金银花提取物对小鼠淋巴细胞体外活化与增殖的影响_侯会娜
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1. 1 实验动物 清洁级 Balb/ c 小鼠, 雄性, 8~ 10 周龄, 体质量( 20 ? 2) g, 30 只, 购自广东省实验动物 中心。 1. 2 主要试剂 金银花提取物购自四川省广汉市 维康植化 有限公司。L- 谷氨酰胺、B- 二巯基乙醇 和 刀豆蛋白 A( Concanavalin A, ConA) 购自 Sigma 公司, 抗 小 鼠 CD3-PE-FITC、抗 小 鼠 CD69- FITC、抗 小 鼠 CD25-PE 和抗小 鼠 CD71- PE 单 克隆抗 体购 自美 国 PharMingen 公 司, 羧 基 荧 光 素 乙 酰 乙 酸 ( carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, CFDASE) 购自美国 Molecular Probes 公司。RPMI1640、胎牛 血清( fetal bovine serum, FBS) 为美国 GibcoBRL 公司
疫分子 识 别 与 疾 病 研究。 ( Tel ) 020-85226219; ( E-mail) xiaolingtong1127@ Tom. com * 通讯作者
下的小鼠 T 细胞活化和增殖影响, 初步探讨其免疫 调节机制, 为临床上在中药领域筛选和研发新型免 疫制剂提供参考数据和理论依据。
1 材料与方法
2 结果
2. 1 FL 对 T 细胞表达 CD69、CD25 和 CD71 的影
响 小鼠淋巴结 T 细胞静息状态下很少表达 CD69、
CD25 和 CD71, 经 ConA 刺激 12、24 或 48 h 后, CD69、
CD25 和 CD71 表达明显增加。FL 加药组对 ConA 刺
激组 CD69、CD25 和 CD71 的表达均有明显抑制作用
[Abstract] Objective To investigate the effects of Flos lonicerae ( FL ) extracts on the activation and proliferation of mouse lymphocytes in vitro and to elucidate the mechanism of the immunosuppressive effect of FL . Methods Lymphocytes isolated from lymphoid nodes of Balb/ c mouse were stained with fluorescence- conjugated monoclonal antibodies. The flow cytometry analysis was employed to detect the effects of FL on the activation of mouse lymphocytes treated with ConA . The effects of FL on the proliferation rate of mouse lymphocytes were also analyzed by CFDA- SE staining. Results The results indicated that FL could significantly inhibit the expression of CD69, CD25, and CD71 of mouse lymphocytes treated with ConA in a concentration- dependent way , while CFDA- SE analysis showed the proliferation of mouse lymphocytes was obviously inhibited by different concentrations of FL. Conclusion The activation and proliferation of the lymphocytes treated with ConA in vitro is significantly inhibited by FL, indicating FL is a potential immunosuppressive agent.
[ Key words] Flos lonicerae extract; Lymphocytes; Activation; Proliferation
金银花 ( Flos lonicerae, FL) 为忍冬科植物忍冬 ( Lonicera japonica Thunb ) 的干躁花蕾, 含有有机 酸 类、黄酮类、三萜皂苷类和挥发油等, 绿原酸类化合 物是金银花的主要有效成分, 包括绿原酸及异绿原 酸[ 1- 3] 。药理学研究表明, FL 具有抗病毒、抗氧化、 抗肿瘤、抗诱变和免疫调节等作用[ 4, 5] 。因其具有调 节机体免疫功能的作用, 临床上作为清热解毒剂治 疗感染性疾病[ 6] 。但其对免疫系统调节作用的基础 性研究, 尤其是对 T 细胞所介导的免疫应答影响的 研究却鲜见报道。本研究通过分析 FL 对 ConA 刺激
[ 摘 要] 目的 研究金银花 ( Flos lonicerae, FL) 提取物对小鼠淋巴细胞体外活化和增殖的影响, 并初 探其免疫抑 制作用
机制。方法 分离小 鼠淋巴结细胞, 以荧 光标记 的单克 隆抗体 染色结 合流 式细胞 术, 检测 FL 对 刀豆 蛋白 A ( Concanavalin A,
( 表 1, 图 1) 。
表 1 FL 对 ConA 刺激 的小鼠 T 淋巴细胞 CD69、CD25 和
CD71 表达的影响
Tab 1 Effects of FL on expressions of CD69, CD25, and CD71
HOU Hu-i na, ZENG Yao- ying, HUANG Xiu-yan, YIN Le- le ( Institute of Tissue Transplantation and Immunology , Jinan University , Guangzhou 510632, China )
第2期
侯会娜, 等1 金银花提取物对小鼠淋巴细胞 体外活化与增殖的影响
# 179 #
产品。 流 式 细 胞 仪 ( FACSCalibur ) 为 美 国 Becton Dickinson 公司产品。 1. 3 淋巴细胞悬液的制备 将 Balb/ c 小鼠断髓处 死, 无菌分离小鼠不同部位的淋巴结, 从整体上观察 金银花 提取物对免疫系 统的影响。取 小鼠双侧 颌 下、腋窝、浅腹股沟及肠系膜淋巴结, 去掉被膜, 200 目筛网 过滤, 收集 细 胞, 用 冷 PBS 洗涤 细 胞 2 次 ( 250 g , 5 min) 后, 细 胞 重悬 于 100 mL/ L FBS 的 RPMI- 1640 完全培养液中, 调整细胞数为 3 @ 109L- 1, 质量分数为 2 g/ L 台盼蓝染色判断活细胞百分率达 97% 。 1. 4 实验分组 选健康小鼠 30 只, 随机分为 5 组: A: 空白对照组; B: ConA 组; C: ConA+ FL ( 25 Lg/ mL) 组; D: ConA + FL ( 100 Lg/ mL ) 组; E: ConA + FL ( 200 Lg/ mL) 组。其中 ConA 终浓度为 5 Lg/ mL。 1. 5 细胞培养 将 3 @ 109L- 1淋巴细胞悬液接种于 96 孔细胞培养板, 分别加入不同浓度的 FL, 每孔终 体积为 200 LL, 在 37 e 、50 mL/ L CO2 培 养箱预 孵 4 h, 使药物透过细胞膜, 与细胞充分作用, 然后加入 ConA ( 终质量浓度为 5 Lg/ mL ) , 继续培养 12、24 h 和 48 h, 分别于不同的时间点收获细胞。 1. 6 T 细胞表面活化分子 CD69、CD25 和 CD71 的 检测 采用直接免疫荧光标记法染色, 取上述培养 的淋巴细胞, 冷 PBS 洗涤细胞 2 次, 按每 106细胞加 入 1 Lg 抗小鼠 CD3-PE/ FITC、抗 小鼠 CD69- FITC 或 抗小鼠 CD25- PE 或抗小鼠 CD71- PE, 混匀后, 室温避 光放置 30 min, PBS 洗涤细胞 2 次( 250 g , 5 min) , 重 悬于 400 LL PBS 中, 上流式细胞仪检测。 1. 7 CFDA- SE 染色法分析淋巴细胞增殖[ 7] CFDASE 用二甲基亚砜( DMSO) 溶解成 10 mmol/ L 的贮存 液, - 20 e 保 存。 临 用 前, 用 适 量 PBS 稀 释 成 1 mmol/ L 的 工 作 液, PBS 调 整 淋 巴 细 胞 数 为 1 @ 1010L- 1, 加 CFDA- SE 工作液( 终浓度为 1 Lmol/ L) , 充 分混匀后在室温条件下, 避光轻轻振荡 10 min。然 后用 含 50 mL/ L 血清 的 RPMI- 1640 培 养液 终止 染 色, 洗涤细胞 2 次( 200 g, 5 min) , 悬浮于含 100 mL/ L FBS 的 RPMI- 1640 完全培养液中, 并调整细胞数为 3 @ 109/ L, 接种于 96 孔细胞培养板, 培养 48 h 后收获 细胞, 以流式细胞仪检测。 1. 8 流 式 细 胞 仪 检 测 及 分 析 全 部 数 据 经 FACSCalibur 流式细胞仪和 CellQuest 软件获取, 每管 样品检测 10 000 个细胞, 获得的数据用 CellQuest 和 ModFitTMV 3. 0 软件进行分析。 1. 9 统计学处理 数据以均数 ? 标准差( x- ? s ) 表 示, 用统计软件包 SPSS 10. 0 for Windows 进行处理, 统计方法用单因素方差分析。
的增殖( P < 0. 05) 。结论 金银花提取物对 ConA 诱导下的小鼠淋巴细胞体外活化和增殖均 有明显抑制作用, 是一种有 潜在能
力的免疫抑制剂。
[ 关键词] 金银花提取物; 淋巴细胞; 活化; 增殖
[ 中图分类号] R392. 12
[ 文献标识码] A
Effects of Flos lonicerae extracts on the activation and proliferation of mouse lymphocytes in vitro
# 178 # 免 疫 学 杂 志 第 24 卷 第 2 期 2008 年 3 月 IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol. 24 No. 2 M ar. 2008
[ 文章编号] 1000- 8861( 2008) 02-0178- 04
金银花提取物对小鼠淋巴细胞体外活化与增殖的影响
侯会娜, 曾耀英* , 黄秀艳, 尹乐乐 ( 暨南大学组织移植与免疫中心, 广州 51Leabharlann Baidu632)
ConA) 刺 激的小鼠淋巴细胞活化的影响; 利用羧基荧光素乙 酰乙酸琥 珀酰亚胺酯 ( CFDA- SE) 染 色, 分 析 FL 对淋巴 细胞增 殖情
况。结果 细胞活化分析表明, 金银花提取物对 ConA 诱导的小鼠淋巴 细胞 CD69、CD25 和 CD71 表达 均有明显的 抑制作用, 且
这种抑制程度与其药物浓度呈正相关( P< 0. 05) 。CFDA- SE 染色 分析显示, 不同浓 度的金 银花提 取物均 能明显抑 制淋巴 细胞
[ 收稿日期] 2007- 04- 09; [ 修回日期] 2007- 08- 30 [ 基金项目] 973 国家重 大基础 研究课 题( 2004CB720100) 和广 东省基
金项目( 2006B36030016) 资助 [ 作者简介] 侯会娜( 1980- ) , 女, 河南夏邑县人, 硕 士生, 主要从事免
疫分子 识 别 与 疾 病 研究。 ( Tel ) 020-85226219; ( E-mail) xiaolingtong1127@ Tom. com * 通讯作者
下的小鼠 T 细胞活化和增殖影响, 初步探讨其免疫 调节机制, 为临床上在中药领域筛选和研发新型免 疫制剂提供参考数据和理论依据。
1 材料与方法
2 结果
2. 1 FL 对 T 细胞表达 CD69、CD25 和 CD71 的影
响 小鼠淋巴结 T 细胞静息状态下很少表达 CD69、
CD25 和 CD71, 经 ConA 刺激 12、24 或 48 h 后, CD69、
CD25 和 CD71 表达明显增加。FL 加药组对 ConA 刺
激组 CD69、CD25 和 CD71 的表达均有明显抑制作用
[Abstract] Objective To investigate the effects of Flos lonicerae ( FL ) extracts on the activation and proliferation of mouse lymphocytes in vitro and to elucidate the mechanism of the immunosuppressive effect of FL . Methods Lymphocytes isolated from lymphoid nodes of Balb/ c mouse were stained with fluorescence- conjugated monoclonal antibodies. The flow cytometry analysis was employed to detect the effects of FL on the activation of mouse lymphocytes treated with ConA . The effects of FL on the proliferation rate of mouse lymphocytes were also analyzed by CFDA- SE staining. Results The results indicated that FL could significantly inhibit the expression of CD69, CD25, and CD71 of mouse lymphocytes treated with ConA in a concentration- dependent way , while CFDA- SE analysis showed the proliferation of mouse lymphocytes was obviously inhibited by different concentrations of FL. Conclusion The activation and proliferation of the lymphocytes treated with ConA in vitro is significantly inhibited by FL, indicating FL is a potential immunosuppressive agent.
[ Key words] Flos lonicerae extract; Lymphocytes; Activation; Proliferation
金银花 ( Flos lonicerae, FL) 为忍冬科植物忍冬 ( Lonicera japonica Thunb ) 的干躁花蕾, 含有有机 酸 类、黄酮类、三萜皂苷类和挥发油等, 绿原酸类化合 物是金银花的主要有效成分, 包括绿原酸及异绿原 酸[ 1- 3] 。药理学研究表明, FL 具有抗病毒、抗氧化、 抗肿瘤、抗诱变和免疫调节等作用[ 4, 5] 。因其具有调 节机体免疫功能的作用, 临床上作为清热解毒剂治 疗感染性疾病[ 6] 。但其对免疫系统调节作用的基础 性研究, 尤其是对 T 细胞所介导的免疫应答影响的 研究却鲜见报道。本研究通过分析 FL 对 ConA 刺激
[ 摘 要] 目的 研究金银花 ( Flos lonicerae, FL) 提取物对小鼠淋巴细胞体外活化和增殖的影响, 并初 探其免疫抑 制作用
机制。方法 分离小 鼠淋巴结细胞, 以荧 光标记 的单克 隆抗体 染色结 合流 式细胞 术, 检测 FL 对 刀豆 蛋白 A ( Concanavalin A,
( 表 1, 图 1) 。
表 1 FL 对 ConA 刺激 的小鼠 T 淋巴细胞 CD69、CD25 和
CD71 表达的影响
Tab 1 Effects of FL on expressions of CD69, CD25, and CD71
HOU Hu-i na, ZENG Yao- ying, HUANG Xiu-yan, YIN Le- le ( Institute of Tissue Transplantation and Immunology , Jinan University , Guangzhou 510632, China )
第2期
侯会娜, 等1 金银花提取物对小鼠淋巴细胞 体外活化与增殖的影响
# 179 #
产品。 流 式 细 胞 仪 ( FACSCalibur ) 为 美 国 Becton Dickinson 公司产品。 1. 3 淋巴细胞悬液的制备 将 Balb/ c 小鼠断髓处 死, 无菌分离小鼠不同部位的淋巴结, 从整体上观察 金银花 提取物对免疫系 统的影响。取 小鼠双侧 颌 下、腋窝、浅腹股沟及肠系膜淋巴结, 去掉被膜, 200 目筛网 过滤, 收集 细 胞, 用 冷 PBS 洗涤 细 胞 2 次 ( 250 g , 5 min) 后, 细 胞 重悬 于 100 mL/ L FBS 的 RPMI- 1640 完全培养液中, 调整细胞数为 3 @ 109L- 1, 质量分数为 2 g/ L 台盼蓝染色判断活细胞百分率达 97% 。 1. 4 实验分组 选健康小鼠 30 只, 随机分为 5 组: A: 空白对照组; B: ConA 组; C: ConA+ FL ( 25 Lg/ mL) 组; D: ConA + FL ( 100 Lg/ mL ) 组; E: ConA + FL ( 200 Lg/ mL) 组。其中 ConA 终浓度为 5 Lg/ mL。 1. 5 细胞培养 将 3 @ 109L- 1淋巴细胞悬液接种于 96 孔细胞培养板, 分别加入不同浓度的 FL, 每孔终 体积为 200 LL, 在 37 e 、50 mL/ L CO2 培 养箱预 孵 4 h, 使药物透过细胞膜, 与细胞充分作用, 然后加入 ConA ( 终质量浓度为 5 Lg/ mL ) , 继续培养 12、24 h 和 48 h, 分别于不同的时间点收获细胞。 1. 6 T 细胞表面活化分子 CD69、CD25 和 CD71 的 检测 采用直接免疫荧光标记法染色, 取上述培养 的淋巴细胞, 冷 PBS 洗涤细胞 2 次, 按每 106细胞加 入 1 Lg 抗小鼠 CD3-PE/ FITC、抗 小鼠 CD69- FITC 或 抗小鼠 CD25- PE 或抗小鼠 CD71- PE, 混匀后, 室温避 光放置 30 min, PBS 洗涤细胞 2 次( 250 g , 5 min) , 重 悬于 400 LL PBS 中, 上流式细胞仪检测。 1. 7 CFDA- SE 染色法分析淋巴细胞增殖[ 7] CFDASE 用二甲基亚砜( DMSO) 溶解成 10 mmol/ L 的贮存 液, - 20 e 保 存。 临 用 前, 用 适 量 PBS 稀 释 成 1 mmol/ L 的 工 作 液, PBS 调 整 淋 巴 细 胞 数 为 1 @ 1010L- 1, 加 CFDA- SE 工作液( 终浓度为 1 Lmol/ L) , 充 分混匀后在室温条件下, 避光轻轻振荡 10 min。然 后用 含 50 mL/ L 血清 的 RPMI- 1640 培 养液 终止 染 色, 洗涤细胞 2 次( 200 g, 5 min) , 悬浮于含 100 mL/ L FBS 的 RPMI- 1640 完全培养液中, 并调整细胞数为 3 @ 109/ L, 接种于 96 孔细胞培养板, 培养 48 h 后收获 细胞, 以流式细胞仪检测。 1. 8 流 式 细 胞 仪 检 测 及 分 析 全 部 数 据 经 FACSCalibur 流式细胞仪和 CellQuest 软件获取, 每管 样品检测 10 000 个细胞, 获得的数据用 CellQuest 和 ModFitTMV 3. 0 软件进行分析。 1. 9 统计学处理 数据以均数 ? 标准差( x- ? s ) 表 示, 用统计软件包 SPSS 10. 0 for Windows 进行处理, 统计方法用单因素方差分析。
的增殖( P < 0. 05) 。结论 金银花提取物对 ConA 诱导下的小鼠淋巴细胞体外活化和增殖均 有明显抑制作用, 是一种有 潜在能
力的免疫抑制剂。
[ 关键词] 金银花提取物; 淋巴细胞; 活化; 增殖
[ 中图分类号] R392. 12
[ 文献标识码] A
Effects of Flos lonicerae extracts on the activation and proliferation of mouse lymphocytes in vitro
# 178 # 免 疫 学 杂 志 第 24 卷 第 2 期 2008 年 3 月 IMMUNOLOGICAL JOURNAL Vol. 24 No. 2 M ar. 2008
[ 文章编号] 1000- 8861( 2008) 02-0178- 04
金银花提取物对小鼠淋巴细胞体外活化与增殖的影响
侯会娜, 曾耀英* , 黄秀艳, 尹乐乐 ( 暨南大学组织移植与免疫中心, 广州 51Leabharlann Baidu632)
ConA) 刺 激的小鼠淋巴细胞活化的影响; 利用羧基荧光素乙 酰乙酸琥 珀酰亚胺酯 ( CFDA- SE) 染 色, 分 析 FL 对淋巴 细胞增 殖情
况。结果 细胞活化分析表明, 金银花提取物对 ConA 诱导的小鼠淋巴 细胞 CD69、CD25 和 CD71 表达 均有明显的 抑制作用, 且
这种抑制程度与其药物浓度呈正相关( P< 0. 05) 。CFDA- SE 染色 分析显示, 不同浓 度的金 银花提 取物均 能明显抑 制淋巴 细胞
[ 收稿日期] 2007- 04- 09; [ 修回日期] 2007- 08- 30 [ 基金项目] 973 国家重 大基础 研究课 题( 2004CB720100) 和广 东省基
金项目( 2006B36030016) 资助 [ 作者简介] 侯会娜( 1980- ) , 女, 河南夏邑县人, 硕 士生, 主要从事免