Lu 淋巴细胞体外增殖功能检测
淋巴细胞增殖试验名词解释
淋巴细胞增殖试验名词解释
淋巴细胞增殖试验（Lymphocyte Proliferation Assay，LPA）是一种常用的实验技术，用于评估淋巴细胞的功能性活性和增殖能力。
该试验通过检测淋巴细胞在刺激物作用下的细胞增殖情况，可以帮助科学家们了解免疫系统的应答能力。
在淋巴细胞增殖试验中，科学家们通常从血液样本或其他组织中分离出淋巴细胞，然后将其与刺激物（如抗原、药物或其他生物活性物质）一起培养。
刺激物的作用可以模拟真实免疫应答的情况，引发淋巴细胞的增殖反应。
这种反应通常伴随着细胞的分裂和增殖，可以通过测量细胞数量、增殖指标或标记物的产生来评估。
淋巴细胞增殖试验可以帮助科学家们识别特定刺激物对免疫系统的影响。
例如，在药物研发领域，科学家们可以使用该试验来评估新药物对免疫细胞的影响，了解其对免疫应答的调节作用。
在免疫疾病的研究中，淋巴细胞增殖试验可以帮助科学家们评估免疫系统异常或失调的程度，从而指导临床治疗。
此外，淋巴细胞增殖试验还可以用于研究免疫细胞的功能性特征。
通过测量细胞增殖和分裂指标，科学家们可以评估不同刺激物对细胞的激活程度、增殖速率以及细胞亚群的响应差异。
总之，淋巴细胞增殖试验是一种重要的实验技术，广泛应用于免疫学研究和临床实践中。
它通过测量淋巴细胞的增殖反应，可以评估免疫细胞的活性和功能特征，
为疾病诊断和治疗提供重要的参考。
体外刺激淋巴细胞增殖作用检测
体外刺激淋巴细胞增殖试验1 样品配制精确称取样品于灭过菌的eppendorf管中，用无菌的PBS配制成浓度5mg/mL 的样品液。
充分溶解然后以15000g离心30min，无菌条件下将上清转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成所需浓度待用。
2 小鼠淋巴细胞的制备选取8-10周龄，体重22±1g的Balb c或C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，取脾脏，用PBS冲洗3~4次。
将脾脏磨碎后过100目筛，过筛后的混悬液以400g/min 离心6min。
吸去上清液，沉淀中按每只小鼠1.5mL的量加入氯化铵红细胞裂解液，反复冲打，静置10min后，加PBS至50mL，然后以400g/min离心6min，吸去上清液，加PBS缓冲液冲洗并离心2遍后，吸去上清，加入RPMI1640培养基（含双抗及10％胎牛血清）混匀，用细胞计数仪计数并稀释成2×106个/mL细胞液备用。
3 细胞培养将2×106个/mL淋巴细胞悬浮液加至96孔板中，每孔加180μL，同时加入20μL样品液，以20μL PBS和20μL 60μg/mL的PHA溶液分别作阴、阳性对照。
于37℃、含5%的CO条件下培养3d，加入相应试剂测定24 淋巴细胞增殖率的测定4.1 Alamarblue试剂测定法在上述细胞培养的96孔板中，每孔分别加入20μL Alamar Blue试剂，再培养，加Alamar Blue试剂前及变色后分别用ELISA自动读板仪测定570nm和600nm处的吸光度，然后根据Alamar Blue试剂的公式计算各种样品对淋巴细胞增殖率。
计算公式为：增殖率(%)=[117216×Aλ570(sample)-80586×Aλ600(sample)]/[117216×Aλ570(control)-80586×Aλ600(control)]×100%4.2 MTT法测定4.2.1 MTT 溶液的配制方法称取MTT 0.5g溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）中，用0.22μm滤膜过滤分装，－20℃避光保存。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告细胞增殖实验是研究肿瘤细胞增殖和药物筛选的重要手段。
目前常见的肿瘤细胞增殖实验包括MTT法、SRB法、CCK-8法和细胞计数法。
本综述将介绍常用的MTT法和SRB法。
一、MTT法MTT法是一种常用的检测细胞增殖和细胞存活率的方法。
其原理是MTT剂通过被细胞还原，形成紫色沉淀，而细胞活性越强，则代谢产物越多，MTT的还原能力也越强，所以其颜色越深。
MTT法的步骤如下：1. 细胞接种：将待检测的细胞分离并接种到96孔板中，对照组和实验组各重复3次，每孔加入100 μl的细胞悬液。
2. 细胞培养：将孔板置于37℃、5% CO2培养箱中，培养24h，待细胞贴附后进入下一步。
3. 加入MTT：将MTT溶液加入孔板中，加入的量为100 μl/孔，最终浓度为0.5mg/ml。
4. 离心：孔板离心5min，去除上清，加入150 μl的DMSO，进行溶解。
5. 检测：将各孔450 nm波长下吸光度值读取，数据处理和结果分析。
MTT法适用于多种肿瘤细胞，操作简便，可用于初筛药物的活性。
然而，MTT法也存在局限性，如MTT还原能力受到某些实验条件影响，如细胞密度、孵育时间、细胞凋亡等，需要注意标准化操作。
二、SRB法SRB法是酸性快速比色法的缩写，它通过酸性溶液中蛋白质的沉淀和染色，反映了细胞的增殖情况。
该方法操作简单，速度快，结果信度较高。
步骤如下：3. 加入SRB：将SRB溶液加入各孔中，保持10 min。
4. 洗涤：将各孔反复洗涤至清晰。
6. 检测：将各孔570 nm波长下吸光度值读取，数据处理和结果分析。
SRB法比较适用于肿瘤细胞形态大而扁平的情况。
此外，SRB法还能够评价细胞的耐药性，并可用于筛选化合物对细胞增殖的抑制率，是一种较为全面的细胞增殖试验方法。
三、结论以上两种实验方法在检测肿瘤细胞增殖及药物筛选中具有重要的应用价值。
在操作上，需要严格地控制实验条件，确保数据的准确性和可靠性。
细胞增殖活力检测的原理
细胞增殖活力检测的原理细胞增殖活力检测是一种常用的方法，用于评估细胞的生长和繁殖能力。
这种检测方法可以通过定量测量细胞数量、代谢活性或DNA合成来评估细胞增殖的程度。
细胞增殖活力检测的原理涉及多种方法和技术，以下将介绍其中几种常用的原理。
1. 细胞数量测定：这是最常见的一种细胞增殖活力检测方法。
通常使用荧光显微镜或细胞计数仪来直接计数细胞数量。
具体步骤包括将培养皿中的细胞进行洗涤和染色，然后使用显微镜或细胞计数仪进行计数。
这种方法不仅简单方便，而且能够定量评估细胞增殖情况。
2. ATP检测：ATP是细胞内重要的能量分子，以细胞数量为基础，通过检测ATP的含量来评估细胞增殖活力。
这种方法利用荧光或化学反应测定ATP的含量，进而推测细胞增殖状况。
由于ATP的含量与细胞的代谢活性密切相关，因此可以通过ATP 的测量来评估细胞增殖活力。
3. MTT法：MTT（3-(4,5-二甲基-2-噻唑唑基)-2,5-二苯基-2H-三唑-酮）是一种常用的细胞增殖活性染色剂，主要基于细胞色素P450的还原作用。
MTT可以通过还原为可溶性产物能反映细胞增殖活性。
具体操作步骤是将MTT加入含有试验组和对照组的培养皿中，经过一段时间后，MTT会转化为紫色的晶体形式，然后通过溶解晶体来定量测定MTT的相对含量，进而评估细胞的增殖活力。
4. 荧光素酶法：荧光素酶（Luciferase）是一种广泛应用于生物发光检测的方法。
当细胞中含有Luciferase酶的基因时，可以通过加入荧光素底物来检测荧光素酶的活性。
这种方法能够定量评估细胞的代谢活性，进而评估细胞增殖活力。
5. DNA合成测定：DNA是细胞的遗传物质，细胞增殖的过程中DNA会合成。
通过测定DNA合成的程度，可以评估细胞的增殖活力。
常用的DNA合成测定方法包括放射性同位素标记法和二硫苯酚法。
放射性同位素标记法通过标记细胞的DNA，然后测量标记DNA的数量来评估细胞增殖活性。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告5篇
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告5篇篇1一、引言肿瘤细胞增殖实验是研究肿瘤发生、发展及其相关机制的重要手段。
随着科技的进步，体外检测肿瘤细胞增殖的方法逐渐成为研究热点。
本文将对体外检测肿瘤细胞增殖的实验方法、应用及优缺点进行综述，为相关研究者提供参考。
二、实验方法1. 细胞培养细胞培养是体外检测肿瘤细胞增殖的基础。
研究者需根据实验需求选择合适的细胞系，并掌握细胞培养的基本技术，如细胞的复苏、传代、冻存等。
2. 实验试剂与仪器在进行肿瘤细胞增殖实验时，需要使用一系列的试剂和仪器，如细胞计数试剂、酶标仪、显微镜等。
这些试剂和仪器的选择对实验结果的准确性至关重要。
三、实验技术1. MTT法MTT法是一种常用的检测细胞增殖的方法，其原理是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原MTT，生成蓝色结晶物并沉积在细胞中，从而反映细胞的增殖情况。
该方法具有操作简便、快速、准确等优点，在肿瘤细胞增殖实验中得到了广泛应用。
2. BrdU法BrdU法是通过检测细胞内BrdU的掺入量来反映细胞的增殖活性。
该方法需要预先在培养基中加入BrdU，然后通过特异性抗体检测BrdU的掺入量。
BrdU法具有较高的灵敏度和特异性，能够更准确地反映细胞的增殖情况。
3. 流式细胞术流式细胞术是一种能够同时检测单个细胞多个参数的技术，可以用于分析细胞的周期、凋亡、增殖等情况。
在肿瘤细胞增殖实验中，流式细胞术可以用于检测细胞的DNA含量、BrdU掺入量等指标，从而更全面地了解细胞的增殖情况。
四、应用及优缺点1. 药物筛选与评价体外检测肿瘤细胞增殖实验可以用于药物的筛选与评价。
通过检测药物对肿瘤细胞增殖的抑制作用，可以评估药物的抗肿瘤活性，为药物的进一步研究和开发提供依据。
2. 肿瘤病理学研究体外检测肿瘤细胞增殖实验还可以用于肿瘤病理学研究。
通过分析肿瘤细胞的增殖特性，可以了解肿瘤的发生、发展及其相关机制，为肿瘤的诊断和治疗提供理论依据。
3. 个体化治疗与预后判断体外检测肿瘤细胞增殖实验在个体化治疗和预后判断中也具有重要价值。
小鼠淋巴细胞增殖测定步骤
小鼠淋巴细胞增殖测定步骤
小鼠淋巴细胞增殖测定是用来评估免疫功能和细胞毒性的常用方法。
以下是一般的小鼠淋巴细胞增殖测定的步骤：
1. 准备小鼠：选择合适的小鼠品系和年龄，并确保小鼠健康。
2. 分离淋巴细胞：采集小鼠淋巴组织（例如脾脏或淋巴结）并进行细胞分离。
常用的方法包括机械破碎和离心分离。
3. 细胞计数与稀释：用血细胞计数器或显微镜计数细胞数目，并进行适当的稀释以获得合适的细胞密度。
4. 细胞悬液制备：将分离的淋巴细胞与培养基混合，使细胞悬浮于培养基中。
5. 细胞培养：将细胞悬液移至培养皿中，并在37°C、5% CO2
的条件下培养一段时间。
一般培养24-72小时。
6. 刺激因子处理：在培养皿中添加适当的刺激因子（如细胞激动剂或抗原），以刺激细胞增殖。
7. 溶菌酶处理：在培养结束后，加入溶菌酶等溶解剂，使未被细胞内的放射性同位素取代的DNA释放到培养基中。
8. 获得DNA：收集并离心细胞上清液，将其中的DNA沉淀。
9. 放射性测定：使用放射性技术，如液体闪烁计数器，测量
DNA中的放射性同位素含量。
10. 统计分析：根据放射性同位素的计数，计算细胞增殖水平，并进行统计分析。
这些步骤可以根据具体实验目的和方法的需求进行适当的调整和修改。
淋巴细胞增殖实验报告
淋巴细胞增殖实验报告一、实验目的本实验旨在通过体外培养淋巴细胞，观察不同刺激条件下淋巴细胞增殖的情况，探讨淋巴细胞增殖与免疫应答的关系，为进一步研究免疫调节机制提供实验依据。
二、实验材料1. 实验动物：昆明种小鼠，体重20-25g，雌雄不限。
2. 试剂：RPMI-1640培养基、胎牛血清、淋巴细胞分离液、植物血凝素（PHA）、刀豆素A（ConA）、胰蛋白酶、二甲基亚砜（DMSO）、ELISA试剂盒等。
3. 仪器：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪、流式细胞仪等。
三、实验方法1. 淋巴细胞分离：取小鼠颈椎脱臼处死，无菌操作下取出脾脏，加入胰蛋白酶消化，离心洗涤，再用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。
2. 淋巴细胞培养：将分离得到的淋巴细胞用RPMI-1640培养基重悬，调整细胞密度为1×10^6个/mL，加入PHA或ConA作为刺激剂，分别设置无刺激组、PHA刺激组、ConA刺激组等。
3. 细胞增殖观察：将培养的淋巴细胞置于CO2培养箱中培养，分别在24h、48h、72h、96h和120h取样，用倒置显微镜观察细胞形态变化，并计算细胞数量。
4. ELISA检测：取培养上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测细胞因子（如IL-2、IFN-γ等）含量。
5. 流式细胞术检测：取培养的淋巴细胞，用荧光标记的抗体检测T细胞亚群（如CD4+、CD8+等）和细胞周期分布。
四、实验结果1. 细胞形态观察：随着培养时间的延长，淋巴细胞在PHA或ConA刺激下逐渐转变为淋巴母细胞，细胞体积增大，核仁明显，细胞浆内出现空泡。
2. 细胞增殖：在PHA或ConA刺激下，淋巴细胞数量显著增加，且呈时间依赖性。
3. 细胞因子检测：ELISA结果显示，在PHA或ConA刺激下，培养上清液中IL-2、IFN-γ等细胞因子含量显著升高。
4. 流式细胞术检测：流式细胞术结果显示，在PHA或ConA刺激下，T细胞亚群CD4+和CD8+的比例发生改变，且细胞周期分布发生变化。
淋巴细胞增殖抑制标准
淋巴细胞增殖抑制检测标准操作规程
签名/日期
1 目的
建立淋巴细胞增殖抑制检测标准操作规程，确保检验操作标准化、规范化。
2 适用范围
适用于淋巴细胞的检查
3 术语或定义
3.1 淋巴细胞（lymphocyte）：是白细胞的一种，是体积最小的白细胞。
其由淋巴器官产生，主要存在于
淋巴管中循环的淋巴液中，是机体免疫应答功能的重要细胞成分。
3.2 CCK-8试剂盒（Cell Counting Kit-8）：是一种基于WST-8而广泛应用于细胞活性和细胞毒性检测的
快速、高灵敏度试剂盒。
3.3 酶标仪：即酶联免疫检测仪。
是酶联免疫吸附试验的专用仪器又称微孔板检测器。
可简单地分为半自
动和全自动两大类，其核心是一个比色计,即用比色法来进行分析。
4 责任
4.1 负责淋巴细胞的检验、结果的复核、记录的填写。
4.2 合性和记录的审核。
5 环境健康安全
N/A
6 程序
7 附件
《淋巴细胞增殖抑制检测记录》8 参考或引用文件[1]
1．中华人民共和国药典20202版第三部
2. 中检院方法
3. Qiu P C, Lu Y Y, Zhang S, et al. Reduction of SCUBE3 by a new marine-derived asterosaponin leads to arrest of glioma cells in G1/S[J]. Oncogenesis, 2020, 9(8): 71.
9 文件版本修改历史。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告肿瘤细胞增殖实验是一种体外检测肿瘤细胞活力和增殖能力的方法。
该实验可以在不同的细胞类型中应用，并通过不同的技术来评估细胞的增殖情况。
本文将重点介绍常用的体外细胞增殖实验技术及其应用。
1. MTT法MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基三唑）法是一种衡量细胞活力和增殖能力的颜色法。
它主要是将MTT添加到培养细胞中，MTT会被细胞内活的脱氢酶还原为形成深紫色的质子化形式。
质子化的MTT这反应物可以被去电子的溶液还原为不带电的呈暗蓝色的可溶性盐。
测量细胞产生的暗蓝色的MTT总量就可以对细胞增殖情况进行评估。
使用MTT法需要注意的是，细胞形态的变化或者特殊的氧气浓度可能会使得MTT试剂的反应受到干扰。
2. 体外存活性检测这种方法的原理是通过染料或染料释放物质的特性，来测量细胞存活能力的变化。
细胞可以与含有细胞生长荧光素的乙酸（CFDA-SE）结合，在细胞膜上生成荧光分子，通过检测荧光变化来判断细胞的存活情况。
还有其他一些检测方法，如药物释放特定的染料等。
3. 流式细胞术流式细胞术（FACS）用于精确测量细胞增殖和存活情况，可以对单个细胞进行非常细节的分析。
实验方法是使用荧光素然后染色细胞，评估后使它们单个被检测通过流式细胞术检测器。
流式细胞术常常用来区别增殖的存活的细胞群组和不增殖的细胞群组。
4. 其他方法还有一些其他方法也被用于肿瘤细胞增殖的体外检测。
例如线粒体功能和多项式体积测定。
线粒体是细胞内负责细胞氧化作用的主要组织，而多极小流动细胞术可以精确测量细胞的体积并捕获细胞的运动轨迹。
总之，肿瘤细胞增殖实验在研究癌症生物学及药物筛选方面是一个重要的体外分析工具。
无论是MTT法、流式细胞术或其他实验方法，都具有高效、快捷、高通量、可重复等优点，为癌症治疗和肿瘤生物学的研究提供了重要的帮助。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告肿瘤细胞增殖实验是当前癌症研究中的重要内容之一。
通过体外检测肿瘤细胞的增殖情况，可以评估肿瘤的生长速度、细胞增殖能力以及对药物治疗的敏感性等，为研究肿瘤的发生机制和药物疗效提供重要依据。
本综述报告将对目前常见的体外检测肿瘤细胞增殖的实验方法进行总结和评述。
一、MTT试验MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）试验是一种常用的体外细胞增殖检测方法。
MTT试验基于细胞对某种化合物还原能力的检测，该化合物在活细胞中通过线粒体膜将其还原为具有蓝色沉淀的可溶性紫色盐类。
通过溶解形成的盐类，可以由酒精等溶剂溶解并用分光光度计测定其吸光度，从而反映细胞的活力和增殖情况。
二、CCK-8试验CCK-8试验是一种测量细胞代谢活性的方法。
CCK-8试剂在细胞内通过线粒体酶的作用可被还原为橙黄色溶液，其吸光度与细胞数量成正比。
在CCK-8试验中，将该试剂加入细胞培养液中，经过一定时间后，通过酶促反应的作用反映细胞代谢活性和增殖程度。
三、细胞计数法细胞计数法是一种直接检测细胞数量的方法。
在该实验中，通过显微镜观察和人工计数的方式，统计细胞的数量，从而得出增殖情况。
该方法简单直观，但在大规模实验中耗时且易发生误差。
四、Clonogenic Assay试验Clonogenic Assay试验是一种经典的体外细胞增殖检测方法。
该方法通过将单个细胞在富含营养的培养基中培养，并观察和计数其形成的克隆，从而评价细胞的增殖能力。
Clonogenic Assay试验对于评估细胞的增殖潜能和肿瘤干细胞的存在及活性具有重要意义。
五、APTT试验APTT（activated partial thromboplastin time）试验是一种常用的血液凝血功能检测方法，在某些肿瘤细胞增殖实验中也被应用。
肿瘤细胞的增殖状态与凝血功能存在一定关系，通过APTT试验可以间接反映肿瘤细胞的增殖情况。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告肿瘤细胞增殖实验是一种常用的体外研究肿瘤细胞生长和增殖的方法。
通过该实验，可以评估不同因素对肿瘤细胞增殖的影响，发现潜在的抑制因子或促进因子，并进一步研究其作用机制。
本文将综述体外检测肿瘤细胞增殖实验的原理、方法和应用。
一、实验原理：肿瘤细胞增殖实验主要基于细胞生长曲线和增殖指标的测定。
细胞生长曲线反映了一定时间范围内细胞数量的动态变化，通过测定不同时间点的细胞数量，可以获得细胞生长曲线。
增殖指标一般包括细胞增殖率、细胞周期和细胞凋亡率等，通过测定这些指标，可以客观评估细胞增殖状态。
二、实验方法：1. 细胞培养：选取合适的培养基和补充物，将肿瘤细胞以一定的密度接种于培养皿中，并在恒温恒湿的培养箱中培养。
2. 细胞数量测定：采用细胞计数器、细胞色素染色或荧光标记等方法，测定不同时间点的细胞数量。
3. 细胞增殖率测定：根据细胞生长曲线计算细胞增殖速率或细胞倍增时间，评估细胞增殖能力。
4. 细胞周期检测：采用细胞凋亡检测、流式细胞术或细胞核染色等方法，测定不同细胞周期阶段的细胞比例，评估细胞周期变化。
5. 细胞凋亡率测定：采用细胞凋亡检测试剂盒、DNA断裂检测或细胞膜渗透性染料等方法，测定细胞凋亡率。
三、实验应用：1. 药物筛选：通过实验评估药物对肿瘤细胞增殖的影响，筛选具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。
2. 基因功能研究：通过实验评估基因过表达或沉默对肿瘤细胞增殖的影响，研究基因在肿瘤细胞生长和增殖过程中的作用机制。
3. 细胞相互作用研究：通过实验模拟肿瘤微环境，评估细胞因子、细胞外基质和间质细胞等对肿瘤细胞增殖的影响，研究肿瘤微环境对肿瘤生长的调控机制。
4. 其他应用：体外检测肿瘤细胞增殖实验还可用于研究肿瘤细胞迁移、侵袭和转移等特性，以及评估抗肿瘤药物的效果。
体外检测肿瘤细胞增殖实验是一种有效的研究肿瘤生长和增殖的方法，可用于药物筛选、基因功能研究和肿瘤微环境调控机制的研究等领域。
淋巴细胞增殖影响实验具体步骤及实验方法
药物对动物体内淋巴细胞增殖影响实验具体步骤及实验方法1. TIL的分离及培养（1）取荷瘤小鼠20只，处死后无菌条件下切除皮下瘤块，置于RPMI 1640培养液中，剔除坏死的肿瘤组织及表面结缔组织，剪碎过细胞筛收集单细胞悬液。
（2）将等体积的比重1.088及1.075淋巴细胞分离液及细胞悬液先后分别置于离心管中进行不连续密度梯度离心，经1800 r/min 离心20 min 后，1.075界面上为富含肿瘤细胞悬液，1.088与1.075之间界面为富含TIL悬液。
（3）收集TIL，用含10%小牛血清，IL-2100 u/ml RPMI1640培养液稀释调整细胞浓度成5×105/ml进行培养，分两组。
（4）一组每5天加入冷冻瘤苗，浓度为效应细胞/肿瘤细胞（E/T）=50/1，另一组不加冷冻瘤苗进行常规培养。
（5）培养条件为37℃，5%CO2，每5天计数1次，维持细胞浓度5×105/ml。
2. 冷冻瘤苗的制备（1）取肿瘤细胞悬液，用RPMI 1640培养液稀释成1×105/ml 装于冻存管中（2）用液氮速冻慢融3个冻融周期，置于-20℃冰箱中贮存，备用。
3. 荷瘤小鼠模型的制备（1）抽取腹水型Hepa种鼠腹水，用生理盐水稀释至肿瘤细胞1×106/ml，于小鼠右侧腋窝皮下接种0.2 ml。
（2）1周后肿瘤长至直径约0.5 cm 左右即制成小鼠荷瘤模型供检测TIL抗肿瘤作用。
（3）待肿瘤生长至直径1~2 cm 时供分离TIL使用。
4. 培养后TIL的抗肿瘤作用分3组，每组20只小鼠。
对照组瘤体内注射生理盐水0.2 ml；实验1组，瘤体内注射常规培养TIL1×106个；实验2组，瘤体内注射加入冷冻瘤苗培养TIL1×106个。
隔3天注射1次，共6次。
5. 病理检查处死小鼠，测量肿瘤大小，结果用垂直方向直径平均值表示。
肿瘤组织送病理检查，常规HE染色。
淋巴细胞浸润程度根据Anneroth等的标准分为4级。
检测淋巴细胞功能、T淋巴细胞增殖实验设计
③细胞培养至56h，每孔内加入3H-TdR工作液 各20 μl，轻轻震荡混匀后置37°c CO ₂培养箱内 继续培养至72h终止培养
④终止培养时，用多头细胞收集器将细胞收 集在49型玻璃纤维滤膜上，将滤膜置烤箱内烤干
⑤滤膜冷却后移入存有5ml闪烁液的闪烁杯中， 避光放置一段时间后，用FJ-2107液闪计算器测量 放射性，结果用刺激指数（SI）表示
实验步骤：
①静脉采血肝素抗凝，充分摇匀后加入 细胞微量培养板内（20 μl/孔）每个样品设自 发转化孔和分裂原刺激孔均为三个复孔
②自发转化孔每孔内加完全RPMI-1640液 0.2ml，分裂原刺激孔每孔内加PHA液0.1ml， RPMI-1640液0.1ml。加样后，轻轻震荡混匀， 置37°c CO ₂培养箱内培养
管、玻片等常规实验仪器。 三、PHA、瑞氏姬姆萨染液，肝素，Hanks液
等常规实验试剂。
1、T淋巴细胞功能的测定（T细胞转化、增 殖实验、迟发性超敏反应的检测、T细胞分 泌细胞因子的检测、CTL细胞介导的细胞毒 试验）
2、B淋巴细胞功能的测定 3、单核巨噬细胞、NK细胞等的功能测定 4、细胞因子的检测 5、CD分子、表面受体、黏附分子的检测
问题背景：
市场上有一广告产品， 据说有免疫增强作用请设 计一个方案证实之。（从 影响淋巴细胞功能、T淋巴 细胞增殖的角度考虑。）
T淋巴细胞受到特异性抗原或非特异性抗原 （PHA、PWM和ConA）刺激均能使细胞发生转 化。T淋巴细胞转化率的高低可反映人体细胞免 疫功能水平，常被作为细胞免疫功能指标之一。
酶联免疫斑点试验（ELISPOT）
① 稳定、特异，且抗原用量少； ②可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量检测 ③可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞
医学免疫学实验六 淋巴细胞功能检测
性较差
同位素渗入法
根据淋巴细胞转化程度与DNA合成增加呈明显正相关 ，此时若加入用同位素标记的DNA前体物质胸腺嘧啶 核苷（3H-TdR），即可被转化的淋巴细胞摄取而渗入 到DNA分子中。培养结束，通过检测β射线来测定渗入 淋巴细胞内3H-TdR的量，能客观精确分析淋巴细胞的 转化程度。
。 ✓ CCK8细胞毒性非常低，因此加入CCK8显色后，可以在不同时间反
复用酶标仪读数从而找到最佳测定时间。 ✓ 如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜
培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培 养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更 换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
淋巴细胞在体内外接受有丝分裂原刺激后，静止淋 巴细胞向母细胞转化。这种转化的细胞DNA合成增 加，细胞体积增大，胞质增多以及出现有丝分裂等 形态变化。
淋巴细胞体外检测方法---形态检测法
主要根据淋巴细胞在转化为淋巴母细胞的过 程中，细胞形态结构发生明显改变，经染色 镜检即可计算出淋巴细胞的转化率。
淋巴细胞功能检测
实验目的
掌握免疫细胞基本培养方法 掌握一到两种淋巴细胞功能检测技术 了解淋巴细胞体外检测的原理
基本概念
T细胞在体外培养时，如受到一定物质刺激 ，可出现体积增大转化为母细胞、代谢旺盛 、蛋白质和核酸合成增加等细胞转化现象， 所以通过淋巴细胞体外增殖反应实验，可了 解T细胞功能
CCK8（Cell Counting Kit-8）检测 细胞增殖
CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中,不需要预配各种成 分。CCK-8法是用于测定细胞增殖或细胞毒性试验中活细 胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。WST-8 法检测细胞增殖、细胞毒性实验的灵敏度比其它四唑盐如 MTT, XTT, MTS或WST-1高。由于CCK-8溶液相当稳定 ，并且对细胞没有毒性，因此可以长时间孵育。
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
体外检测肿瘤细胞增殖实验综述报告
肿瘤细胞增殖是肿瘤发展过程中的重要特征，对于研究肿瘤的生物学特性以及寻找抑制肿瘤细胞增殖的治疗方法具有重要意义。
体外检测肿瘤细胞增殖的实验方法有多种，本文对其中的几种常见方法进行综述和分析。
一、MTT法
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)法是一种常用的测定细胞活力和细胞增殖的方法。
该方法通过将MTT重链亚甲蓝溶液添加到培养皿中，MTT会被活细胞内还原为紫色的甲蓝晶体。
晶体可被有机溶剂溶解，测定溶液的吸光度即可得到细胞的增殖情况。
二、细胞计数
细胞计数是一种直接测量细胞数目的方法，可以通过显微镜计数室或细胞计数仪来进行。
方法简单、直观，但由于需要高倍显微镜观察和手工计数，准确性较差，且操作繁琐。
三、焦磷酸酶检测
焦磷酸酶检测通过检测细胞中的磷酸化焦磷酸酶来间接估计细胞增殖情况。
细胞中的焦磷酸酶水平与细胞增殖密切相关，因此可以作为评价细胞增殖的指标。
四、流式细胞术
流式细胞术是一种高通量、高灵敏度的细胞分析技术，可以测定细胞免疫表型、细胞周期以及检测细胞增殖。
通过细胞标记物（如细胞融合素、DNA染料等）与流式仪相结合，可以对细胞增殖情况进行定量分析。
选择合适的体外检测肿瘤细胞增殖的方法需要综合考虑实验的目的、所需灵敏度、成本以及实验室的设备和技术水平。
不同的方法可以互补使用，以提高结果的准确性和可靠性。
未来，随着技术的不断进步和发展，体外检测肿瘤细胞增殖的方法将会更加完善、快速和准确。
淋巴实验增殖实验报告
通过本实验，了解淋巴细胞增殖的基本原理和实验方法，掌握淋巴细胞增殖实验的操作技能，并学会分析实验结果，以期为免疫学研究和临床诊断提供理论依据。
二、实验原理淋巴细胞增殖是机体免疫系统在受到抗原刺激后，通过细胞分裂和增殖产生大量效应细胞的过程。
本实验采用丝裂原诱导法，以植物血凝素（PHA）为诱导剂，刺激外周血单个核细胞（PBMC）进行增殖，观察细胞增殖过程中细胞形态和数量的变化。
三、实验材料1. 实验动物：健康小鼠，体重18-22g。
2. 试剂：植物血凝素（PHA）、RPMI-10完全培养基、胎牛血清、二甲基亚砜（DMSO）、台盼蓝染液等。
3. 仪器：细胞培养箱、酶标仪、倒置显微镜、细胞计数板等。
4. 器材：细胞培养皿、移液器、离心机、吸管等。
四、实验方法1. 细胞制备：取小鼠外周血，加入抗凝剂，分离PBMC，用RPMI-10完全培养基洗涤、离心，弃上清，用RPMI-10完全培养基重悬细胞。
2. 细胞培养：将PBMC以1×10^6细胞/孔的密度接种于96孔板，每孔加入100μg/ml的PHA，设阴性对照孔（不加PHA）和阳性对照孔（加入PHA），置细胞培养箱中培养48小时。
3. 细胞计数：用细胞计数板对培养48小时的细胞进行计数，计算细胞增殖倍数。
4. 细胞形态观察：用倒置显微镜观察细胞形态变化，记录细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等特征。
五、实验结果1. 细胞计数结果：与阴性对照孔相比，PHA诱导孔的细胞数量显著增加，细胞增殖倍数约为2倍。
2. 细胞形态观察结果：PHA诱导孔的细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松，符合淋巴细胞转化的特征。
本实验结果表明，PHA能够有效诱导PBMC增殖，细胞增殖倍数约为2倍。
这与文献报道相符，表明淋巴细胞在体外培养条件下，能够对PHA产生增殖反应。
本实验中，细胞形态观察结果显示，PHA诱导孔的细胞形态发生明显变化，符合淋巴细胞转化的特征。
淋巴细胞增殖功能的测定
淋巴细胞增殖功能的测定淋巴细胞增殖和分化是机体免疫应答过程的一个重要阶段。
因此，检测淋巴细胞增殖水平是细胞免疫研究和临床免疫功能检测的一种常用方法。
(一)原理T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体，在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。
植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA),抗CD２、抗CD３McAb 作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖；而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体(SAC)、脂多糖(LPS，对小鼠有作用)则刺激B细胞发生增殖；美洲商陆(PWM)、肿瘤刺激剂PMA对T、B细胞的增殖均有刺激作用。
最近发现,integrin家族中VLA组中某些受体与相应配体结合后也能活化T细胞。
目前临床上最常选用PHA刺激PBMC, 根据形态学或氚标记胸腺嘧啶核苷(３H-TdR)掺入率测定T细胞的增殖水平。
(二)操作步骤无菌从肝素抗凝血中分离外周血单个核细胞(PBMC)洗涤后用10％FCS RPMI1640调整细胞数为1～2×10６／ml↓加入96孔培养板中，1～2×10５细胞／100μl／孔，每组设3孔。
加入最适剂量PHA，100μl／孔，同时设不加PHA阴性对照。
如观察细胞因子(如IL-2)或其它刺激物(PMA)对增殖功能的调节作用，则根据加入因子的浓度而确定加入量，一般每孔最终体积为200μl↓37℃、5％CO２孵育，66h每孔加入0.5～1μci３H-TdR(50μl)↓继续培养6～12h用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集仪收集样品于"9999"型玻璃纤维滤纸上↓烤干后β液闪仪计数计算1.增殖水平直接用CPM值表示。
2.也可用刺激指数(SI)表示:PHA(或实验组)cpm-机器本底SI＝───────────────阴性对照组cpm-机器本底(三)试剂和器材1.PBMC或其它含淋巴细胞的悬液。
2.PHA或其它有丝分裂原、刺激物3.闪烁液PPO(2，5-二苯茎恶唑)3～5gPOPOP[1，4双(5苯基恶唑)苯] 0.3～0.5g溶于1000ml二甲苯中。
一种非诊断目的检测淋巴细胞增殖情况的方法及其试剂盒[发明专利]
![一种非诊断目的检测淋巴细胞增殖情况的方法及其试剂盒[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/9e32fcc33169a4517623a353.png)
专利名称：一种非诊断目的检测淋巴细胞增殖情况的方法及其试剂盒
专利类型：发明专利
发明人：赵晓东,秦涛
申请号：CN201410786994.4
申请日：20141217
公开号：CN104458539A
公开日：
20150325
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及细胞增殖检测领域，特别涉及一种非诊断目的检测淋巴细胞增殖情况的方法及其试剂盒。
该方法包括：将第一待测血液样本与淋巴细胞多克隆激活剂混合，经细胞培养，获得第一血液细胞；将荧光标记的淋巴细胞表面标记抗体与第一血液细胞进行孵育，裂解红细胞，加入绝对计数用微球，采用流式细胞术检测淋巴细胞数量和绝对计数用微球数量，根据淋巴细胞数量、绝对计数用微球数量和绝对计数用微球浓度获得刺激组淋巴细胞的浓度。
本发明不仅可检测淋巴细胞各亚群的增殖比例，还可检测淋巴细胞各亚群增殖的绝对值，可准确反应淋巴细胞的增殖情况；使用全血进行增殖实验，不需要分离PBMC，血标本量要求很小；操作步骤简易，耗时短，误差较小。
申请人：重庆医科大学附属儿童医院
地址：400014 重庆市渝中区中山二路136号
国籍：CN
代理机构：北京集佳知识产权代理有限公司
代理人：赵青朵
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免疫学实验教学（复旦大学）实验六
实验六：淋巴细胞体外增殖活化和功能检测实验者：毛寰宇（12307120097）实验时间：2015年4月22日合作者：周鹏、张国栋一、实验原理1.淋巴细胞体外增殖反应：细胞在体外培养过程中，如受到一定物质的刺激，可转化为淋巴母细胞，表现为代谢旺盛，蛋白质和核酸合成增加，并产生一系列形态变化如：细胞变大成簇、细胞浆增多、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等。
刺激T淋巴细胞增殖的物质包括：非特异性刺激物如PHA，ConA，抗CD3抗体等；特异性抗原物质，具体特异性。
刀豆蛋白A(ConA)是从刀豆中提取出来的凝集素，属有丝分裂原（mitogen)，可与T细胞表面TCR 复合物及CD2结合，使其形成细胞表面的分子簇化，促使细胞活化并诱导细胞分裂，为非特异性多克隆活化剂。
经ConA作用的淋巴细胞显微镜下观察可见DNA合成增加，细胞体积增大，胞质增多以及出现有丝分裂等。
T淋巴细胞增殖活力的高低（淋巴母细胞的转化率）可以反映机体的细胞免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。
淋巴细胞增殖活化试验有形态计数法、CCK8法和同位素掺入法。
本实验采用的是CCK8法。
K8检测细胞活性：CCK-8试剂中含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐（WST–8），它在电子耦合剂1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan）。
生成的甲臜量与活细胞的数量成正比。
OD450可间接反映活细胞数量。
该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。
二、实验材料A.动物：BALB/C小鼠B.材料：75%酒精、PBS缓冲液（PH7.4）、红细胞裂解液、RPMI-1640不完全培养液、胎牛血清、刀豆蛋白AC.器材：CCK8检测试剂盒、血球计数板、计数器、正置显微镜、倒置显微镜、微量移液器、枪头、离心机、酶标仪、解剖器材（眼科剪刀、镊子、酒精棉球）、注射器枕芯、无菌平皿、尼龙指套、15mL离心管（消毒）三、实验内容A.处死小鼠，获取脾脏。
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DNA合成检测法
DNA复制完成、 蛋白合成， 为有丝分裂 作准备
RNA转录、蛋 白合成为DNA 复制做准备
DNA合成期 增殖期的细胞需要大量核苷酸
DNA合成检测法
利用在细胞培养过程中掺入放射性（如 3H-Tdr 掺入法）或
非放射性的核苷类似物（如 Brdu 掺入实验），直接检测 DNA合成水平变化
刺激淋巴细胞增殖
Day 3:
CCk8检测细胞增殖
将细胞浓度分别调节为 2x106 /mL和4x106 /mL，加入96 孔板，每孔90μL，加入25μg/mL或50μ g/mL ConA溶液10 μL ，细胞培养箱（37℃，5%CO2)中孵育72h。培养期间可 观察细胞增殖情况。
美洲商陆 激活人和小鼠T和B细胞 G-菌 测定小鼠B细胞 检测人B细胞
葡萄球菌蛋白A（SPA）G+菌
高浓度时，经丝裂原受体与B细胞结合，多克隆诱导B细胞 增殖和分化； 低浓度时， BCR特异性识别TI-1抗原的B细胞能竞争结合到 足够抗原量被激活； 感染初期（在TD-Ag免疫应答启动前）快速产生特异性抗体
的BrdU水平
LPS 2D 3D 12.05
0.65 Medium
5.77
BrdU 7AAD Flow cytometric analysis of DNA content (propidium iodide) and DNA synthesis (BrdU) after two or three days of stimulation
细胞染色法
利用荧光染色可穿透细胞膜的特性染色细胞，当细胞分裂
时，荧光标记物被平均分配到两个子代细胞中，其荧光强 度是亲代细胞的一半，如CFSE染色细胞
C3He anti-u 10
细胞代谢活性检测法
通过活细胞线粒体脱氢酶具有转化四氮唑盐等物质的能力
进而反映细胞活力的方法，如 MTT 法检测细胞内线粒体活 性实验
普通蛋白质抗原
比较超抗原和普通抗原与MHC及TCR的作用模式
通过与MHC-II类分子的抗原结合槽以外的非多态区（APC)和TCRVCDR3外侧区域(T 细胞）结合，激活2%-20% 的T克隆。
T细胞超抗原（super antigen, SAg）
作用特点： 强激活T细胞作用（低浓度（1-10ng/ml）、多克隆（2%20% ））；不需常规的细胞内抗原提呈；不受MHC限制 普通蛋白质抗原可激活总T细胞库1/104——1/106 效应： 大量细胞因子，病理生理过程的发生发展 （similar to septic shock）
3H-Tdr掺入法：敏感但有放射性污染
BrdU掺入法： BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物，通过竞争掺入S
期细胞单链DNA核苷酸序列替代胸腺嘧啶
G0/G1 G2/M S
DNA含量 2倍体 4倍体 DNA复制完成 两者之间
S期细胞DNA合成检测法
3H-Tdr掺入法
同位素检测，敏感但有放射性污染 BrdU掺入法 BrdU是DNA前体胸腺嘧啶核苷类似物替代胸腺嘧啶，通 过ELISA和流式细胞术检测竞争掺入单链DNA核苷酸序列
常见的T细胞超抗原
外源性 细菌毒素性产物：金黄色葡萄球菌肠毒素AE（SEA SEE）、A族链球菌M蛋白、致热外毒素、关节支原体丝裂 原MAM 内源性 小鼠乳腺肿瘤病毒蛋白MMTV 次要淋巴细胞刺激抗原（mls）
常用有丝分裂原-激活某一类淋巴细胞的全部克隆
丝裂原名称 刀豆蛋白A（ConA） 植物血凝素（PHA） 美洲商陆丝裂原 （PWM） 脂多糖（LPS） 来源 刀豆 云豆 特征 活化人和小鼠T细胞 活化人和小鼠T细胞
淋巴细胞ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ殖
静止淋巴细胞受一定物质刺激后向淋巴母细胞转化， 细胞内蛋白质和核酸合成，细胞代谢旺盛，伴有数量和 形态学改变，如细胞变大、胞浆增多并形成空泡、核仁
明显、染色质疏松
淋巴细胞增殖实验就是根据上述细胞的改变，设计的 相应检测方法，又称为淋巴细胞转化实验（lymphocyte transformation test, LTT）
淋巴细胞增殖实验
淋巴细胞转化率的高低可直接反应机体T或B细胞的免疫水 平，常作为检测免疫细胞功能的指标之一 评价动物免疫细胞免疫应答能力的简便可靠的方法之一
淋巴细胞增殖功能测定
细胞计数法
DNA合成检测法
细胞代谢活性检测法 细胞染色法
台盼蓝拒染实验
脾细胞计数为例 10倍稀释脾细胞悬液 取脾细胞悬液 20 uL+PBS 80 uL，混匀（5X稀释） 5X脾细胞悬液 20 uL+ 0.4%-0.04% 台盼蓝溶液 20 uL 计数板计数脾细胞
Hemacytometer
每0.1mm3体积平均细胞数=四
个小方格中细胞总数÷ 4
每毫升细胞总数=每0.1mm3体 积平均细胞数×104 一个小鼠脾脏单个核细胞数=每 毫升细胞总数x 稀释倍数x 细胞
Corner square
悬液体积
生存率(%)=(1个小方格中活细 胞总数÷ 1个小方格中细胞总 数) ×100
该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模 的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试 验等。
ConA刺激T细胞增殖
淋巴细胞在体内外接受ConA刺激后，静止淋巴细胞向 母细胞转化。这种转化的细胞DNA合成增加，细胞体积增 大，胞质增多以及出现有丝分裂等形态变化。
刺激后
Day 0:
CCK8（Cell Counting Kit-8）检测细胞增殖
CCK-8试剂中含有2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐（WST–8），它在电子耦合剂1-甲 氧基-5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细 胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物 （Formazan）。 生成的甲臜量与活细胞的数量成正比。OD450可 间接反映活细胞数量。
医学免疫学实验
实验六 淋巴细胞功能检测
—T淋巴细胞增殖活化
体内外激活T/B细胞增殖的物质
一些物质能够特异性或非特异性地诱导淋巴细胞发生活化，
导致细胞因子的分泌、细胞因子受体的表达并最终使活化 的淋巴细胞发生增殖和分化
体内外激活T/B细胞增殖的物质
非特异性免疫刺激剂
如超抗原、丝裂原、抗体类如抗CD3抗体、促细胞生长因子 如IL-2 特异性抗原