病理学技术考点总结

酶组织细胞化学技术

酶组织化学技术的基本原理及方法

1、金属沉淀反应，如硫代胆碱铜法，可证明胆碱酯酶和酯酶；

2、藕联偶氮色素法

3、色素形成与染色法

一碱性磷酸酶（AKP）

AKP最适宜PH值为9.2-9.4，可被金属阳离子或某些氨基酸激活，多见于活跃的部位，如小动脉、肾小管上皮等。

⏹AKP染色方法:

1、Gomri钙钴法：AKP为黑色

注意事项：此法对含铁血黄素和钙盐也可形成棕黑色沉淀，必要时应予以鉴别。并且用于透明的二甲苯为AR级别。

2、Gossrau偶氮吲哚酚法：酶活性部位呈暗褐色（坚牢蓝VB）、浅红色（坚牢蓝BB）、蓝色（坚牢紫B）

二酸性磷酸酶（ACP）

ACP前列腺活性最强，在肝脏内毛细胆管旁活性最强。

⏹ACP染色方法:

1、Berry硝酸铅法：ACP为棕黑色，特异性抑制酶是氟化钠。

2、Leder-Stutt改良萘酚AS-TR磷酸酯法：ACP为红色。

三三磷酸腺苷酶（ATP）

ATP分为三类：膜性ATP、肌球蛋白ATP、线粒体ATP，以上三种酶不可用甲醛固定，用冷冻法。

⏹ATP染色方法：

1、Wachstein-Meisel镁激活酶法：ATP为棕黑色。

2、Dubowitz-Brooke钙激活酶法：A TP为棕黑色。

注意事项：镁激活的ATP正常肝定位于毛细胆管；钙激活ATP区分于红肌纤维和白肌纤维有意义，对于区分神经性肌萎缩和肌源性肌萎缩有价值。

四胆碱酯酶（CHE）

广义胆碱酯酶分为胆碱酯酶和乙酰胆碱酯酶，胆碱酯酶的活性中心是丝氨酸，主要分布于血浆、胰腺和唾液腺；乙酰胆碱酯酶主要分布于神经肌肉接头等处。

CHE染色法

1、Snell-Garrett胆碱铜法：CHE呈黄色或棕黄色。

2、Karnovsky-Roots铁氰化铜法：CHE呈红棕色或深棕色。

核酸分子杂交技术

核酸分子杂交技术：具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA 或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。Southern 杂交、Northern 杂交、原位杂交（ISH）、荧光原位杂交（FISH）、芯片杂交（属于固一液相杂交）。

核酸分子杂交技术基本方法：

1、固定：多聚甲醛

2、玻片和组织切片处理：增强组织通透性和核酸探针的穿透性有以下方法，如消化酶、去污

剂、TritonX-100。降低背景色，多聚甲醛固定后浸入醋酸酐和三乙醇胺。240度烘烤片子除去RNA酶

3、杂交：

4、杂交后处理：处理切片用浓度由高到低，但温度是由低到高的盐溶液。

5、显示：

免疫组织化学技术在病理诊断中的应用

细胞凋亡检测技术

组织取材固定及切片技术

组织固定

一单纯组织固定液

1、甲醛渗透力强，固定均匀，组织收缩小，但经乙醇脱水后收缩较大。非沉淀性固定剂。

注意事项：甲醛长时间存放容易氧化成蚁酸，蚁酸与组织中的血红蛋白形成甲醛色素。

除去甲醛色素的方法：○1Schridde法：75%的乙醇200ml，加浓氨水1ml。切片脱蜡后处理30min；○2Verocay法：80%乙醇100ml和1%氢氧化钠1ml配置而成，切片脱蜡后处理。

2、重铬酸钾常用1%-3%作为固定剂。未酸化的重铬酸钾不能使蛋白质沉淀，但可以使蛋白质变为脂溶剂，用于固定高尔基体和线粒体；醋酸化的重铬酸钾可以使蛋白质沉淀，此时染色体可以保存，但线粒体破坏。重铬酸钾不能与还原剂混合，其常用于配置混合固定液，如Zenker 液、Helly液、Maximov液、Regaud液。（hmrz液）

3、苦味酸易燃易爆，饱和溶液储藏，常用饱和溶液作为固定剂。能沉淀一切蛋白质，穿透慢，组织收缩明显，对脂类无固定作用，苦味酸可以软化火棉胶和皮肤，苦味酸固定后放入70%的乙醇或者碳酸锂除去苦味酸固定时产生的黄色。

4、升汞单纯应用组织收缩明显，常与醋酸和铬盐配置成混合液。可以沉淀蛋白质（白、球蛋白），固定后用5%的碘酒脱汞，再用0.5%的硫代硫酸钠脱碘。

5、醋酸低于15度为冰醋酸。穿透力强，不能保存糖和脂，固定染色体的混合固定液常含有醋酸。缺点是组织膨胀明显。

6、锇酸强氧化剂不能与还原剂混合（乙醇和甲醛），常用1%-2%作为固定剂。为脂类固定剂，不使蛋白质产生沉淀。

7、丙酮沉淀蛋白质，各种酶的固定。

8、三氯醋酸沉淀蛋白质，是Susa主要成分，也是良好的脱钙剂。

不能使组织蛋白沉淀的单一固定液包括：甲醛、重铬酸钾（非酸化）、醋酸、锇酸（醋甲重锇）；对脂类固定无效包括：苦味酸、铬酸、升汞、醋酸。（苦铬升醋）

二混合组织固定液

1、B-5固定液醋酸钠-升汞-甲醛固定液，用于固定淋巴组织，若不用甲醛则为B-4固定液。

2、Bouin固定液外科活检固定液，适用于结缔组织。

3、Carony固定液DNA、RNA、糖原及尼氏体的固定，不能固定脂肪。固定速度为1h厚度为3mm。

4、Muller固定液用于媒染和神经硬化组织。

5、Orth固定液用于固定胚胎组织、神经组织、脂肪组织。黑暗配置、现配现用。

6、PFG固定液多肽抗原固定，用于免疫电镜。

7、PLP和PLPD固定液富含糖类组织固定。

8、Zenker固定液固定肿瘤标本、病毒（Negril包涵体）。不能固定含血量较多的组织，不能接触金属器械。

9、中性甲醛PH为7，含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钠。

注意事项：Masson染色选择甲醛升汞、Zenker液、Bouin液；嗜铬细胞固定选择Zenker液；保存糖原选择Carnoy液。