乳酸脱氢酶测定—速率法(精)
广东医疗服务项目 乳酸脱氢酶同工酶 速率法
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乳酸脱氢酶（LDH）测定-标准操作程序
三级文件标准操作程序第2页共3页生效日期：目的：建立乳酸脱氢酶（LDH）测定标准操作规程。
范围：适用于乳酸脱氢酶（LDH）测定的标准操作。
职责：生化部检验人员对本规程的实施负责。
规程：1 测定方法：乳酸脱氢酶在催化乳酸生成丙酮酸的同时将NAD+还原成NADH。
通过测定NADH在340nm处吸光度增加的速度可求得乳酸脱氢酶的活力。
LDHL-乳酸+ NAD+─────→丙酮酸+ NADH + H+2 仪器设备GS200全自动生化分析仪3 试剂3.1 乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒，包括试剂1（R-1）、试剂2(R-2)。
试剂成份含量R-1 L-乳酸锂≥76mmol/LR-2 NAD+≥31mmol/l3.2 分析用人基质质控血清（RANDOX）、血清3.3 试剂稳定性与贮存乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒在2-8℃避光保存可稳定一年；试剂R-1、R-2开启后在2-8℃避光保存可稳定一个月。
3.4 样本稳定性与贮存3.4.1 分析用人基质质控血清：该血清自生产之日起，在2-8℃下保持可稳定4年；该血清一旦复融，在25℃下可稳定24小时，在2-8℃下可稳定7天，在-20℃可稳定1个月。
3.4.2 待测血清：2-8℃保存可稳定7天；-20℃保存可稳定3个月。
样本不可反复冻融。
不可使用已被污染的样本。
4 操作步骤4.1 打开全自动生化仪，按照GS200全自动生化分析仪操作维护保养程序，完成普三级文件准操作程序第3页共3页生效日期：通测试流程。
4.2 检验方法分析方法：速率A；主波长：340nm；副波长：405nm；样品量：8.0ul；R-1：320ul，R-2：80ul；校准方式：K因子；反应方向：上升；测定温度：37℃。
样本与R-1混匀后反应5分钟，加入R-2混合后延迟53秒，测定104秒。
样本8.0ul 主波长340nmR-1 320ul R-2 80ul 副波长405nm测光测光K=81990 5 6 8 min4.3 计算△A/min×Vt×1000ALT（U/L）= ─────────────6.22×Vs×d△A/min = 每分钟吸光度变化率Vt = 反应液总体积（ml）1000 =U/ml到U/L的转换系数 6.22 = NADH的毫摩尔吸光系数Vs = 样本体积（ml） d = 比色杯光径（cm）5 检验结果的解释抗坏血酸≤50mg/dl、游离胆红素≤684umol/L（40mg/dl），结合胆红素≤855umol/L （50mg/dl）、乳糜微粒≤2500浊度单位对测定无影响。
乳酸脱氢酶测定(精)
乳酸脱氢酶测定(2,4-二硝基苯肼法)
实验原理:在PH8.9的环境下,LDH催化乳酸形成丙酮
酸,同时使氧化型辅酶Ⅰ(NAD+)受氢形成还原型辅酶 Ⅰ(NADH),后者在340nm波长下吸光度的增加与 LDH的活力成正比(速率法).丙酮酸与2,4-二硝基苯肼 在碱性条件下显色,在510纳米波长下测吸光度值.(终 点法) 实验准备: 工作试剂配制:每瓶干粉均用5ML缓冲液溶解,混合均 匀为工作试剂. 4N氢氧化钠用蒸馏水5倍稀释,即4份蒸馏水1份4N氢 氧化钠.
临床意义
在急性心肌梗死后8～18小时乳酸脱氢酶开始升高，
24～72小时达高峰，持续4～16天恢复正常，平均 10天，峰值可高达正常水平的10倍。乳酸脱氢酶同 工酶LDH，，主要存在于心肌中，如LDH1＞LDH2， 则表示有心肌梗死。乳酸脱氢酶及其同工酶检测，对 某些心电图诊断作用不大，而对发病后较迟就医的急 性心肌梗死患者的诊断，有较大的意义。还有，肝脏 疾病、恶性肿瘤液 样品 0.5 标准管 0.5 0.02 样品管 0.5 0.02
混合37℃水浴15分钟，然后各管加显色剂500 μL， 37℃水浴15分钟取 出，各管加稀释氢氧化钠2.0ml,室温放置3分钟510纳米波长测定.
标准值:400U/L 波长510纳米,试剂空白调零,按公式计 算结果. 参考范围:150-350U/L 样本要求：最适样本为当日空腹采集 的无溶血、无乳糜的血清或肝素抗凝 血浆及时测定。
乳酸脱氢酶测定标准操作程序
乳酸脱氢酶测定标准操作程序1.摘要乳酸脱氢酶常用于心机梗塞、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。
2.适用范围程序适用于AU5811自动生化分析仪检测血清、血浆中LDH的浓度。
3.职责使用AU5811自动生化分析仪进行测定LDH浓度的工作人员要严格按照本SOP程序进行,室负责人监督管理；本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经生化室负责人、科主任签字批准生效。
4.检测方法上海科华生物工程股份有限公司生产的乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒采用的是乳酸法。
5.原理乳酸氧化成丙酮酸（L→P），辅酶Ⅰ（NAD+）还原成还原辅酶Ⅰ（NADH）生成，其反应产生的NADH引起340nm处吸光度的上升，吸光度上升的速率与LDH的活力呈正比关系。
+++NADHNADL LDH丙酮酸乳酸-H−→+−+−6.仪器AU5811自动生化分析仪7.试剂7.1试剂来源：上海科华生物工程股份有限公司提供7.2试剂瓶内主要成分：Tris-HCl缓冲液、L(+)乳酸锂、MES缓冲液、NADH类似物、防腐剂7.3试剂稳定性：试剂避光保存于2-8℃，若无污染，可稳定至失效期，本试剂有效期为12个月。
试剂不可冰冻。
7.4试剂准备：试剂为即用式。
8.标准品和质量控制8.1校准程序：此项目只需要用理论因子并做空白校准即可。
以9g/L氯化钠溶液或去离子水为空白。
8.2质控品：罗氏公司提供的生化复合定值质控血清做为室内质控品。
每日在测定前做一次质控，加试剂后做一次质控。
该质控品为干粉包装，在2-8℃冰箱可稳定到失效期，使用前用5ml去离子水复溶，待质控物充分溶解（大约30分钟）后使用。
8.3质控数据管理：按程序对检验后的质控后结果进行转换，及时质控数据进行分析处理，如出现失控值，应及时分析失控原因，并填写好相关失控记录。
8.4质控判断规则：按《Westgard多规则质控方法测定标准操作程序》8.5室间质评：分别参加河北省临检中心室间质评，对回报的室间质评结果按《室间质量评价程序》进行处理。
乳酸脱氢酶活力测定(精)
匀浆缓冲液：
10m mol/L pH6.5磷酸氢二钾磷酸二氢钾缓冲液。
操作方法
（一）制备肌肉匀浆 （二）LDH活力测定 （三）蛋白质含量测定 （四）数据处理
（一）制备肌肉匀浆
取瘦猪肉（或兔肉）一块除去脂肪及筋膜等，称取20g， 按W/V=1/4比例加入4℃预冷的10m mol/L pH6.5磷酸氢 二钾-磷酸二氢钾缓冲液，用组织捣碎机捣碎，每次10s， 连续3次。将匀浆液倒至烧杯中，置4℃冰箱提取过夜， 过滤后的红色液体为组织提取液，量总体积。
乳酸脱氢酶活力测定
目的要求
（1）学习LDH活力测定原理； （2）测定动物肌肉组织提取液LDH活力 及比活力。
原理
乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，简称LDH）广泛存在于动物、 植物及微生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化 如下反应： LDH 乳酸 +NAD+ 丙酮酸+NADH+H+ pH7.4-7.8
（二）LDH活力测定
实验时预先将丙酮酸溶液及NADH溶液放在25 ℃ 水浴 中预热。取2只光径为1cm的石英比色皿，在一只比色 皿中加入0.1mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液3ml，置紫外分 光光度计中，于340nm处调A值为0；另一只比色皿用 于测定LDH活力，依次加入2.9ml丙酮酸溶液、0.1ml NADH溶液，加盖摇匀后测定A340nm，然后加入经稀释 （20倍）的酶液10μl，立即计时，每隔0.5min测A340nm， 连续测定3min。以A对时间作图，取最初线性部分， 计算Δ A340nm/min减少值。
思考题
乳酸脱氢酶(LDH)测定操作规程(SOP)
乳酸脱氢酶(LDH)测定操作规程（SOP）一、用途本产品用于体外定量测定血清、血浆样品中乳酸脱氢酶（LDH）的活性。
二、临床意义（一）概述乳酸脱氢酶（LDH），又称L－乳酸－NAD+氧化还原酶，酶编号为EC 1.1.1.27，分子量约为34000道尔顿。
LDH是一种细胞质酶，存在于所有组织细胞中。
由于组织中的LDH 浓度比血浆高约500倍，即使组织的轻微损伤也将导致血清中活性的明显增高，在肝、心肌、骨骼肌和肾中发现高度组织特异性活性的酶。
（二）临床意义乳酸脱氢酶增高主要见于心肌梗死、肝炎、肺梗死、某些恶性肿瘤、白血病等。
某些肿瘤转移所致的胸腹水中乳酸脱氢酶活力往往升高。
目前，常用于心肌梗死、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。
（三）医学决定水平170U／L:此值在参考范围以内，等于或低于此值可排除许多与LDH升高有关的疾病，而考虑其他的诊断。
此值还可作为病人自身的对照，用来与以前或将来的测定值作比较。
300U／L：高于此水平时，应考虑到可能引起LDH升高的各种疾病，如心肌梗塞、肝病变、传染性单核细胞增多症、进行性肌营养不良等。
因此，应作其他各种试验，以作出明确诊断。
血清溶血可使测定值增高，应予以注意。
500U／L：高于此值，常见于巨幼细胞性溶血，急性白血病、慢性粒细胞性白血病、转移癌和肝昏迷等，此时应作其他多种检测来作出正确诊断。
三、检验原理L-乳酸＋NAD+−−LDH丙酮酸＋NADH＋H+−→NADH的生成速率与样品中LDH活性成正比，在340nm波长处，通过连续监测吸光度的上升速率(△A／min)，即可计算出样品中LDH的活性。
四、样品血液样品原则上采集晨起空腹血（禁食12小时）；患者处于平静、休息状态，减少患者由于运动、饮食带来的影响；静脉采血时患者应取坐位或卧位；止血带使用后1分钟内采血，回血后立即松开；正确使用抗凝剂；防止溶血；防止过失性采样。
样品运送过程中应防止过度振荡、防止样品容器的破损、防止样品被污染、防止样品及唯一性标志的丢失和混淆，防止样品对环境的污染、水分蒸发。
乳酸脱氢酶速率法正常值
乳酸脱氢酶速率法正常值1. 乳酸脱氢酶简介说到乳酸脱氢酶，听起来是不是有点像科学怪人发明的东西？其实，这个名字听起来虽然复杂，但它在咱们的身体里可是个大忙人！乳酸脱氢酶，咱们简称为LDH，主要是帮助咱们的细胞处理能量，特别是在运动时。
想想你在健身房挥汗如雨的情景，LDH就在那默默工作，帮助你把葡萄糖转化为能量。
2. LDH的作用和正常值2.1 LDH的作用你可能会问，LDH究竟是干嘛的呢？简单来说，当咱们的身体在大运动量时，比如跑步、打球，或者你在追公交时，身体的氧气供给会跟不上，乳酸就开始在体内积累。
这时，LDH就像是个小超人，帮你把乳酸转化成其他更容易处理的物质。
没有它，咱们就得忍受肌肉酸痛，简直比打了个大架还难受！2.2 正常值那么，乳酸脱氢酶的正常值又是多少呢？一般来说，正常范围大约是在120到250 U/L之间。
这个U/L可不是外星人用的单位，而是“单位每升”的意思。
要是你的LDH水平在这个范围内，那恭喜你，身体运转得挺不错的！但如果数值超出了这个范围，就要多加留意了，可能有些小问题在等着你。
3. LDH升高的原因3.1 可能的健康问题虽然LDH听起来很神奇，但它也可能是一些健康问题的信号。
比如说，肝脏、心脏或者肌肉出现了问题，LDH水平可能会飙升。
像那种感觉你在吃火锅的时候，突然发现自己加了太多辣椒，火辣辣的，那种惊悚感！这时候，医生可能会建议你做进一步检查，看看究竟是怎么回事。
3.2 生活中的影响你生活中遇到LDH升高的情况，也许会感到紧张，但别太过担心。
很多时候，可能只是因为你最近健身太拼，或者熬夜太多。
咱们的身体就像一台精密的机器，得好好保养才能运行顺畅。
多吃点营养的食物，保持充足的睡眠，这样LDH就会乖乖回到正常值了。
4. 如何保持LDH水平正常4.1 饮食调理要想LDH水平稳定，饮食可不能忽视。
多吃些新鲜水果和蔬菜，比如香蕉、菠菜，这些都是帮助调节身体机能的好帮手。
而且，少吃油腻食物，像是炸鸡、薯条，虽然好吃，但对身体可没啥好处，特别是LDH这个小家伙。
乳酸脱氢酶活力测定(精)
试剂与器材
材料：
动物的肌肉、肝、心、肾等 组织。
酶活力测定试剂：
（1）0.1mol/L pH7.5 磷酸缓 冲液 (PB)100ml； （2）NADH溶液：3.5mg纯 NADH以0.1mol/L pH7.5 PB 1ml稀释。 （3）丙酮酸溶液：2.5mg丙 酮酸钠，以以0.1mol/L pH7.5 PB 29ml稀释。 试剂（2）（3）最好在临用 前配制。
思考题
简述用紫外分光光度计测定以NAD+为辅 酶的各种脱氢酶测定原理。
提取液中LDH总活力单位= LDH活力（U）/ml ×总体积
LDH比活力
总LDH活力（U） 比活力（U/mg）=———————————— 总蛋白含量（mg）
注意事项
1、实验材料应尽量新鲜，如取材后不立即用，应贮存在20℃ 低温冰箱中。
2、酶液的稀释度及加入量应控制A340/nm下降在0.1-0.2之 间，以减少实验误差，加入酶液后应立即计时，准确 记录每隔0.5min A340下降值。 3、NADH溶液应在临用前配制，如其纯度为75%，则应 折合到100%，增加试剂的称量。加酶液前NADH A340 控制在0.8左右。
LDH可溶于水或稀盐溶液，可制备组织匀浆，经浸泡、离心，得上 清为组织提取液。LDH测定方法很多，紫外分光光度法最为简便快 速。鉴于NADH和NAD+在340nm和260nm处有各自最大吸收峰值， 因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变， 定量测定酶的含量。 本实验反应液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下加入一定量酶液， 观察NADH在反应过程中340nm处光吸收减少值，减少越多，则 LDH活力越高。其活力单位定义为：在25 ℃ ，pH7.5条件下 A340nm/min下降为1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组织中 LDH单位，定量测定蛋白质含量即可计算比活力（U/mg）。
乳酸脱氢酶测定方法
乳酸脱氢酶测定方法我们知道，现实生活中存在着各种各样的的酶，这些酶可以单独作用，也可以相互作用，对我们的人体产生很大的影响，但是相信大家对于酶的测定方法还不是很熟悉吧，不同酶的测定有不同的方式方法，而且方式方法也种类不一，现如今乳酸脱氢酶测定方法成为很多人研究的领域话题，那么到底该如何测定呢，下面就让我们一起来了解一下乳酸脱氢酶测定方法吧。
方法：实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。
每次检测都应该做标准曲线。
如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。
空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。
每孔加生物素标记抗体工作液 100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃，60分钟。
3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100μl，37℃，60分钟。
5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。
7. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。
为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。
血清乳酸脱氢酶LDH速率法测定-检验科生化室作业书
血清乳酸脱氢酶LDH速率法测定1.实验原理VITROSLDH试剂是一种干燥，多涂层的，在聚合物支撑基片上涂有分析成份的化学干片。
本法测LDH采用丙酮酸和NADH作底物以产生乳酸和NAD+。
将一滴10ul的患者样品滴于干片上，样品就被分布层均匀地分布并渗透到下面的试剂层。
乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+。
用反射强度变化测出NADH的氧化率，再将其转化成乳酸脱氢酶的活力。
测定方式：速率法波长：340nm测试时间和温度：37℃约5分钟反应过程：LDH丙酮酸+NADH+H+———————→乳酸+NAD2.标本：2.1病人准备：无特殊。
2.2样品类型：血清；肝素锂/钠抗凝血浆。
2.3标本采集与处理：Vitros测试血清和血浆的结果是一致的。
而其它一些方法由于在低速离心时血浆中血小板造成的污染，会使血清和血浆的测试结果有明显差异。
由于VitrosLDH干片对完整血小板内的LDH不敏感，因此对比方法的LDH结果会与Vitros肝素抗凝血浆的测试结果不一致。
样品采集后1小时内离心，然后吸出血清。
处理样品时要将其当成生物污染品。
3.标本的存放：血清、血浆室温下最多2天；不可冷冻保存。
4.标本的运输：样品要放在带盖的容器内以防污染和蒸发。
5.标本拒收的标准：污染、溶血标本不能使用。
6.试验材料：6.1测试AST所需的物品包括：Vitros化学定标物Kit3；Vitros特制质控液；Vitros7%BSA稀释液。
强生厂家提供原装进口，试剂盒外包装上标明了测试项目名称，试剂标签代码，有效期限和储藏温度。
6.1.1试剂组成：干片成分：反应成份是NADH和丙酮酸钠。
其它成份有聚合物颗粒，粘合剂，缓冲剂，表面活性剂，聚合物交叉连接剂和稳定剂。
干片标记：试剂盒外包装上标明了测试项目名称，试剂标签代码，有效期限和储藏温度。
6.1.2试剂准备从冰箱中取出干片盒，在将干片盒打开封装并装入仪器内的干片储藏器之前必须使其达到室温状态18～28℃。
血清乳酸脱氢酶LDH速率法测定
血清乳酸脱氢酶（LDH）速率法测定1. 实验原理VITROS LDH试剂是一种干燥，多涂层的，在聚合物支撑基片上涂有分析成份的化学干片。
本法测LDH采用丙酮酸和NADH作底物以产生乳酸和NAD+。
将一滴10ul的患者样品滴于干片上，样品就被分布层均匀地分布并渗透到下面的试剂层。
乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+。
用反射强度变化测出NADH的氧化率，再将其转化成乳酸脱氢酶的活力。
测定方式：速率法波长：340nm测试时间和温度：37℃约5分钟反应过程：LDH丙酮酸+ NADH + H+———————→乳酸+ NAD2. 标本：2.1 病人准备：无特殊。
2.2 样品类型：血清；肝素锂/钠抗凝血浆。
2.3 标本采集与处理：Vitros测试血清和血浆的结果是一致的。
而其它一些方法由于在低速离心时血浆中血小板造成的污染，会使血清和血浆的测试结果有明显差异。
由于Vitros LDH干片对完整血小板内的LDH不敏感，因此对比方法的LDH结果会与Vitros肝素抗凝血浆的测试结果不一致。
样品采集后1小时内离心，然后吸出血清。
处理样品时要将其当成生物污染品。
3. 标本的存放：血清、血浆室温下最多2天；不可冷冻保存。
4. 标本的运输：样品要放在带盖的容器内以防污染和蒸发。
5. 标本拒收的标准：污染、溶血标本不能使用。
6. 试验材料：6.1 测试AST所需的物品包括：Vitros化学定标物Kit3；Vitros特制质控液；Vitros 7%BSA稀释液。
强生厂家提供原装进口，试剂盒外包装上标明了测试项目名称，试剂标签代码，有效期限和储藏温度。
6.1.1 试剂组成：干片成分：反应成份是NADH和丙酮酸钠。
其它成份有聚合物颗粒，粘合剂，缓冲剂，表面活性剂，聚合物交叉连接剂和稳定剂。
干片标记：试剂盒外包装上标明了测试项目名称，试剂标签代码，有效期限和储藏温度。
6.1.2 试剂准备从冰箱中取出干片盒，在将干片盒打开封装并装入仪器内的干片储藏器之前必须使其达到室温状态18～28℃。
血清乳酸脱氢酶（LDH）活性测定及意义
血清乳酸脱氢酶（LDH）活性测定及意义
乳酸脱氢酶是体内能量代谢过程中的一个重要的酶。
此酶几乎存在于所有组织中，以肝、肾、心肌、骨骼肌、胰腺和肺中为最多。
这些组织中的LDH的活力比血清中高得多。
所以当少量组织坏死时，该酶即释放血而使其他血液中的活力升高。
测定此酶常用于对心梗、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。
1．正常参考值
速率法（LDH-L法）：100～240 U/L
比色法：190～310 U/L
2．临床意义：
①心肌梗塞：心肌梗塞后9～20h开始上升，36～60h达到高峰，持续6～10天恢复正
常（比AST、CK持续时间长），因此可作为急性心肌梗塞后期的辅助诊断指标。
②肝脏疾病：急性肝炎，慢性活动性肝炎，肝癌，肝硬化，阻塞性黄疸等。
肿瘤转移
所致的胸腹水中LDH往往也升高。
③血液病：如白血病、贫血、恶性淋巴瘤等，LDH升高。
④骨骼肌损伤、进行性肌萎缩、肺梗塞等。
⑤恶性肿瘤转移所致胸、腹水中乳酸脱氢酶活力往往升高。
⑥正常新生儿LDH水平很高，可达775～2000U/L，满月后为180～430 U/L，以后随
年龄增长逐渐降低，12岁后趋于恒定。
由于测定LD的特异性较差，目前临床上多同时测定乳酸脱氢酶同工酶来判断其组织来源，用于心肌梗塞、肿瘤、肝病等的诊断。
乳酸脱氢酶测定标准操作程序
乳酸脱氢酶测定标准操作程序1.摘要乳酸脱氢酶常用于心机梗塞、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。
2.适用范围程序适用于日立7600自动生化分析仪检测血清、血浆中LDH的浓度。
3.职责使用日立7600自动生化分析仪进行测定LDH浓度的工作人员要严格按照本SOP程序进行,室负责人监督管理；本SOP的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经生化室负责人、科主任签字批准生效。
4.检测方法上海科华生物工程股份有限公司生产的乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒采用的是乳酸法。
5.原理乳酸氧化成丙酮酸（L→P），辅酶Ⅰ（NAD+）还原成还原辅酶Ⅰ（NADH）生成，其反应产生的NADH引起340nm处吸光度的上升，吸光度上升的速率与LDH的活力呈正比关系。
+++NADHNADL LDH丙酮酸乳酸-H−→+−+−6.仪器日立7600自动生化分析仪7.试剂7.1试剂来源：上海科华生物工程股份有限公司提供7.2试剂瓶内主要成分：Tris-HCl缓冲液、L(+)乳酸锂、MES缓冲液、NADH类似物、防腐剂7.3试剂稳定性：试剂避光保存于2-8℃，若无污染，可稳定至失效期，本试剂有效期为12个月。
试剂不可冰冻。
7.4试剂准备：试剂为即用式。
8.标准品和质量控制8.1校准程序：此项目只需要用理论因子并做空白校准即可。
以9g/L氯化钠溶液或去离子水为空白。
8.2质控品某某公司提供的生化复合定值质控血清做为室内质控品。
每日在测定前做一次质控。
该质控品为干粉包装，在2-8℃冰箱可稳定到失效期，使用前用5ml去离子水复溶，待质控物充分溶解（大约30分钟）后使用。
8.3质控数据管理：按程序对检验后的质控后结果进行转换，及时质控数据进行分析处理，如出现失控值，应及时分析失控原因，并填写好相关失控记录。
8.4质控判断规则：按《Westgard多规则质控方法测定标准操作程序》8.5室间质评：分别参加某地区室间质评，对回报的室间质评结果按《室间质量评价程序》进行处理。
乳酸脱氢酶(LDH)法操作说明
LDH法细胞毒性检测：原理：乳酸脱氢酶在胞浆内含量丰富,正常时不能通过细胞膜,当细胞受损或死亡时可释放到细胞外,所以细胞死亡数目与细胞培养上清中LDH活性成正比,用比色法测定实验孔LDH 活性,并与靶细胞对照孔进行比较,可计算效应细胞对靶细胞的杀伤百分率LDH（乳酸脱氢酶）是一种极为稳定的细胞质酶，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH 即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应转化成红色甲臢化合物，可通过酶标仪进行检测。
颜色形成的量与裂解细胞的数目成正比。
应用一个96-孔平板读数计收集可见光波长的吸收值数据。
这个分析可用于测量在细胞介导的细胞毒性分析中细胞膜的完整性，这种情况下目标细胞被效应细胞裂解，可判断细胞受损的程度。
乳酸脱氢酶（LDH）在胞质内含量非常丰富，细胞处于正常状态下其不能通过细胞膜，但当细胞受到损伤或死亡时便可释放到细胞外，此时细胞培养液中 LDH 的活性与细胞的死亡数目呈正比，通过用比色法测定并与靶细胞对照孔的 LDH 活性进行比较，可计算出效应细胞对靶细胞的杀伤百分数。
该实验方法操作简便、快速，可应用于 CTL 和 NK 细胞活性测定及药物、化学物质或放射所引起的细胞毒性，目前已有 LDH 法测定 CTL 活性的试剂盒。
同时设4个对照:靶细胞最大释放组、体积校正对照组、背景对照组和自然释放组按5∶1、10∶1、20∶1（效应细胞∶靶细胞）细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大等因素会造成细胞自然释放乳酸脱氢酶操作流程：设立效应细胞孔（不同浓度的效应细胞设立效应细胞自发释放组）：50μl效应细胞+50μl培养基实验组：靶细胞不变，改变效应细胞：50μl效应细胞+50μl靶细胞设立靶细胞自发释放组：50μl靶细胞+50μl培养基设立靶细胞最大释放组：50μl靶细胞+50μl培养基+10μl裂解液（10×）设立体积校正对照组：100μl培养基+10μl裂解液（10×）设立背景对照组：100μl培养基250g离心4分钟37℃孵育4小时离心前45分钟添加裂解液（10×）至靶细胞最大释放组250g离心4分钟取上清50μl转移至另一孔板（可选）于独立的孔中加50μl LDH阳性对照（1：5000）于每孔中添加50μl再次稀释的底物混合物室温避光孵育30分钟添加50μl终止溶液490nm测吸收值1.靶细胞接种数目的优化1.1.设立检测板1.1.1.准备靶细胞：调整细胞浓度0, 5,000, 10,000, 20,000/100μl，使用与细胞毒分析相同的培养基及孔板终体积。
乳酸脱氢酶测定试剂盒说明书
乳酸脱氢酶测定试剂盒说明书乳酸脱氢酶测定试剂盒(速率法)说明书【产品名称】通用名称:乳酸脱氢酶测定试剂盒(速率法)商品名称: 乳酸脱氢酶测定试剂盒(速率法)英文名称:LDH-L【包装规格】M-100462×50/2×10ml 4×50/4×10ml 1×100/1×20ml 2×100/2×20ml3×100/3×20ml 4×100/4×20ml 5×100/5×20ml 1×70/1×14ml R1/R22×70/2×14ml 3×70/3×14ml 4×70/4×14ml 5×70/5×14ml1×1000/1×200ml 1×5000/1×1000ml 1×10000/1×2000ml【预期用途】用于定量测定人血清，血浆中的乳酸脱氢酶(LDH)的活力。
乳酸脱氢酶在血清中由5种同功酶组成。
这些酶是以四聚体结构存在。
有两亚型，M-亚型主要发现在骨骼肌里，H-亚型主要发现在心肌里。
因为它们电泳时向正极移动的特性，同功酶分为LDH1, LDH2, LDH3, LDH4各LDH5。
LDH1 向正极移动最快。
亚型是:H4, H3M, H2M2, HM3和M4。
【检验原理】++LDHL-乳酸 + NAD 丙酮酸 + NADH + H ,,,,在340nm处，每分钟吸光度的增加跟样品中LDH的活力成正比。
【主要组成成份】N-甲基-D-葡萄糖胺缓冲液- --------------------------------325mmol/lL-乳酸 -----------------------------------------------------------50mmol/l氧化型辅酶I ----------------------------------------------------10.0 mmol/l【储存条件及有效期】储存在冰箱(+2? 至 +8?C) ，有效期至少一年。
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430
37 要
4920
20 600
U/L
430
37 要
30s
45s
3016
50 900
80 + 2 0. 0 2
参考范围:104-205U/L 式中6 220为波长340nm处NADH的摩尔 吸光度。
方法评价
1.L-P反应速率法是根据正向反应而建立，其优点在
于：乳酸盐和底物溶液的稳定性较好，－20℃保存 可稳定6个月以上。且两溶液的浓度对测定方法的 影响最小。 2.线性范围较宽 本法在LDH活性为726U/L以内时 线性良好。超过此值最好将标本稀释后再测。 3.精密度好 LDH活性为65U/L时，日间CV为5.8%； LDH活性为149U/L时，日间CV为3.2%。 4.特异性高 由于血清中非LDH的NAD＋类氧化还原 酶的内源性底物很少，加上样本的高度稀释，因此， 这些酶的干扰作用可忽略不计。
LDH pH 8.8 L 乳酸 NAD 丙酮酸 NADH H
实验操作
样本要求:当日空腹采集的无溶血、无乳糜的
血清 试剂配制：取R15ml加R21ml混合即为工作试 剂 半自动生化分析仪测定参数
半自动生化分析仪测定参数
分 析 方 法 速 率 法 速 率 法 波长 温 度 试 剂 空 白 延 迟 时 间 30s 测 量 时 间 45s 因数 样 品 量 uL 试 剂 量 uL 吸 入 量 uL 500 单 位 反 应 方 向 正
乳酸脱氢酶测定—速率法
xiaobinxuer@
实验目的
熟悉血清乳酸脱氢酶测定（速率法）的原理，
测定参数的设置及酶活性单位的计算
实验原理
乳酸脱氢酶催化乳酸氧化生成丙酮酸，同时
使NAD＋还原为NADH，引起340nm处吸光 度的增加，吸光度的增加速率与样品中LDH 活性成正比。