关于淋巴管内皮细胞的分离和鉴定

关于淋巴管内皮细胞的分离和鉴定

淋巴系统是由广泛的淋巴管网络组成，主要功能是收集组织间隙中的液体和蛋白质并将它们输入循环系统，同时也是白细胞和肿瘤细胞的进出口。淋巴管通过引导白细胞和抗原从组织到淋巴结在启动免疫反应中发挥重要作用。因此，淋巴系统在维持组织液平衡、参与肿瘤转移和调节免疫等功能中扮演重要角色。淋巴管内皮细胞衬覆于淋巴系统管道的管腔面，是构成淋巴管壁的主要结构。近年来，随着人们对淋巴管系统认识的不断深入，淋巴管内皮细胞逐渐成为研究热点。淋巴管瘤是由淋巴管内皮细胞增生和扩张形成的一种良性肿瘤，好发于舌、唇、颊及颈部。淋巴管瘤通过压迫和浸润周围组织引起组织器官功能破坏，目前治疗以手术为主，但存在术后容易复发等问题。有学者采用局部注射博莱霉素，或者高渗盐水等，但可能引起周围组织的免疫反应或瘢痕回缩，导致原始病症扩大。因此，人们期待新的治疗方法，从而克服上述治疗方法的缺陷。迄今为止，淋巴管瘤病因仍不清楚。本研究体外分离培养淋巴管瘤相关淋巴管内皮细胞，为研究淋巴管新生在淋巴管瘤复发及肿瘤淋巴结转移中的作用提供体外细胞模型。

1 材料与方法

1.1 材料 M199培养基、DMEM 培养基和胎牛血清均购于Gibco公司;胶原酶和collagen typeⅠ均购于sigma公司;鼠抗人FLT-4单克隆抗体购于Santa Cruz;兔抗人LYVE-1多克隆抗体购自RD公司;HRP-

羊抗兔、HRP-羊抗鼠二抗均购于北京金桥公司;Cultrex BME 购于Trevigen公司;VEGF-C购于BD公司。舌淋巴管瘤标本来源于武汉大学附属口腔医院，本研究获得武汉大学附属口腔医院伦理委员会的批准。

1.2 淋巴管内皮细胞分离培养舌淋巴管瘤标本分成两块，其中一块用4%多聚甲醛固定做蜡块，另一块置于冰M199培养基中(其中含10mg/L两性霉素、100u/mL青霉素、100mg/L链霉素和10%胎牛血清)用于分离细胞。组织取回后，在超净台内用Hanks液洗数次，用剪刀取出肿瘤周围的组织，将瘤块剪成约0.5mm0.5mm0.5mm 大小，用0.25%(w/v，胶原酶/无血清DMEDM)胶原酶在37℃条件下消化45～60min;消化产物通过30mm孔径大小的过滤网过滤，过滤液1200r/min10min离心，然后用HankS液洗3次再次离心，用EGM 完全培养基重悬细胞，移至T25培养瓶，37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3 免疫组织化学染色石蜡切片常规脱蜡至水，切片置枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中，用微波中高火加热5min，室温冷却，PBS缓冲液漂洗，5min加50L过氧化物酶阻断溶液，室温孵育15min，PBS缓冲液漂洗，5min吸干PBS缓冲液，加50L正常羊血清37℃ 封闭10min后吸去不洗;加适当稀释度的一抗4℃孵育过夜;PBS缓冲液漂洗，5min3次，加辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育30min;PBS缓冲液漂洗，5min3次，加新鲜配制DAB溶液染色，显微镜下观察出现阳性棕黄色着色时终止(5min);自来水冲洗，苏木素复染5min，1%盐酸酒精作用10s;自来水冲洗，1氨水浸泡30s;梯度酒精脱水(70%，80%，95%和

100%各2min)，二甲苯透明5min，中性树胶封片。

1.4 电镜标本的制备淋巴管内皮细胞接种后24h换液。72h用

2.5%戊二醛磷酸缓冲液(pH 7.2)固定1h，然后用橡皮铲刮下贴壁生长的淋巴管内皮细胞，连同固定液移入离心管，离心(2000r/min)10min。沉淀物用1%锇酸固定，梯度乙醇脱水，树脂包埋，超薄切片，枸橼酸铅及醋酸铀染色，日立H-600透射电镜下观察。

1.5 细胞增殖实验将淋巴管内皮细胞制成细胞悬液，进行细胞记数。1104 个细胞接种于96孔板，加入含10%胎牛血清DMEM 200L，在37℃、5%CO2的培养箱中培养，1g/L MTT溶液加入每孔，培养4h，弃去MTT 溶液，每孔加入DMSO(二甲基亚砜)中止，振荡15min，酶标仪测定560nm波长的A 值，绘制曲线。实验重复3次。

1.6 细胞体外成管试验取200LⅠ型胶原(2g/L)加入24孔板中，37℃作用30min，使胶凝固;每孔加入约1104 个淋巴管内皮细胞于胶表面。置37℃、5%CO2培养箱中孵育培养7d，期间倒置显微镜观察并拍照记录，胶原胶固定于

2.5%戊二醛，透射电镜观察形成管腔的超微结构。

2 结果

2.1 舌淋巴管瘤标本HE染色及免疫组织化学染色 HE染色结果显示舌淋巴管瘤组织中有大量扩张和增生的淋巴管，管腔中未见血细胞，而见少量淡染的液体，为管腔内残留的淋巴液。免疫组织化学染色结果显示，管腔中内皮细胞均高表达目前公认的淋巴管内皮细胞特异性标志物FLT-4、和LYVE-1，与文献报道一致。因此，可以认为淋巴管

瘤为分离淋巴管内皮细胞提供了可靠的标本来源。

2.2 淋巴管内皮细胞的形态和超微结构原代培养淋巴管内皮细胞生长较为缓慢，单层贴壁生长，显微镜下见细胞呈扁平的梭形或多边形，大小均匀，胞核呈卵圆形，有核的区域较无核的区域突出，培养14d左右生长至约90%融合。原代细胞生长至90%融合度时开始传代，淋巴管内皮细胞多在接种1h后开始贴壁，多个细胞组成的细胞团更易贴壁和分裂增殖，贴壁后的细胞呈梭形、三角形或多边形，形态与原代细胞相似，但生长速度较快，约7d融合，从传代第2天开始迅速增殖，至第6天开始生长缓慢，体现内皮细胞生长特有的接触抑制现象;当内皮细胞长满形成单层后，呈现典型的铺路石样外观，其中中央细胞较小而密集，周边细胞大而不规则，排列松散，其间可见少数几个梭形细胞。透射电子显微将观察淋巴管内皮细胞的超微结构，细胞呈鳞片状单层排列，镜下见大部分细胞呈团存在，可见细胞间的紧密或缝隙连接，可见内皮细胞特异性颗粒weibel-palade小体;可见到其它内皮细胞特征性细胞器如胞质小突和质膜小泡等。

2.3 淋巴管内皮细胞的体外增殖和成管实验体外增殖实验显示淋巴管内皮细胞于第3天开始进入增殖活跃期，第5天进入高峰期，第6、7天进入平台期。体外成管实验显示淋巴管内皮细胞在Ⅰ型胶原培养基中可以形成管腔样的结构，并且随着培养时间的延长，从不同方向形成的管腔互相连接，形成类似于体内的复杂的三维淋巴管网络。透射电子显微镜观察管腔样结构的超微结构，可见由淋巴管内皮细胞围成的管腔，在这种细胞外基质成分存在的条件下，相邻细胞间的紧