皮细胞的管腔形成过程和相关的信号通路。
人外周血淋巴细胞分离管说明书
人外周血淋巴细胞分离管说明书【产品名称】产品名称：人外周血淋巴细胞分离管英文名称：Lymphocyte Separation Tube for Human Peripheral Blood【包装规格】货号产品描述规格7922112筛板分离管，单支规格为15ml20支/盒7922021筛板分离管，单支规格为50ml25支/盒【预期用途】用于从人外周抗凝全血中分离淋巴细胞。
【检测原理】本品采用密度梯度沉降法，根据细胞密度差异，借助分离液和离心，进行细胞分离纯化。
细胞梯度密度分离液产生一定程度的密度梯度，将抗凝全血倒入分离管。
离心后，红细胞、粒细胞沉于管底；PBMC（单个核细胞，包括淋巴细胞和单核细胞等）漂浮于分离液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分离液中。
吸取分离液液面的细胞，就可从外周血中分离到淋巴细胞。
【检验方法】1.检查。
如图（A）所示。
取出分离管，观察筛板材料之上是否有游离的分离液，筛板下方是否有气泡。
如果有，请用离心机20℃，800g，离心1min。
2.倒入血液。
血液样品必须为抗凝全血，无需稀释。
如图（B）所示。
3.离心。
20℃，800g，15min。
设置较慢的加速与减速（如果共有十档且第十档为最高档，加速与减速应该调整到第三档）。
4.将部分血浆吸出后，直接将筛板上方剩余的少量血浆、PBMC细胞层和少量分离液直接倒入干净的离心管中。
如图（C）所示，PBMC层在血浆下面，分离液上面。
5.RPMI1640洗涤1-2次（20℃，250g，10min）。
用0.9%(W/V)生理盐水或合适的培养基将淋巴细胞重悬备用。
人外周血淋巴细胞分离管分离血液的过程【主要组成成分】本品为筛板管，主要组成成分是聚蔗糖、泛影酸及PP或PE材质筛板。
【储存条件及有效期】未开封2~30℃避光保存，有效期为2年。
【适用仪器】水平转子离心机。
【样本要求】本品要求样本为新鲜的抗凝血，血液收集时应无菌操作且储存、处理和运输过程中避免冷冻和冷藏。
淋巴管内皮细胞特异性标志物研究现状与探讨
Ｐｏ ｒｘ一１ 初是 由黑 腹 果 蝇 ｐｏ ｅｏ基 因 克 隆 而 最 ｒｓ ｒ ｐ 来 的同源性 基 因¨ Ｐｏ ， ｒｘ一１表达 于 以 出芽方 式 形 成
的 内皮 细 胞 亚 群 ， 后 产 生 淋 巴 系 统 ， 乏 Ｐ ｏ 最 缺 ｒｘ—Ｊ
、
ＶＥ Ｒ 一 （ Ｌ 一 ＧＦ ３ Ｆ Ｔ ４）
１９ ９ ２—１ ９ ９ ３年 ， ａ ｓｌ Ｐｊ ｏａ ｕ ｋ等 、 ａｌ ｄ等 分 Ｃ ｌｎ ａ 别 克 隆并 定位 了 ｆｔ ４基 因。此 后 ， 发 现 ｎ 一 ｉ 一 又 ｔ ４虽 然在 结 构 上 与 ｆ 一１ Ｖ Ｇ Ｒ 一１ 、 ｋ一１（ Ｄ ／ ｉ ｔ （ＥＦ ）ｆ ｉ Ｋ Ｒ Ｖ Ｇ Ｒ一 ） 似 ， 在 功 能 上 明 显不 同 ， Ｅ Ｆ ２相 但 因为 ｎ 一４ ｔ 不能 与 Ｖ Ｇ Ｅ Ｆ结 合 ， ｆ 一１ ｆ 而ｉ ｔ 、 ｋ一１可作 为 Ｖ Ｇ ｉ Ｅ Ｆ的 受体 ， ａ ａｎｎ等 的实验 表 明 ， 胚 胎 期 ｎ 一 Ｋ ｉ ｉｅ ｐ 在 ｔ ４定 位于 发育 中的静 脉和淋 巴管 ， 在胚 胎 后期 及成 人组 但 织 中 ，ｆ 一 Ｒ Ａ主要 定位 于淋 巴管 和 一些 高 内皮 ｉ ４ｍ Ｎ ｔ 小静 脉 。 由此 提 出 ， ｔ ４可作 为 淋 巴管 的一 种 特 异 ｎ一 性 标志 物 。１９ ９ ６年 Ｊｕ ｏ ｏ ｋｖ等 首 次 克 隆 了 ｎ 一 ｔ ４的 配体 Ｖ Ｇ Ｅ Ｆ—Ｃ ｃ Ｎ Ｄ Ａ并 将 ｆ 一 ｉ ４重新 命 名为 Ｖ Ｇ Ｒ ｔ Ｅ Ｆ
一
３ 认 为 Ｖ Ｇ Ｒ一 ， Ｅ Ｆ ３主要 表 达 于 成 年 组 织 淋 巴管 内
皮 细 胞 以及胚 胎 时期 的血 管 内皮细 胞 ， 在骨 髓 、 、 脾 肝 雪窦 、 肾小 球 和 内分泌腺 的有孑 毛 细血 管 以及肿 瘤 新 Ｌ 生毛 细血 管 中也有 表达 。 。 。
淋巴管内皮细胞特异性标志物研究进展
５ 桥粒相关转膜糖蛋 白（ ｅ ｍｏ ｌ ｉ） Ｄｓ ｐ ｋ ａｎ
Ｄ ｓ ｏｌ ｉ 一 种 表 达 于 细 胞 间连 接 处 的 桥 粒 蛋 白 ， ｅｍ ｐ ｎ是 ￣
又称桥粒相关跨膜蛋 白， 属于细胞 骨架连接蛋 白的血小板容 素家族成员。Ｄ ｓ ｏｌｋ ｅｍ ｐａｉ 表达 于淋 巴管 内皮细胞 ， 一 ｎ仅 是 种新的淋巴管内皮标 记物 。Ｅ ａ ｂｔ ａ等” 训采用 免疫组 化技 术 和免疫电镜等 比较 了 Ｄ ｓ ｏ ｌ ｉ、 ， ｅｍ ｐ ｋｎ５＿ ａ 核苷酸酶 、 层粘 连蛋 白
Ｖ － 在淋 巴管生成 中的作用 机制 尚不清楚 ， Ｅ１ 推测可 能与 透 明质酸结合促进淋 巴管内皮细胞迁移至局部组织 ， 进而形成
新的淋 巴管 。
４ 同源 转 录 因 子 （ ｒｘ１ Ｐｏ－）
子， 特异地表 达 于成 人淋 巴管 内皮 细胞。在 骨骼 、 、 脾 肝血 窦、 肾小 球 和 内分 泌 腺 的 有孔 毛 细 血 管 中 亦 可表 达 【２。 １ｊ ．
淋 巴管生成情况 ， 发现其表达限于单一内皮细胞层 的薄壁淋
巴管 ， Ｃ ， 色阳性血管数无关 。但 Ｐ ｄｐａｉ 在淋 巴内 与 Ｄ。 染 ｏｏ ｌ ｎ ｎ 皮细胞 中的作用 尚不 清楚。Ｋ ｔ ｒ ａ等 研 究 发现 ， 过 ａ ａｉ ｈ ｎ 通
Ｃ 和 Ｐｄ ｐ ｎｎ双重染色可区分淋巴管 和毛细血管。 Ｄ ｏｏｌ ｉ ａ
达， 故其特 异性并不 理想 。
２ 肾 小 球 足 突 细 胞 膜 聋 白（ ｏ ｏ ｌ ｉ） Ｐ ｄ ｐａ ｎ ｎ Ｐｄ ｐａｉ 在 肾小 球 足 突 细 胞首 先证 实 的一 种 整 合 胞 ｏｏｌｎ ｎ是
质胞膜黏蛋 白， 相对 分子质量 为 ４ ３×１’ ａ 起控 制足 细胞 ０Ｄ， 形态作用 。目前仅发现其 表达于小淋 巴管内皮 和皮肤组 织 中某些血管 内皮细胞 ， 故认为是较理想的淋巴管内皮细胞标 志物 。王艳等 以 Ｐ ｄｐａｉ ｏｏ ｌ ｎ检测肺 恶性肿 瘤和 炎性假 瘤 ｎ
乳腺癌淋巴管生成的研究进展
乳腺癌淋巴管生成的研究进展摘要：淋巴管转移是乳腺癌转移的主要途径之一，而淋巴管生成已成为研究的热点。
本文从淋巴管生成机制、淋巴管内皮标志物、淋巴管生成调控因子、淋巴管生成与转移以及临床抗淋巴管生成的靶向治疗几个方面对乳腺癌淋巴管生成的研究作一综述。
关键词：乳腺癌淋巴管生成淋巴转移【中图分类号】r-0【文献标识码】b【文章编号】1671-8801（2013）04-0069-01通过淋巴管转移是乳腺癌扩散的主要方式，这与淋巴管生成关系非常密切。
近年来随着淋巴管生成信号途径的阐明以及淋巴内皮细胞分子标记物的发现和淋巴内皮细胞的成功分离和培养，淋巴管的生成已逐渐成为研究的热点。
1乳腺癌淋巴管生成的模式乳腺癌淋巴管生成是指在癌原位形成新的毛细淋巴管。
skobe等[1]用乳腺癌细胞株在动物模型中证明，肿瘤可以诱导其内部和周围的淋巴管生成。
有研究揭示了毛细淋巴管起源于成熟淋巴管细胞，并且提出了两种学说[2]：①从淋巴管细胞分化形成淋巴管内皮组织；②从已经形成的静脉通过萌芽的方式形成淋巴管。
目前研究证明，肿瘤组织内存在淋巴管生成现象，且淋巴管生成与血管生成一样，需要有一定信号刺激才发生变化，淋巴管生成调控因子在淋巴管生成中起着重要作用。
2乳腺癌淋巴管生成的调控-淋巴管生成调控因子2.1血管内皮细胞生长因子（vegf）及其受体（vegfr）。
vegf[3]包括vegf-a、b、c、d、e及胎盘生长因子（pigf），vegfr包括vegfr-1、2、3三种结构相似的酪氨酸激酶受体。
其中，vegf-c和vegf-d与微淋巴管生成有关，对促进淋巴管生成有独特的作用，是促淋巴管生成的主要调控因子。
vegfr-3作为vegf-c/d活化的酪氨酸激酶受体，其主要表达于成年组织的淋巴管内皮细胞上，是介导淋巴管生成的重要信号分子。
2.2环氧化酶-2（cox-2）。
cox-2是前列腺素合成中重要的限速酶。
timoshenko等[4]在对乳腺癌患者的研究中发现cox-2mrna表达水平与vegf-c和lyve-1表达水平有显著关联，通过cox-2 sirna 途径可以下调cox-2mrna表达水平，从而减少vegf-c的分泌。
人类淋巴管内皮细胞特异性标志物的筛选及表达特征研究
人类淋巴管内皮细胞特异性标志物的筛选及表达特征研究淋巴管是人体重要的免疫器官之一，它通过逐渐细分成支持诸如淋巴细胞、抗原递呈细胞等免疫细胞的两个系统：淋巴和淋巴管。
淋巴管内皮细胞(LVEC)是淋巴系统中的重要成分之一，主要存在于淋巴网中，肝脏、脾脏和淋巴结等一些特殊组织中。
LVEC具有多种生物学特性，包括分泌生长因子、负责压力调节、免疫调节等等。
因此，在淋巴系统中进行疾病预防和治疗，研究LVEC的特异性标志物以便高通量的鉴定和检测有可能使我们开发新的治疗策略。
LVEC的研究中，标志物的筛选是首要任务。
在过去的10年，研究者们多次对LVEC的标志物进行鉴定和筛选，提出了多个可能的标志物，包括LYVE-1、Prox-1、Podoplanin、Nrp2等。
其中，LYVE-1是常被用作LVEC标志物的一个分子，它是一个肝酶样受体，可与毒素等物质结合。
但是，它有时也会出现在血管内皮细胞(VEC)上，这会影响到它的特异性。
另外的标志物Podoplanin，则更多是在癌细胞的诊断和治疗中应用广泛，在LVEC的诊断和治疗方面，它的用途较少。
综合上述，对LVEC标志物的研究仍然需要不断深入。
为了进一步了解LVEC标志物的筛选情况以及特征，我们针对LYVE-1、Prox-1和Podoplanin进行了进一步研究。
我们利用实时荧光定量PCR(qPCR)和免疫组织化学技术(IHC)分析了这三种标志物在LVEC中的表达特征。
使用qPCR提取肿瘤患者和正常组织中的LVEC mRNAs，分别对LYVE-1、Prox-1和Podoplanin进行量化。
结果发现，在常规条件下，LYVE-1表达水平在正常组织中略高于Prox-1和Podoplanin。
在肿瘤组织中，LYVE-1和Prox-1都明显高于Podoplanin，而在LVEC富集的组织中，三者表达水平各异，无法得出明确的结论。
此外，我们还采用IHC技术检测了这三种标志物蛋白在正常组织和不同肿瘤组织中的表达情况。
一种小鼠硬脑膜淋巴管的分离与标记方法
一种小鼠硬脑膜淋巴管的分离与标记方法
1 硬脑膜淋巴管的分离与标记
小鼠硬脑膜淋巴管是帮助小鼠的免疫系统发挥作用的重要组织，
为进行病毒感染、免疫机制、衰老以及高血压等研究进行分离和标记
具有重要意义。
因此，一种有效的小鼠硬脑膜淋巴管分离与标记方法
的建立显得尤为重要。
本研究提出了一种有效的小鼠硬脑膜淋巴管分离与标记的方法，
该方法包括以下步骤：第一步，将小鼠的头部和胸部用血浆垫住，然
后从头部脸部横向裁开，得到下颌和面颊之间的血管组织块；第二步，将血管组织块用乙醇抗菌液清洗并保存；第三步，将血管组织块用解
剖钳从硬脑盖和硬脑底慢慢剥离；第四步，用抗性棉针将淋巴管从血
管组织中勾引出来，将其剪断；第五步，将淋巴管用原生凝胶培养，
进行免疫细胞学分析与标记。
实验结果表明，使用本文方法从小鼠硬脑膜组织中分离的淋巴管
保持完整，可以显示淋巴管内部的结构特征，并且可以有效进行细胞
标记。
本研究方法为研究小鼠硬脑膜淋巴管的病毒感染、免疫机制、
衰老以及高血压等提供了一种新的研究技术，能够客观反映小鼠组织
的变化趋势，为小鼠免疫组织疾病的研究提供了依据。
本研究中提出的硬脑膜淋巴管分离与标记方法是一种有效的、安
全的、实用的方法，可以有效地用于小鼠组织的淋巴管的分离与标记，将为研究小鼠疾病的免疫机制及其他病理机制提供有用的细胞数据。
2 结论
本研究提出的硬脑膜淋巴管分离与标记方法是一种简单、有效、
安全的实验方法，能有效地用于小鼠组织硬脑膜淋巴管的分离与标记，以辅助研究小鼠疾病的免疫机制及其他病理机制。
淋巴管生成实验操作流程
淋巴管生成实验操作流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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关于淋巴管内皮细胞的分离和鉴定
关于淋巴管内皮细胞的分离和鉴定淋巴系统是由广泛的淋巴管网络组成，主要功能是收集组织间隙中的液体和蛋白质并将它们输入循环系统，同时也是白细胞和肿瘤细胞的进出口。
淋巴管通过引导白细胞和抗原从组织到淋巴结在启动免疫反应中发挥重要作用。
因此，淋巴系统在维持组织液平衡、参与肿瘤转移和调节免疫等功能中扮演重要角色。
淋巴管内皮细胞衬覆于淋巴系统管道的管腔面，是构成淋巴管壁的主要结构。
近年来，随着人们对淋巴管系统认识的不断深入，淋巴管内皮细胞逐渐成为研究热点。
淋巴管瘤是由淋巴管内皮细胞增生和扩张形成的一种良性肿瘤，好发于舌、唇、颊及颈部。
淋巴管瘤通过压迫和浸润周围组织引起组织器官功能破坏，目前治疗以手术为主，但存在术后容易复发等问题。
有学者采用局部注射博莱霉素，或者高渗盐水等，但可能引起周围组织的免疫反应或瘢痕回缩，导致原始病症扩大。
因此，人们期待新的治疗方法，从而克服上述治疗方法的缺陷。
迄今为止，淋巴管瘤病因仍不清楚。
本研究体外分离培养淋巴管瘤相关淋巴管内皮细胞，为研究淋巴管新生在淋巴管瘤复发及肿瘤淋巴结转移中的作用提供体外细胞模型。
1 材料与方法1.1 材料M199培养基、DMEM 培养基和胎牛血清均购于Gibco公司;胶原酶和collagen typeⅠ均购于sigma公司;鼠抗人FLT-4单克隆抗体购于Santa Cruz;兔抗人L YVE-1多克隆抗体购自RD公司;HRP-羊抗兔、HRP-羊抗鼠二抗均购于北京金桥公司;Cultrex BME 购于Trevigen公司;VEGF-C购于BD公司。
舌淋巴管瘤标本来源于武汉大学附属口腔医院，本研究获得武汉大学附属口腔医院伦理委员会的批准。
1.2 淋巴管内皮细胞分离培养舌淋巴管瘤标本分成两块，其中一块用4%多聚甲醛固定做蜡块，另一块置于冰M199培养基中(其中含10mg/L两性霉素、100u/mL青霉素、100mg/L链霉素和10%胎牛血清)用于分离细胞。
组织取回后，在超净台内用Hanks液洗数次，用剪刀取出肿瘤周围的组织，将瘤块剪成约0.5mm0.5mm0.5mm 大小，用0.25%(w/v，胶原酶/无血清DMEDM)胶原酶在37℃条件下消化45～60min;消化产物通过30mm孔径大小的过滤网过滤，过滤液1200r/min10min离心，然后用HankS液洗3次再次离心，用EGM 完全培养基重悬细胞，移至T25培养瓶，37℃、5%CO2培养箱中培养。
小鼠淋巴管内皮细胞使用说明
小鼠淋巴管内皮细胞小鼠淋巴管内皮细胞产品说明：为使客户能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。
派瑞金提供的小鼠淋巴管内皮细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。
研发的小鼠淋巴管内皮细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。
同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。
注意事项：1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。
2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。
3. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。
培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和客户自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。
4. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。
5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。
小鼠淋巴管内皮细胞产品简介：产品名称：小鼠淋巴管内皮细胞（Mouse Lymphatic Endothelial cells）组织来源：小鼠正常淋巴组织（小鼠品系客户可以指定，常规我们一般用C57）产品规格：5×105cells / 25cm2培养瓶小鼠淋巴管内皮细胞简介：小鼠淋巴管内皮细胞主要功能：1) 调节体液、蛋白和组织压力平衡2) 为免疫系统的重要组成部分小鼠淋巴管内皮细胞与主要病生理变化：1) 囊肿型淋巴管瘤2) 淋巴管炎3) 淋巴结核本公司生产的小鼠淋巴管内皮细胞采用弹性蛋白酶解法制备而来，细胞总量约为5×105cells/瓶，细胞纯度经vWF、Factor VIII 鉴定可达85%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。
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关于淋巴管内皮细胞的分离和鉴定
淋巴系统是由广泛的淋巴管网络组成，主要功能是收集组织间隙中的液体和蛋白质并将它们输入循环系统，同时也是白细胞和肿瘤细胞的进出口。
淋巴管通过引导白细胞和抗原从组织到淋巴结在启动免疫反应中发挥重要作用。
因此，淋巴系统在维持组织液平衡、参与肿瘤转移和调节免疫等功能中扮演重要角色。
淋巴管内皮细胞衬覆于淋巴系统管道的管腔面，是构成淋巴管壁的主要结构。
近年来，随着人们对淋巴管系统认识的不断深入，淋巴管内皮细胞逐渐成为研究热点。
淋巴管瘤是由淋巴管内皮细胞增生和扩张形成的一种良性肿瘤，好发于舌、唇、颊及颈部。
淋巴管瘤通过压迫和浸润周围组织引起组织器官功能破坏，目前治疗以手术为主，但存在术后容易复发等问题。
有学者采用局部注射博莱霉素，或者高渗盐水等，但可能引起周围组织的免疫反应或瘢痕回缩，导致原始病症扩大。
因此，人们期待新的治疗方法，从而克服上述治疗方法的缺陷。
迄今为止，淋巴管瘤病因仍不清楚。
本研究体外分离培养淋巴管瘤相关淋巴管内皮细胞，为研究淋巴管新生在淋巴管瘤复发及肿瘤淋巴结转移中的作用提供体外细胞模型。
1 材料与方法
1.1 材料 M199培养基、DMEM 培养基和胎牛血清均购于Gibco公司;胶原酶和collagen typeⅠ均购于sigma公司;鼠抗人FLT-4单克隆抗体购于Santa Cruz;兔抗人LYVE-1多克隆抗体购自RD公司;HRP-
羊抗兔、HRP-羊抗鼠二抗均购于北京金桥公司;Cultrex BME 购于Trevigen公司;VEGF-C购于BD公司。
舌淋巴管瘤标本来源于武汉大学附属口腔医院，本研究获得武汉大学附属口腔医院伦理委员会的批准。
1.2 淋巴管内皮细胞分离培养舌淋巴管瘤标本分成两块，其中一块用4%多聚甲醛固定做蜡块，另一块置于冰M199培养基中(其中含10mg/L两性霉素、100u/mL青霉素、100mg/L链霉素和10%胎牛血清)用于分离细胞。
组织取回后，在超净台内用Hanks液洗数次，用剪刀取出肿瘤周围的组织，将瘤块剪成约0.5mm0.5mm0.5mm 大小，用0.25%(w/v，胶原酶/无血清DMEDM)胶原酶在37℃条件下消化45～60min;消化产物通过30mm孔径大小的过滤网过滤，过滤液1200r/min10min离心，然后用HankS液洗3次再次离心，用EGM 完全培养基重悬细胞，移至T25培养瓶，37℃、5%CO2培养箱中培养。
1.3 免疫组织化学染色石蜡切片常规脱蜡至水，切片置枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中，用微波中高火加热5min，室温冷却，PBS缓冲液漂洗，5min加50L过氧化物酶阻断溶液，室温孵育15min，PBS缓冲液漂洗，5min吸干PBS缓冲液，加50L正常羊血清37℃ 封闭10min后吸去不洗;加适当稀释度的一抗4℃孵育过夜;PBS缓冲液漂洗，5min3次，加辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育30min;PBS缓冲液漂洗，5min3次，加新鲜配制DAB溶液染色，显微镜下观察出现阳性棕黄色着色时终止(5min);自来水冲洗，苏木素复染5min，1%盐酸酒精作用10s;自来水冲洗，1氨水浸泡30s;梯度酒精脱水(70%，80%，95%和
100%各2min)，二甲苯透明5min，中性树胶封片。
1.4 电镜标本的制备淋巴管内皮细胞接种后24h换液。
72h用
2.5%戊二醛磷酸缓冲液(pH 7.2)固定1h，然后用橡皮铲刮下贴壁生长的淋巴管内皮细胞，连同固定液移入离心管，离心(2000r/min)10min。
沉淀物用1%锇酸固定，梯度乙醇脱水，树脂包埋，超薄切片，枸橼酸铅及醋酸铀染色，日立H-600透射电镜下观察。
1.5 细胞增殖实验将淋巴管内皮细胞制成细胞悬液，进行细胞记数。
1104 个细胞接种于96孔板，加入含10%胎牛血清DMEM 200L，在37℃、5%CO2的培养箱中培养，1g/L MTT溶液加入每孔，培养4h，弃去MTT 溶液，每孔加入DMSO(二甲基亚砜)中止，振荡15min，酶标仪测定560nm波长的A 值，绘制曲线。
实验重复3次。
1.6 细胞体外成管试验取200LⅠ型胶原(2g/L)加入24孔板中，37℃作用30min，使胶凝固;每孔加入约1104 个淋巴管内皮细胞于胶表面。
置37℃、5%CO2培养箱中孵育培养7d，期间倒置显微镜观察并拍照记录，胶原胶固定于
2.5%戊二醛，透射电镜观察形成管腔的超微结构。
2 结果
2.1 舌淋巴管瘤标本HE染色及免疫组织化学染色 HE染色结果显示舌淋巴管瘤组织中有大量扩张和增生的淋巴管，管腔中未见血细胞，而见少量淡染的液体，为管腔内残留的淋巴液。
免疫组织化学染色结果显示，管腔中内皮细胞均高表达目前公认的淋巴管内皮细胞特异性标志物FLT-4、和LYVE-1，与文献报道一致。
因此，可以认为淋巴管
瘤为分离淋巴管内皮细胞提供了可靠的标本来源。
2.2 淋巴管内皮细胞的形态和超微结构原代培养淋巴管内皮细胞生长较为缓慢，单层贴壁生长，显微镜下见细胞呈扁平的梭形或多边形，大小均匀，胞核呈卵圆形，有核的区域较无核的区域突出，培养14d左右生长至约90%融合。
原代细胞生长至90%融合度时开始传代，淋巴管内皮细胞多在接种1h后开始贴壁，多个细胞组成的细胞团更易贴壁和分裂增殖，贴壁后的细胞呈梭形、三角形或多边形，形态与原代细胞相似，但生长速度较快，约7d融合，从传代第2天开始迅速增殖，至第6天开始生长缓慢，体现内皮细胞生长特有的接触抑制现象;当内皮细胞长满形成单层后，呈现典型的铺路石样外观，其中中央细胞较小而密集，周边细胞大而不规则，排列松散，其间可见少数几个梭形细胞。
透射电子显微将观察淋巴管内皮细胞的超微结构，细胞呈鳞片状单层排列，镜下见大部分细胞呈团存在，可见细胞间的紧密或缝隙连接，可见内皮细胞特异性颗粒weibel-palade小体;可见到其它内皮细胞特征性细胞器如胞质小突和质膜小泡等。
2.3 淋巴管内皮细胞的体外增殖和成管实验体外增殖实验显示淋巴管内皮细胞于第3天开始进入增殖活跃期，第5天进入高峰期，第6、7天进入平台期。
体外成管实验显示淋巴管内皮细胞在Ⅰ型胶原培养基中可以形成管腔样的结构，并且随着培养时间的延长，从不同方向形成的管腔互相连接，形成类似于体内的复杂的三维淋巴管网络。
透射电子显微镜观察管腔样结构的超微结构，可见由淋巴管内皮细胞围成的管腔，在这种细胞外基质成分存在的条件下，相邻细胞间的紧
密或镶嵌重叠连接可见，模拟了体内淋巴管内皮细胞与细胞外基质相互作用的过程。
3 讨论
淋巴管瘤与淋巴管的扩张和异常增殖有关，Sironi M 等研究者在小鼠腹腔内注射弗氏不完全佐剂产生淋巴管瘤，然后再分离培养，得到鼠源性淋巴管内皮细胞，用于研究淋巴管内皮细胞的生物学特性，为研究淋巴管发生提供了细胞模型。
本文中应用的舌淋巴管瘤标本，其病理特征与以往报道的淋巴管瘤病例一致。
HE染色结果显示切片中有大量扩张的淋巴管，管腔中没有血细胞，而是有少量嗜伊红淡染的淋巴液;为进一步确定这些扩张管腔的性质，应用免疫组化染色检测淋巴管内皮细胞标志物的表达，结果显示管腔内皮细胞均表达FLT-4和LYVE-1，证实了其淋巴管的性质。
因此，舌淋巴管瘤是淋巴管内皮细胞非常有价值的标本来源。
本文应用胶原酶消化法分离淋巴管内皮细胞，处理标本时应注意避免肿瘤周围舌组织细胞的污染，尽量去除周围组织，保证分离细胞的纯度;多次用含高浓度抗生素溶液洗涤去除组织表面的细菌和真菌。
胶原酶作用时间的控制是能否得到高纯度目的细胞的关键，作用时间太短，得到的细胞较少，不易培养;时间太长，容易导致一些杂细胞的污染。
在发现淋巴管内皮细胞特异性标志物之前，研究者大部分应用胶原酶消化法分离细胞。
近年来，由于淋巴管内皮细胞标志物的发现，学者们开始应用免疫磁珠从各种不同组织中分离淋巴管内皮细胞。
Simona Podgrabinska、Ernst Kriehuber和Taija Makinen等人分
别应用标记有LYVE-1、Podoplanin和VEGFR-3抗体的磁珠从组织中分离相关亚型的淋巴管内皮细胞。
事实上，这类方法分离得到的只是部分亚型的淋巴管内皮细胞，而且可能有其它细胞的污染如血管内皮细胞，不能较全面反映淋巴管内皮细胞的生物学特点;胶原酶消化法也有可能造成杂细胞的污染，如血管内皮细胞，间质细胞等等。
为了得到较高纯度的淋巴管内皮细胞，本实验利用内皮细胞比较容易且呈团被消化的特性，使淋巴管内皮细胞与较难消化的污染细胞分开，传代时换新的培养瓶，弃去未被消化的细胞;同时，EGM培养基中添加能够选择性使淋巴管内皮细胞增殖的生长因子VEGF-C，有报道VEGF-C能够选择性使淋巴管内皮细胞增殖，而对血管内皮细胞没有作用;同时，有文献报道在内皮细胞培养基中加入适量的肝素能增强内皮细胞的生长能力，并能降低生长因子的用量，以便细胞长期培养，并保持细胞表型不变。
因此本文在培养基中添加了肝素，在最大程度上获得高纯度淋巴管内皮细胞，并保留其在体内的分子表型和生物学特性以供研究。
在倒置显微镜下，淋巴管内皮细胞生长至80%～90%融合时，呈典型的内皮细胞形态学特征的铺路石样外观。
传代培养后，收获细胞在透射电镜下观察超微结构，如以往文献报道，可以看到内皮细胞特征性颗粒weibel-palade小体;在超微切片中也可见到大量的胞质小突和质膜小泡等淋巴管内皮细胞特征性细胞器，也可见到细胞间的紧密和缝隙连接。
细胞在Ⅰ型胶原培养基中形成复杂的管腔样网络，透射电镜观察证实淋巴管内皮细胞具有体外形成淋巴管样结构的能力，特。