MTT法检测淋巴细胞

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MTT原理方法及操作步骤

MTT原理方法及操作步骤MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物）是一种常用的细胞增殖测定试剂，用于定量测定细胞的存活情况。

MTT的工作原理：MTT原理是基于还原型特种金属试剂Florida Cyanide。

MTT可进入细胞内部，被活细胞内的膜连蛋白酶还原为水溶性紫色化合物，甲基化噻唑胺盐（formazan）。

甲基化噻唑胺盐可溶于有机溶剂如DMSO或乙醇。

MTT的量越多，被还原为甲基化噻唑胺盐越多，即细胞活性越高。

MTT的操作步骤：1.预处理细胞将需要检测细胞的培养基倒入培养皿中，将获得的细胞悬液加入培养基中，根据实验要求进行设定浓度和培养时间。

2.处理试剂根据常规的MTT工作浓度（通常为0.5 mg/ml），将MTT试剂精确称取并溶解在无菌的溶剂（例如PBS）中。

3.细胞处理将培养中的细胞培养液抽取约100μl至新的96孔板孔中，并注意控制每个孔中细胞数相同时的培养基体积。

4.加入MTT试剂将所制备的MTT溶液以100μl的体积的溶液加入到培养细胞上，并尽量在操作中迅速搅拌均匀，以使MTT均匀分布。

5.细胞孔板孔的处理将MTT试剂添加到孔中后，覆盖板密封（如用保鲜膜密封）。

然后将培养皿放入暗处，37°C培养孔中的细胞进行inculbation与MTT碳酸酯酶的反应。

通常培养12至24小时，可以根据具体实验情况延长培养时间。

6.细胞孔中溶解甲基化噻唑胺盐将培养平皿中的培养液取出约50μl，悬浮溶解掉的甲基化噻唑胺盐，再加入200μlDMSO混合均匀。

7.测定吸光度将孔中的溶液分别转移到透明壁的96孔板，并使用微孔板阅读装置（Multiskan Spectrum）在570 nm波长下测定吸光度。

DMSO溶液作为空白参照，用作光强的基准。

8.数据分析根据检测吸光度得到的数据，计算出每个孔的平均值，并根据实验要求，进行数据图表分析。

总结：MTT法是一种可靠、灵敏、简单、可重复性好的细胞增殖测定方法。

淋巴细胞转化试验(MTT)

一、淋巴细胞转化试验（MTT）（一）原理：四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。

当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。

（二）材料：MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。

用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。

丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原（三）方法：1、脾细胞制备：（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。

放入盛有5ml Hanks液的培养皿中；（4）制备脾细胞悬液①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。

取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。

调整细胞浓度为5 105/ml。

②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；③酶消化法：将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。

MTT法原理步骤

细胞的增殖检测（MTT法）MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济，但由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。

一、检测原理MTT全称为3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（商品名：噻唑蓝），是一种黄颜色的染料。

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值（也有用570nm波长)，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

二、试剂材料准备与实验仪器1、对数生长期细胞2、受试因素（药物）3、5mg.mL-1MTT溶液：称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中（60℃水浴助溶），用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可，在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

（PBS配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调pH 7.4 ，定容1L）4、DMSO（二甲基亚砜）5、96孔板6、酶联免疫检测仪7、细胞培养箱三、MTT法实验步骤（一）普通MTT法实验步骤1、接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2、培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

MMT

实验步骤
1. 无菌制作脾细胞悬液 1）无菌条件下取试验各组脾脏 2）在盛有10 ml 4℃ Hank's液的烧杯中将脾以眼科剪剪碎 , 经200 目尼龙网轻柔研磨后过筛 , 收集细胞悬液, 将滤液以1 500 r/min 离心5 min。 3）倒去上清液体, 观察沉淀细胞体积。以10:1 体积比加入红细胞裂解液混匀。 4）静置2 min 后, 立即加入4 ℃ 10 ml Hank's液, 以 1 500 r/ min 离心5 min。 5）倒去上清液体, 用Hank's液反复洗涤细胞2 次。 6）最后一次离心前进行细胞计数 , DMEM培养基重悬细胞, 调整细胞浓度为5×10^6/ ml
MTT法：活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶以MTT为底物，形成蓝色的甲臜（ Formazan ）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经 DMSO 溶解后为紫色溶液，可用酶标测定仪测定 OD570 的值 , 来间接反映活细胞数量。

ConA 刺激淋巴细胞 → 出现淋巴细胞转化现象→加入MTT→活化的淋巴细胞使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒 → 二甲基亚砜溶解细胞中的甲瓒→酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其OD值

预பைடு நூலகம்结果：

淋巴细胞悬液的制备 : 无菌取肝素抗凝外周血 5 ml, 沿管壁缓慢加入到含 6 ml淋巴细胞分离液的离心管中 ,两液之间形成界面 ; 2 000 r/min 离心 20 min, 收集分离液界面上富含淋巴细胞的液体加于另一离心管中 , 1 000 r/min离心 7 min, 弃上清 ; 淋巴细胞用 Hank's 液洗涤二次后加入 DMEM完全培养液 ,配制成细胞数 5 × 10^6 /ml 的单细胞悬液。（ Hank's 液是一种平衡盐溶液，主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等）

MTT法检测细胞活性的操作方法

MTT法检测细胞活性的操作方法一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

二、MTT法用来做什么简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。

MTT主要有两个用途1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；2．细胞增殖及细胞活性测定。

三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。

四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS 或生理盐水做溶剂。

市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g。

1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。

具体做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。

可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。

将MTT 完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。

按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。

MTT法测定棉酚对多浪羊淋巴细胞生长的影响

MTT法测定棉酚对多浪羊淋巴细胞生长的影响摘要：通过MTT法测定棉酚对多浪羊淋巴细胞生长的影响，确定棉酚对多浪羊淋巴细胞产生影响的最短作用时间和最低浓度，用于指导生产实践。

从新疆多浪羊外周血分离淋巴细胞，将其加入10 mL的RPMI-1640中，均匀加入96孔细胞培养板中，于CO2 培养箱中37 ℃培养12 h后，分别以不同浓度（5、10、15、20、25、30、35 μmol/L）的棉酚进行作用，作用时间分别为1、2、3、4、5、6 h，加入MTT培养4 h，加入DMSO溶液终止反应，用酶联免疫检测仪于490 nm 处检测各孔的吸光值。

结果表明，随着棉酚作用浓度及作用时间的递增，多浪羊淋巴细胞活性在逐渐下降，说明棉酚对多浪羊的淋巴细胞活性有明显的抑制作用。

关键词：MTT；棉酚；新疆多浪羊；淋巴细胞；影响The Effect of Gossypol on Lymphocyte Growth of Duolang Sheep by MTTAbstract：The effect of gossypol on the growth of Duolang sheep lymphocyte was detected by MTT assay. The object was to determine the shortest time and lowest concentration of gossypol on lymphocyte，and then used to practice. The lymphocyte was isolated from the peripheral blood of Xinjiang Duolang sheep，then added into 10 mL RPMI-1640 and even allocated to 96-well cell culture plate. After cultured in CO2 incubator at 37 ℃for 12 h，the lymphocytes were treated with gossypol of different concentrations （5，10，15，20，25，30，35 μmol/L）for 1，2，3，4，5，6 h，and then added MTT to culture 4 h. At last the reaction was stopped by adding DMSO solution. The absorbance of each well was detected by ELISA at OD490 nm . The results showed that the activity of Duolang sheep lymphocytes decreased with the increase of gossypol concentration and acting time. It indicated that gossypol had obvious inhibitory effect on the Xinjiang Duolang sheep lymphocytes.Key words：MTT；gossypol；Xinjiang Duolang sheep；lymphocyte；effect棉酚（Gossypol，GL）存在于锦葵科某些植物的根、茎、种子中，曾作为男性节育药为人们所熟知[1]。

mtt试验原理

mtt试验原理MTT试验原理MTT试验是一种常用的细胞毒性测试方法，被广泛应用于药物筛选、毒性评估、细胞生物学研究等领域。

本文将介绍MTT试验的原理及其在科学研究中的应用。

MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）试验是一种通过测量细胞线粒体脱氢酶活性来评估细胞代谢活性的方法。

MTT试剂会在细胞内还原为可溶性的紫色产物，通过比色法测定其吸光度，可以间接反映细胞的存活水平。

MTT试验的原理如下：首先，将需要测试的细胞接种在培养基中，使其在恰当的条件下生长繁殖。

然后，将待测物添加到细胞培养物中，不同浓度的待测物可以评估其对细胞的毒性作用。

接下来，在特定的时间点，加入MTT试剂到培养物中，允许其在细胞内转化为紫色产物。

最后，通过溶解细胞并测定溶液的吸光度，可以计算出细胞的存活率。

MTT试验的优势在于其简单、快速、经济，并且可以同时测试多个样品。

通过MTT试验，可以评估药物的毒性、筛选抗肿瘤药物、研究细胞增殖和凋亡等生物学过程。

此外，MTT试验还可以与其他实验方法相结合，如细胞周期分析、细胞迁移实验等，从不同角度全面评估细胞的生理状态。

MTT试验的结果常用半数抑制浓度（IC50）来表示药物的毒性。

IC50值是指药物对细胞生长的抑制作用达到50%所需的浓度。

通过比较不同药物的IC50值，可以评估它们的毒性大小，并选择具有较低毒性的药物进行进一步研究。

然而，MTT试验也存在一些局限性。

首先，MTT试验只能反映细胞的存活水平，无法提供关于细胞死亡机制的详细信息。

其次，MTT 试验对于某些药物或化合物可能存在误差，因此需要结合其他实验方法进行验证。

MTT试验是一种简单快速的细胞毒性测试方法，被广泛应用于药物筛选和细胞生物学研究中。

通过测定细胞存活率，可以评估药物的毒性作用，并为进一步研究提供重要参考。

然而，我们也要意识到MTT试验的局限性，并结合其他实验方法进行综合评估。

MTT法检测牛口蹄疫基因疫苗免疫小鼠T淋巴细胞增殖反应的研究

MTT法检测牛口蹄疫基因疫苗免疫小鼠T淋巴细胞增殖反应
的研究
张爱莲;金华利;王宾;张富春
【期刊名称】《地方病通报》
【年(卷),期】2004(19)3
【摘要】目的检测牛口蹄疫基因疫苗免疫小鼠后的细胞免疫水平 ,全面评价牛口蹄疫基因疫苗的免疫效果。

方法采用MTT法检测牛口蹄疫基因疫苗免疫小鼠的T淋巴细胞增殖反应能力 ,以期反应出免疫小鼠的细胞免疫应答水平。

结果通过MTT法检测出牛口蹄疫基因疫苗能够激发小鼠的细胞免疫应答。

结论MTT法是检测细胞免疫水平的方法之一。

【总页数】3页(P1-3)
【关键词】牛口蹄疫基因疫苗;T淋巴细胞;增殖反应;MTT比色法
【作者】张爱莲;金华利;王宾;张富春
【作者单位】新疆大学生命科学与技术学院
【正文语种】中文
【中图分类】R535;R-322
【相关文献】
1.MTT法检测蛙皮活性多肽促进小鼠淋巴细胞增殖作用 [J], 巢警殳;张岚;杜娟;葛红娟;周涌
2.MTT法检测蛙皮活性多肽促进小鼠淋巴细胞增殖作用 [J], 巢警殳;张岚;杜娟;葛红娟;周涌
3.MTT法检测小鼠淋巴细胞增殖试验的心得体会 [J], 魏秋芬;秦啸峰;潘晋
4.MTT法检测小鼠淋巴细胞增殖性反应探讨 [J], 刘民;马华;李柏青
5.MTT比色分析法检测鸡T淋巴细胞体外增殖反应的研究 [J], 李庆章
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MTT法检测番鸭外周血淋巴细胞转化功能的研究

动物医学进展,2005,26(1):75277Progress in Veterinary MedicineMTT法检测番鸭外周血淋巴细胞转化功能的研究林锋强,胡奇林3,陈少莺,陈仕龙,程晓霞,朱小丽(福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350003)中图分类号:S852.4;S858.32文献标识码:A文章编号:100725038(2005)0120075203摘　要:为了建立番鸭淋巴细胞转化检测的MTT法,筛选细胞浓度、刀豆蛋白C onA浓度和培养时间3个参数对试验条件进行了研究。

结果确定了MTT法检测番鸭淋巴细胞转化能力的最佳培养条件,细胞浓度5×106个/ m L在20μg/m L C onA的RMPI1640完全培养基40℃培养60h。

试验表明,该方法可用于番鸭体外细胞免疫功能的检测。

关键词:MTT;番鸭;淋巴细胞转化淋巴细胞转化试验的原理是T淋巴细胞在有丝分裂原(如C onA,PH A)的刺激下,引起细胞内新的DNA合成及细胞分化,从而发生一系列增殖变化,如细胞体积增大、细胞浆增加、核仁明显、染色质疏松等,称为淋巴母细胞。

该试验主要用于体外检测T 淋巴细胞的生物学功能,反映机体的细胞免疫水平[1]。

常用方法有放射性同位素标记法和形态学方法[2]。

放射性同位素标记法需要特殊的仪器设备,较多的人力和物力,并且难以进行大批量的样品检测。

形态学方法主观性强,费时费力[2]。

目前多采用比色法(MTT法)检测淋巴细胞的转化功能,此法操作简便,便于大批量样品检测[3]。

目前,尚未见　收稿日期:2004206230 基金项目:福建省科技厅资助项目(2001Z061) 作者简介:林锋强(1976-),男,福建福州人,助理研究员,硕士,主要从事免疫学和分子生物学研究。

3通讯作者阶段。

最初(1941)是用比较良性的野外毒株给鸡群中的中雏接种,使其自然传播而获得全群免疫,以减少经济损失。

此法接种反应较重,并有长期散毒的危险。

mtt法检测原理

mtt法检测原理
MTT法是一种细胞活力检测方法，其原理是利用一种水溶性的四磺基联苯噻唑（MTT）化合物，该化合物酶解后能在细胞内氧化成紫红色的固体沉淀形式集中在细胞内或细胞外。

MTT法可以通过以下步骤进行：
1.使用MTT溶液处理细胞，MTT被细胞摄取并内部酶解，产生紫色颜料。

2.移除细胞培养基，加入溶解MTT晶体的溶液，其作用是使颗粒体内相对较水溶的紫色颜料转化为相对较油溶的品质以便测定。

3.加入70%的甲醛溶液停止反应，使细胞膜溶解并挥发掉培养基中的水分。

4.使用酸性异丙醇提取液提取细胞内的紫色颜料，然后利用平板读数器或光谱仪能够检测到颜色，根据其吸收峰的波长能够将颜色与细胞数量和活力相关联。

MTT法的优点是无需使用放射性标记物，可以检测多种细胞类型，快速、准确、灵敏，但也有一些缺点，如可能受到细胞内某些化合物干扰，也不适合用于长时间检测。

淋巴细胞转化试验(MTT)

一、淋巴细胞转化试验（MTT）（一）原理：四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。

（二）材料：MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。

用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。

取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。

调整细胞浓度为5 105/ml。

MTT法检测细胞活性及其应用

MTT法检测细胞活性与其应用一、实验目的1.掌握MTT法的基本原理和操作,学会应用MTT法解决简单的实际问题.2.巩固动物细胞培养的知识,熟练相关操作.3.学会酶联免疫检测仪〔简称酶标仪〕的操作方法.二、实验原理1.MTT法又称MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法.其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒〔Formazan〕并沉积在细胞中,而死细胞无此功能.二甲基亚砜〔DMSO〕[三联溶液]能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量.在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比.该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以与肿瘤放射敏感性测定等.它的特点是灵敏度高、经济.2.细胞冻存与复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力.目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤.复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤.3.从动物机体中取出的相关组织通过胰蛋白酶或胶原蛋白酶可以将其分散成单个细胞.再放于适宜的培养基中,可以使这些细胞生长繁殖以供实验所需.该实验对无菌要求极高,以培养出满足实验条件的细胞.4.酶联免疫检测仪测定的原理是在特定波长下检测被测物的吸光值.酶标仪实质就是一台变相的专用光电比色计或分光光度计.三、实验材料,器材与试剂材料：Hela细胞〕,冰箱〔4℃、-20℃、-70℃〕,器材：恒温水浴锅,超净工作台,培养箱〔37℃,5%CO2液氮冰箱,灭菌锅,烧杯,培养瓶,滴管,酒精灯,镊子,离心机,24孔培养板,96孔培养板,摇床,酶标仪,倒置显微镜,移液枪〔带枪头〕,15mL离心管,冻存管〔1-2mL〕,红血球计数板,记号笔,0.22μm滤膜,铝箔纸.试剂：二甲基亚砜〔分析纯〕,甘油,10%胎牛血清,胰蛋白酶〔0.5%〕,双抗〔青霉素,链霉素 1万单位/mL〕,磷酸缓冲液〔配制见附录1〕,MTT〔 3-〔4,5-二甲基噻唑-2〕-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名：噻唑蓝.〕〔配制见附录2〕,DMEM 培养液<配制见附录3>,无菌水,抗肿瘤药物〔具体待定〕四、实验步骤A.Hela细胞复苏1.从液氮容器中取出从液氮容器中取出冻存管,直接浸入37℃温水中,并不时摇动令其尽快融化；2. 从37℃水浴中取出冻存管,打开盖子,用吸管吸出细胞悬液,加到离心管并滴加10倍以上DEME培养液,混匀；3. 离心,1000rpm,5min；4. 弃去上清液,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬细胞,计数,调整细胞密度至1×104个/mL,部分接种培养瓶,37℃培养箱静置培养；5. 次日更换一次培养液,继续培养,此后定期更换培养液,维持细胞正常活性.B.MTT检测复苏细胞的细胞活性Hela细胞计数用血细胞计数板的四个角上的方块.1. 接种培养瓶同时,将其余部分接种于96孔细胞培养板,7组,每组5孔,每孔100μL,37℃培养箱静置培养；2.培养24h后,向每孔内加入用磷酸缓冲液配制的0.5%MTT〔5mg/mL〕20uL,37℃培养箱内培育；3.4h后终止培养,将孔内培养液小心吸出.每孔加入150μL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解.同时每行第一孔设置为调零孔〔培养基、MTT、二甲基亚砜〕.用酶标仪OD570nm处测量各孔吸光值；C.细胞生长曲线制作接B.2,B.3步骤,连续测量7天,根据测量结果绘制细胞生长曲线.[横坐标生长时间,纵坐标吸光度值.]D.探究某药物对于细胞活性的影响1.将之前培养于培养瓶中的细胞用0.5%胰蛋白酶洗脱,加入DEME培养液制成细胞密度为1×106个/mL的细胞悬液；2.设置空白对照组与5个不同药物梯度的实验组,分别加载96孔培养板内〔5个梯度剂量按药物种类待定〕,每个剂量分别设置5个平行孔,每孔加入细胞悬液100μL〔在加药的前一天下午完成铺板〕；3.次日上午按预先设置的药物梯度加药,后置37℃培养箱培养24h；4.每孔加入20μLMTT溶液,继续培养4h〔若药物能与MTT反应,可以先离心后弃去上清液,用PBS冲洗2-3遍后再加入MTT溶液〕5终止培养,小心吸去孔内培养液；6.每孔加入150μL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解,用酶标仪OD490nm处测量各孔的吸光度；7.同时设置调零孔〔培养基、MTT、二甲基亚砜〕,对照孔〔细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜〕.E.Hela细胞冻存1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；2.取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来,悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中；3.离心1000rpm,5min；4.去除胰蛋白酶与旧的培养液,加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀,计数,调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；5.将细胞分装入冻存管中,每管1～1.5 ml；6.在冻存管上标明细胞的名称,冻存时间与操作者；7.冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时,可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时,则可迅速浸入液氮中.也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ,然后放入-70℃冰箱中过夜,取出冻存管,移入液氮容器内.五、实验结果Hela细胞复苏情况良好,生长曲线绘制较好,成功验证肿瘤细胞对Hela细胞的作用.六、附录1.磷酸缓冲液配制方法NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO41.44g, KH2PO40.24g, 调pH 7.4,定容1L2.0.5%MTT溶液配制方法称取MTT0.5g,溶于100mLPBS中,用0.22μm滤膜除菌,放4℃避光保存.配制和保存过程中,容器最好用铝箔纸包住.。

淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类

粒细胞、肥大细胞、血小板等，
单纯参与免疫效应。
淋巴细胞
lymphocyte
构成机体免疫器官的基本单位，是
体内极为复杂的不均一细胞群体，包括
许多形态上相似而功能不同的亚群，功
能和表面标志各不相同，具有明显的异
质性。T细胞和B细胞是其中最主要的两
大群体。
表面标志（epitope）：淋巴细胞表面具有可供鉴别的特殊结构在淋巴细胞的不同分化阶段，其各种表面标志的表达也各不相同。淋巴细胞与其它细胞之间、与周围环境中的分子间的相互作用以及淋巴细胞识别抗原、活化、辅助、抑制、杀伤等生物学作用均与其表面标志有关。
T细胞主要的CD抗原
（1）CD2：表达于全部T细胞和NK细胞表面；由3 种抗原性不同的分子组成（CD2-1，2，3） CD2-1，2表达于静止细胞表面，CD2-3表达于活化的T细胞表面。CD2可与绵羊红细胞（SRBC）结合，故又称绵羊红细胞受体（E受体），它是粘附分子之一，在抗原提呈过程中起辅助作用。
丢失。
有些还与细胞功能相关，如： CD21和CD35
是补体受体，CD23和CD32是Ig的Fc受体。
5. Fc受体
IgG的Fc受体（CD32），与B细胞活性相关。Fc受体可与抗体包被的红细
胞相结合形成EAC花环，是鉴别B细胞
的传统方法之一。
其他表面标志：
丝裂原受体
EB病毒受体
细胞因子受体
小鼠红细胞受体
（2）CD3： 6肽复合分子，表达于全部T细胞表面，是T细胞共有的表面标志。 CD3 与TCR非共价结合形成完整的TCR-CD3复合体， CD3可将TCR与抗原结合所产生的活化信号传递入T细胞内，使之活化、增殖。
（3）CD4/CD8： T细胞亚群的表面标志。 CD4+T细胞辅助性T细胞（T helper ， TH ），主要识别MHCⅡ类分子结合的外源性多肽抗原，具有辅佐或诱导免疫应答的功能，部分细胞也有杀伤和抑制功能； CD8+T细胞细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell, Tc），主要识别MHCⅠ类分子结合的内源性多肽抗原，具有杀伤靶细胞和抑制免疫功能。

MTT使用讨论总结(附MTS测定方法)

本实验室也有人据此而仅采用眙盼蓝计数法测定细胞增殖程度，做药物对细胞株生长的影响时，我想细胞增殖程度应该是比较重要的指标，怎可马虎行事。

请高手指点迷津！bengbu_bli 用普通血球计数板计数增殖细胞的数量，只要检测的细胞样本数量不是非常大，只要能够数得过来，而且一般来讲，都是熟练者计数的话，应该是比MTT法要准确的多。

据了解，国外许多档次不低的杂志都是认可这种经典或传统计数细胞的方法的。

midas丁香园主任是的，只要idea巧妙有创意，而用于证明他们的方法都是次要的！diandian眙盼蓝、MTT确实不是一个好的方法，国外的许多杂志已不太使用，国内还认可的。

关键是整篇文章的思路和结构，好的idea是很重要的。

我的一个师姐的文章就被提出眙盼蓝、MTT的问题，但最后编委认为整篇文章的思路很好，也就不计较眙盼蓝、MTT的问题了。

实属兴运。

杂志Cancer Research Therapywm_ni丁香园主任国内由于实验条件的问题，应用H3的还是不多，而以MTT为主，以我的经验眙盼蓝计数法误差确实很大，所以不知道bengbu_bli的观点源自何处，另外如果有一个好的idea，如果不能用好的方法去证实，实在是一种遗憾，当然发不发还是要看编辑了。

MTT测定细胞的存活率

MTT测定细胞的存活率MTT测定细胞的存活率实验材料：1）试剂：MTT、DMSO、DMEM、PBS。

2）材料：15mL离心管、1.5mL EP管、1mL和200μL枪头、排槽，在实验前准备好，121℃30min灭菌后置于超净台中。

96孔培养板为一次性塑料制品。

3）仪器：超净台、CO2培养箱、显微镜、离心机、单道及八道移液枪、细胞计数板，酶标仪等。

实验操作：1）种板：a.准备工作：保证超净台中有15mL的离心管和1mL枪头，将细胞计数板和盖玻片用擦镜纸擦干净；b.使用移液枪将培养皿中的细胞吹下来，转移到15mL离心管中，1000rpm离心5min；c.离心完后用移液枪吸去上清，加入3mL新鲜培养基，轻轻吹打50下，使细胞在培养基中分布均匀成为单细胞悬液，从中取出20μL 稀释到200μL，在从中取出20μL加到细胞计数板上进行细胞计数，所得的数据乘以10即为细胞的浓度；d.以96孔板上每孔1×104个细胞，每孔150μL计算细胞浓度，将细胞悬液稀释到所需的浓度，放到排槽中，用八道移液枪加样，注意为了消除边缘效应，周围一圈的孔都不加样，而倒数第二排加入培养基作为对照，这样只需在2~11列，B~F排加入细胞悬液；e.细胞加好后，轻轻晃动培养板使细胞分别均匀，然后在周围一圈的孔中加入200μL PBS，在显微镜下观察后，置入培养箱中。

2）加药：细胞在培养箱中培养24小时后就可以加药诱导了。

a. 准备工作：保证超净台中有1.5mL EP管和1mL及200μL枪头，b.配药：因为现在每孔是150μL培养基，加入50μL的药物总体积为200μL，故配药的浓度为最终浓度的4倍，按浓度梯度使用1.5mL EP管配制不同浓度的药物，c.加板：然后使用200μL的移液枪将配好的药物加入培养板中，每孔50μL，最后置入培养箱中。

3）显色：诱导到规定的时间就可以加MTT显色了。

a. 准备工作：配制MTT 溶液（用PBS将MTT配成5mg/mL溶液，注意避光）；b.将配好的MTT 溶液，以每孔20μL的量加入到培养板中，再置入培养箱中；c.4小时后将板中的培养基倒掉，每孔加入200μL DMSO，在酶标仪上震荡1min，570nm下测定每孔的吸光度。

T淋巴细胞功能及检测方法(1)

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医学免疫学实验：T 淋巴细胞转化试验

T 淋巴细胞转化试验一、实验目的学习并掌握T淋巴细胞转化方法。

二、实验原理T 细胞在体外培养时，受到有丝分裂原（如PHA、ConA）刺激后，可出现细胞体积增大，代谢旺盛，蛋白和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。

淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。

淋巴细胞转化试验结果的读取可以有形态计数法、MTT 法和同位素法三种。

MTT 法即四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法。

MTT 是一种噻唑盐，化学名3-（4,5-二甲基-2-噻唑）-2,5-二苯基溴化四唑，水溶液为黄橙色。

小鼠脾细胞受到ConA（刀豆蛋白A）作用后发生增殖活化，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，MTT作为其底物参与反应，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经盐酸-异丙醇溶解后为蓝色溶液，可用酶标测定仪测定细胞培养物的OD值，测定波长570 nm。

根据OD 值的大小计算反应体系中细胞增殖程度。

三、实验材料1. ICR 小鼠（北京大学医学部实验动物中心提供）2. RPMI 1640 培养液，Hank's 液3. 刀豆蛋白A（Concanvalin A, ConA），用RPMI 1640 液配成1 mg / ml，分装小瓶，冷冻保存4. MTT (1mg/ml, 溶于pH 7.2 的PBS 中)5. 2.5%碘酒、75%酒精6. 无菌尖吸管和刻度吸量管7. 无菌解剖器械8. 96 孔平底培养板9. 5% CO2 培养箱（美国NAPCO 公司产品）10. 酶标测定仪（美国BioRad 公司产品）四、实验步骤1. 小鼠脾细胞悬液的制备：取一个灭菌的平皿，加入5 ml Hank's 液。

颈椎脱臼法处死小鼠，取脾脏，放入平皿中，在钢网上研磨并过筛，制成细胞悬液。

取出100 μl用于计数。

将其余细胞悬液移入一离心管中，离心1500 rpm，7 min，（或1000 rpm，10 min）弃去上清，用RPMI 1640 培养液稀释，制成2.5 × 10^6 / ml 的脾细胞悬液，然后加入ConA 使每孔最终浓度为2 μg / ml，同时做不加ConA 的阴性对照孔。

免疫淋巴细胞转化实验与MTT法

淋巴细胞转化实验与MTT法一、材料1.普通材料：(1)RPMI 1640细胞培养液。

(2)抗生素：青霉素、链霉素、（按100u/ml加入培养液中）。

(3)0.1%植物血凝素(PHA).2.MTT,二甲基亚砜。

3.96孔培养板、酶联免疫检测仪、超净工作台、刻度吸管。

二、实验步骤及方法1.无菌操作，取淋巴细胞分离法分离的淋巴细胞致细胞悬液，调整浓度106个细胞/ml，按100μl/孔加入96孔培养板中，每一份淋巴细胞悬液分6个孔，设置实验组3孔加PHA，阳性对照3孔不加PHA。

↓2.实验组中每孔加含RPMI 1640培养液100μl（含PHA100μg/ml）。

↓3.37。

C,5%CO2 培养箱中培养72h，每日摇动数次。

↓4.培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液100μl，加入100μl不含小牛血清的RPMI 1640培养液，同时加入MTT（5mg/ml）10μl/孔，继续培养4h。

↓5.培养结束后每孔加入200μl的二甲基亚砜，混匀、振荡溶解10min，使紫色结晶完全溶解。

同时设置调零孔RPMI 1640（不含小牛血清培养液100μl，MTT 10μl，二甲基亚,200μl），置酶标仪（主波长570nm，辅助波长630nm）上测OD570。

↓6.计算刺激指数（SI）,SI=实验组OD570均值/阴性对照组OD570均值，以SI的高低来判断淋巴细胞的转化程度。

三、实验注意事项1.选择适当的细胞接种浓度，一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。

但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。

这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。

否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

2.药物浓度的设定，一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。