TGFβ1诱导肺泡上皮细胞间质转化

TGF-β1诱导肺泡上皮细胞间质转化

作者：黄振杰,郑金旭,莫凯天,苏石芳作者单位：广西北海市人民医院呼吸科;江苏大学附属医院呼吸科;上海市第八人民医院消化科

【摘要】目的：通过观察TGF- 1诱导下A549细胞出现的细胞形态学和E-cad表达的变化，探讨上皮细胞-间质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程在肺纤维化发病机制中的作用。方法：体外培养A549细胞，以TGF- 1进行干预，收集不同时段的细胞，应用荧光实时定量PCR(RT-PCR)检测TGF- 1干预前后E-cad的mRNA表达变化;倒置相差显微镜观察细胞形态学的变化;间接免疫荧光观察E-cad蛋白表达的变化。结果：倒置相差显微镜观察到TGF- 1干预后A549细胞由鹅卵石状变为梭形，形态如同肌纤维母细胞。间接免疫荧光显示A549细胞的E-cad表达(红色荧光染色)随时间延长逐渐减少。RT-PCR显示E-cad的mRNA表达下调(P 0.05)。结论：TGF- 1在体外诱导肺泡上皮细胞向间质细胞转化,肺泡上皮细胞间质转化是肺纤维化的重要发病机制之一。

【关键词】转化生长因子1,A549细胞,上皮细胞间质转化,肺纤维化

Abstract：ObjectiveBy observing the cellular morphology changes and the expression of E-cad after A549 cells were treated with transforming growth factor 1(TGF- 1)，to investigate the role of epithelial-mesenchymal transition (EMT) in the pathogenesy of pulmonary fibrosis.MethodA549 cells cultured in vitro were treated by TGF- 1,then harvested at different time points to assay mRNA expression of E-cad by real-time PCR (RT-PCR) before and after A549 cells being treated by TGF- 1.Cellular morphology changes were observed by phase-contrast microscope.Protein expression of E-cad by indirect immunofluorescence.ResultsAfter being treated by TGF- 1，A549 cells were observed by inverted phase contrast microscope to turn from pebble shape to fusiform shape，a myofibroblast-like morphology.Indirect immunofluorescence showed protein expression of E-cad reduced as time went by(red stain).The mRNA expression of E-cad was down -regulated in RT-PCR(P 0.05).ConclusionTGF- 1 induced EMT of alveolar epithelial cells in vitro suggests that EMT of alveolar epithelial cells might be one of fundamental mechanisms of pulmonary fibrosis.

Key Words:Transforming growth factor A549 cells;Epithelial- mesenchymal transition;Pulmonary fibrosis

特发性肺纤维化(IPF) 是最常见的肺间质疾病,也是肺间质纤维化的主要原因。多数肺间质疾病病因不明,其发病机制目前也未完全阐明。传统观点认为各种损伤因素损伤肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞，炎症细胞浸润，细胞因子失衡，肺实质损伤后继发肺间质细胞增殖过度修复导致纤维化。国外有文献报道IPF是一种涉及异常创伤愈合的功能紊乱，进行性的上皮损伤和(或)激活可能处于纤维形成和间质细胞增殖的核心位置，这种作用是不依赖于炎症的[1-2]。肺泡上皮细胞(AECs)不仅仅是作为发病的促动因素，它们本身就可以通过一个叫做上皮细胞-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的过程获得间质细胞表型而作为成纤维细胞和肌纤维母细胞的重要来源。在这个新的模式中，肺泡上皮应该被看作纤维化的关键环节之一，它作为一个多能的干细胞具有相当的可塑性，能参与到交替的途径中：上皮再生修复正常的肺泡结构，凋亡，或者通过EMT形成纤维化。本研究通过用TGF- 1诱导A549从肺泡上皮细胞向间质细胞转化，进一步探讨肺泡上皮细胞在肺纤维化发病中的作用,为阐明肺纤维化发病的分子生物学机制及寻求新的治疗方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及物品：A549细胞株(中国典型培养物保藏中心)，TGF- 1(PeproTech公司)，E-cad 鼠抗人一抗(Santa Cruz公司),兔抗鼠Fitc标志的IgG(Boster公司)，胎牛血清(Hyclone 公司)，低糖DMEM培养基(GIBCO公司)。MMLV逆转录酶(美国Promega公司)，实时定量试剂盒Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invit rogen 公司)。

1.2 主要仪器：超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，二氧化碳培养箱(Forma)，倒置相差显微镜(OL YMPUS)，高速台式离心机(上海飞鸽牌)，Mx-3000P实时定量PCR仪(STRATAGENE公司)，凝胶成像与分析系统YNGENE (GENE)，电泳仪Jim-X(Bio-Rad)，荧光显微镜(Leica)，荧光倒置相差显微镜(Nikon)。

1.3 细胞培养：A549细胞用含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基，常规培养于5%的CO2,37℃人工培养箱中，细胞呈贴壁生长。

1.4 倒置相差显微镜观察细胞形态：当细胞生长融合至70%～80%，用无血清培养基饥饿24 h,换新鲜培养液,随机把细胞分组，于培养液中加入TGF- 1至终浓度5 ng/ml。倒置相差显微镜观察A549细胞在TGF- 1刺激0、24、48 h的形态变化。

1.5 间接免疫荧光：以每孔1 104个细胞接种于24孔培养板中预置的载破片上，细胞贴壁爬片后，用无血清培养基饥饿24 h后，加入TGF- 1至终浓度5 ng/ml。分别于0、24、48 h 后，取出载玻片，用4%多聚甲醛固定60 min。5%的BSA封闭，37℃60 min。加一抗E-Cadherin单克隆抗体(1∶50)，4℃过夜。加相应二抗，缓冲甘油封片。荧光显微镜下观察，并拍照。

1.6 总RNA抽提及逆转录反应：当细胞生长融合至70%～80%，用无血清培养基饥饿24 h,换新鲜培养液,在无血清培养基中加入TGF- 1至终浓度5 ng/ml。分别于0 、1 、3 、6 、12和24 h从六孔板中离心收集细胞,加入1 ml TRIzol Reagent,按其说明书操作步骤提取总RNA,电泳证实,具有清晰18S和28S条带的RNA用于逆转录实验,取1 gRNA经MMLV逆转录酶逆转录成cDNA。具体操作按试剂盒说明书进行。cDNA产物于-20℃保存。

1.7 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应( Real-time PCR)检测上皮细胞标志物E-cad的mRNA表达：RT-PCR检测上皮细胞标志物E-cad，APDH作内参。引物(Sequence 5 3 )：E-cad Sense-TTCTGGAAGGAA TGGAGGAGT C-ntisense- ACCTGGAA TTGGGCAAA TGTG-(147 bp);GAPDH Sense-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-Antisense-AGCCAATTCG TTGTCATAC-(115 bp)，引物由上海生工公司合成。加样体系按试剂盒Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG说明书操作。实时定量PCR 反应条件：95℃5 min 1个循环，95℃20 s,62℃30 s,72℃30 s，40个循环。由随机附带软件计算出Ct值和拷贝数。

1.8 统计学处理：各实验均重复3次，计量资料以均数标准差(x s)表示，应用SPSS 16.0软件处理，多组均数间采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验,P 0.05被认为是差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞形态学观察：与不加TGF- 1 组相比，加入TGF- 1 后，A549细胞由鹅卵石状上皮形态变成梭形、纺锤形，而且其细胞间隙略变大,细胞和细胞之间的连接变得松散。

2.2 间接免疫荧光：荧光显微镜下观察，正常的A549 细胞为鹅卵石状，细胞表达E-Cad 蛋白，胞膜可见耀眼的红色荧光染色，在外源性TGF- 1 刺激下，随时间延长细胞外形逐渐伸长，并与周围细胞分离，E-Cad 蛋白表达明显减少。

2.3 荧光实时定量PCR检测TGF- 1对A549细胞E-cad的mRNA 表达的影响：与不加TGF- 1 组相比，A549 细胞在加入TGF- 1 后其上皮细胞标志物E-cad的mRNA 表达在24小时内总体呈现下调趋势，在第24 h时间点上最明显(P 0.01)，在第3 h时间点上出现一个短暂反弹(P 0.05)。