Lu 淋巴细胞体外增殖功能检测

淋巴细胞增殖实验
淋巴细胞转化率的高低可直接反应机体T或B细胞的免疫水 平，常作为检测免疫细胞功能的指标之一 评价动物免疫细胞免疫应答能力的简便可靠的方法之一
淋巴细胞增殖功能测定
细胞计数法
DNA合成检测法
细胞代谢活性检测法 细胞染色法
台盼蓝拒染实验
脾细胞计数为例 10倍稀释脾细胞悬液 取脾细胞悬液 20 uL+PBS 80 uL，混匀（5X稀释） 5X脾细胞悬液 20 uL+ 0.4%-0.04% 台盼蓝溶液 20 uL 计数板计数脾细胞
Hemacytometer
每0.1mm3体积平均细胞数=四
个小方格中细胞总数÷ 4
每毫升细胞总数=每0.1mm3体 积平均细胞数×104 一个小鼠脾脏单个核细胞数=每 毫升细胞总数x 稀释倍数x 细胞
Corner square
悬液体积
生存率(%)=(1个小方格中活细 胞总数÷ 1个小方格中细胞总 数) ×100
该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模 的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试 验等。
ConA刺激T细胞增殖
淋巴细胞在体内外接受ConA刺激后，静止淋巴细胞向 母细胞转化。这种转化的细胞DNA合成增加，细胞体积增 大，胞质增多以及出现有丝分裂等形态变化。
刺激后
Day 0:
3H-Tdr掺入法：敏感但有放射性污染
BrdU掺入法： BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争掺入S
期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶
G0/G1 G2/M S
DNA含量 2倍体 4倍体 DNA复制完成 两者之间
S期细胞DNA合成检测法
3H-Tdr掺入法
同位素检测，敏感但有放射性污染 BrdU掺入法 BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物替代胸腺嘧啶，通 过ELISA和流式细胞术检测竞争掺入单链DNA核苷酸序列
细胞染色法
利用荧光染色可穿透细胞膜的特性染色细胞，当细胞分裂
时，荧光标记物被平均分配到两个子代细胞中，其荧光强 度是亲代细胞的一半，如CFSE染色细胞
C3He anti-u 10
细胞代谢活性检测法
通过活细胞线粒体脱氢酶具有转化四氮唑盐等物质的能力
进而反映细胞活力的方法，如 MTT 法检测细胞内线粒体活 性实验
普通蛋白质抗原
比较超抗原和普通抗原与MHC及TCR的作用模式
通过与MHC-II类分子的抗原结合槽以外的非多态区（APC)和TCRVCDR3外侧区域(T 细胞）结合，激活2%-20% 的T克隆。
T细胞超抗原（super antigen, SAg）
作用特点： 强激活T细胞作用（低浓度（1-10ng/ml）、多克隆（2%20% ））；不需常规的细胞内抗原提呈；不受MHC限制 普通蛋白质抗原可激活总T细胞库1/104——1/106 效应： 大量细胞因子，病理生理过程的发生发展 （similar to septic shock）
美洲商陆 激活人和小鼠T和B细胞 G-菌 测定小鼠B细胞 检测人B细胞
葡萄球菌蛋白A（SPA）G+菌
高浓度时，经丝裂原受体与B细胞结合，多克隆诱导B细胞 增殖和分化； 低浓度时， BCR特异性识别TI-1抗原的B细胞能竞争结合到 足够抗原量被激活； 感染初期（在TD-Ag免疫应答启动前）快速产生特异性抗体
CCK8（Cell Counting Kit-8）检测细胞增殖
CCK-8试剂中含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐（WST–8），它在电子耦合剂1-甲 氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细 胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物 （Formazan）。 生成的甲臜量与活细胞的数量成正比。OD450可 间接反映活细胞数量。
常见的T细胞超抗原
外源性 细菌毒素性产物：金黄色葡萄球菌肠毒素AE（SEA SEE）、A族链球菌M蛋白、致热外毒素、关节支原体丝裂 原MAM 内源性 小鼠乳腺肿瘤病毒蛋白MMTV 次要淋巴细胞刺激抗原（mls）
常用有丝分裂原-激活某一类淋巴细胞的全部克隆
丝裂原名称 刀豆蛋白A（ConA） 植物血凝素（PHA） 美洲商陆丝裂原 （PWM） 脂多糖（LPS） 来源 刀豆 云豆 特征 活化人和小鼠T细胞 活化人和小鼠T细胞
淋巴细胞增殖
静止淋巴细胞受一定物质刺激后向淋巴母细胞转化， 细胞内蛋白质和核酸合成，细胞代谢旺盛，伴有数量和 形态学改变，如细胞变大、胞浆增多并形成空泡、核仁
明显、染色质疏松
淋巴细胞增殖实验就是根据上述细胞的改变，设计的 相应检测方法，又称为淋巴细胞转化实验（lymphocyte transformation test, LTT）
DNA合成检测法
DNA复制完成、 蛋白合成， 为有丝分裂 作准备
RNA转录、蛋 白合成为DNA 复制做准备
DNA合成期 增殖期的细胞需要大量核苷酸
DNA合成检测法
利用在细胞培养过程中掺入放射性（如 3H-Tdr 掺入法）或
非放射性的核苷类似物（如 Brdu 掺入实验），直接检测 DNA合成水平变化
医学免疫学实验
实验六 淋巴细胞功能检测
—T淋巴细胞增殖活化
体内外激活T/B细胞增殖的物质
一些物质能够特异性或非特异性地诱导淋巴细胞发生活化，
导致细胞因子的分泌、细胞因子受体的表达并最终使活化 的淋巴细胞发生增殖和分化
体内外激活T/B细胞增殖的物质
非特异性免疫刺激剂
如超抗原、丝裂原、抗体类如抗CD3抗体、促细胞生长因子 如IL-2 特异性抗原
的BrdU水平
பைடு நூலகம்
LPS 2D 3D 12.05
0.65 Medium
5.77
BrdU 7AAD Flow cytometric analysis of DNA content (propidium iodide) and DNA synthesis (BrdU) after two or three days of stimulation
刺激淋巴细胞增殖
Day 3:
CCk8检测细胞增殖
将细胞浓度分别调节为 2x106 /mL和4x106 /mL，加入96 孔板，每孔90μL，加入25μg/mL或50μ g/mL ConA溶液10 μL ，细胞培养箱（37℃，5%CO2)中孵育72h。培养期间可 观察细胞增殖情况。