壳聚糖微球的自发荧光机理
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m/z
图 4 合成产物的高效液相色谱−质联用分析结果 Fig 4 HPLC−MS analysis of synthesized product
合 成 产 物 的 ⎯C==N⎯C==C⎯ 结 构 采 用 傅 立 叶 红 外光谱仪进行分析：将 1 mL 合成产物装入样品池中， 利用自动扣除溶剂背景吸收功能，测定并记录波数范围 为 4 000∼400 cm−1、分辨率为 4 cm−1 的合成产物的透过 率−波数光谱图，用于合成产物的价键辨认. 2.3.3 荧光特性分析
H3C
H C C H2
H C C
CH3
CH3 C CH3 N CH3 Mw=153.14
2.1 材料与试剂 2- 氨 基-2- 甲基 丙 烷 (99%， 分 析 纯 ，美 国 Acros
Orcanics 公司)，顺-2-甲基-2-戊烯醛(98%，分析纯，美 国 Acros Orcanics 公司)，乙腈和三氟乙酸(TFA)为色谱 纯(美国 Dima 公司)，乳化剂 PO-500(Hexaglycerin penta) 由日本阪本药品工业株式会社提供. 2.2 实验装置与分析仪器
Intensity (a.u.)
1750000 1500000 (a) HPLC 1250000 1000000
750000 500000 250000
0 0 5 10
154.3
100
(b) MS
80
Relative abundance
100.3 106.9
60
40
142.0 145.1 153.7
glutaraldehyde
2 实验
2.3 实验方法 2.3.1 合成
5 mL 顺-2-甲基-2-丁烯醛中加入 5 mL 叔丁胺(2-氨 基-2-甲基丙烷)，醛基/氨基摩尔比为 1:1，在冰浴下磁 力搅拌反应 1 h. 反应式如下：
H3C
H C
H C
C H2
C H3C
H3C
+
O
H2N
C
1h 0℃
CH3 CH3
具有共轭结构的产物在一定波长的激发光照射下 被激发，分子从激发态返回基态时，释放能量产生荧光. 合成产物采用荧光光谱仪和激光共聚焦显微镜 2 种手段 进行荧光光谱分析. 首先取合成产物 5 mL，用一定量纯 乙腈稀释溶解后，用容量瓶定容至 15 mL，产物浓度约 0.16 mol/mL，使用时稀释至 1.6 µmol/L 后取 1.5 mL 加 入荧光光谱仪的样品池中，在固定激发波长 488 nm 下 进行产物的光谱扫描(500∼700 nm)，得到合成产物的二 维荧光光谱，同时，在 200∼900 nm 的激发波长下进行 扫描，并在 200∼900 nm 发射波长范围内采集合成产物 的荧光强度得到合成产物的三维荧光光谱. 将合成产物 的荧光光谱与壳聚糖微球的荧光光谱进行对照，验证
第 11 卷第 3 期 2011 年 6 月
过程工程学报 The Chinese Journal of Process Engineering
Vol.11 No.3 June 2011
壳聚糖微球的自发荧光机理
宋春艳 ， 1,2 王连艳 1， 吴有斌 1， 张 竞 1， 马光辉 1， 张 栩 2
Biblioteka Baidu
(1. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190；2. 北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029)
wanglianyan@home.ipe.ac.cn.
488
过程工程学报
第 11 卷
OH
Chitosan HO
H2C
(CH2)2
C H
CH
N Chitosan
O O n
N
N Chitosan
CH
CH
H2 C (CH2)2 CH C C CH2
n
CH
N Chitosan
图 2 壳聚糖与戊二醛交联反应示意图 Fig.2 Scheme of crosslinking reaction between chitosan and
Relative fluorescence intensity
160
120
80
40
0
500
550
600
650
700
Wavelength (nm)
图 1 壳聚糖自发荧光微球的荧光光谱[5] Fig.1 Fluorescence spectrum of chitosan microspheres[5]
虽然以戊二醛为交联剂所制壳聚糖微球具有稳定 的自发荧光性质，但对壳聚糖微球自发荧光机理仅有一 些推测[6]，并没有明确的解释. 因此对壳聚糖微球的自 发荧光机理进行深入研究，有助于荧光微球设计及荧光 调控，以制备更多不同种类的自发荧光微球，通过不同 给药途径实现不同的临床用途，同时也可利用微球的荧 光实现对微球的高灵敏度、操作简便快速的分析等，为 后续应用提供理论指导.
荧光物质的荧光与其结构密切相关[6]，荧光物质一 般具有以下条件：(1)大的共轭π键结构；(2)刚性平面 结构；(3)给电子取代基增加荧光，得电子取代基使荧光 减弱；(4)最低单线电子激发态 S1 的性质：最低激发态 为 π−π∗跃迁产生的荧光强度大，最低激发态为 n−π∗跃 迁产生的荧光较弱. 荧光的产生常常对应体系中不饱和 键的 π−π∗和 n−π∗跃迁. 戊二醛在水溶液中由于脱水和 缩合作用产生α−β不饱和双键(⎯C==C⎯)[7]，以戊二醛 的三聚体形式存在. 通过分析戊二醛与壳聚糖交联反应 的产物结构式(如图 2 所示)，推测在壳聚糖微球的结构 中有 2 种不饱和双键，一种是戊二醛三聚体中的 ⎯C==C⎯双键，另一种是壳聚糖上的氨基与交联剂的 醛基交联后生成的新双键⎯C==N⎯[8], 2 种双键在壳聚 糖微球空间结构中形成了⎯C==N⎯C==C⎯共轭结构， 其在 488 nm 波长激光的激发下发生电子跃迁，跃迁的 电子在返回基态过程中产生荧光现象. 为验证上述推 测，本研究设计合成了具有⎯C==N⎯C==C⎯结构的物 质 N-叔丁基-2-甲基-2-戊烯亚胺，通过荧光光谱分析确 证共轭结构单元⎯C==N⎯ C==C⎯对壳聚糖微球荧光 的贡献，从而对壳聚糖微球自发荧光机理进行阐释.
收稿日期：2011−04−18，修回日期：2011−05−11 基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：50703043)；国家高技术研究发展计划(863)基金资助项目(编号：2007AA09Z439) 作者简介：宋春艳(1984−)，女，河北省邢台市人，硕士研究生，微生物与生化药学专业；王连艳，通讯联系人，Tel: 010-82544931, E-mail:
85-2 型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)， TCS SP2 Leica 激光共聚焦显微镜(德国 Leica 公司)， AXIOS 型 X 荧光光谱仪(XRF, 荷兰 PANalytical B.V 公 司)，FT/IR-660 傅立叶红外光谱仪(日本分光株式会)， 高效液相色谱−质谱联用仪(LCQ Deca xp, 美国 Thermo Finnigan 公司). 合成反应装置如图 3 所示.
3 结果与讨论
3.1 N-叔丁基-2-甲基-2-戊烯亚胺的合成与表征 合成产物的高效液相色谱分析结果如图 4(a)所示.
由图可见，在 9.41 min 处有明显的色谱峰. 对其进行质 谱分析，结果表明谱峰对应的物质分子量为 154.3 [图 4(b)]，与 C(CH3)3⎯N==CH⎯C(CH3)==C⎯CH2⎯CH3 的 相对分子质量一致，且谱峰面积约占总峰面积的 92%， 表明合成的物质体系中含具有共轭亚胺结构 C(CH3)3⎯N==CH⎯C(CH3)==C⎯CH2⎯CH3 的产物.
摘 要：为验证壳聚糖的自发荧光机理，以顺-2-甲基-2-丁烯醛和 2-氨基-2-甲基丙烷为原料，在−14℃无水无氧条件下
合成了具有⎯C==N⎯C==C⎯结构单元的产物，通过傅立叶红外光谱和液质联用技术进行结构确认，并对合成产物进
行了荧光光谱扫描和激光共聚焦光谱扫描分析. 结果表明，合成的物质在 488 nm 激发下，于 510∼540 和 570∼600 nm
N2
N2
Magnetic rod Thermometer
Ice-water bath
图 3 实验装置示意图 Fig.3 Schematic diagram of experimental apparatus
反 应 合 成 的 具 有 ⎯C==N⎯C==C⎯ 结 构 单 元 的 产 物为亚胺类化合物，在室温或高温中易分解，尤其在有 氧条件下会氧化成胺类化合物. 为确保合成亚胺产物的 纯度，反应需在−14℃且无水无氧条件下进行. 反应结束 后，得到的反应产物体系为黄色油状液体.
(Band width) 30 nm，步进(Lambds stepwise) 3 nm，激发 光强度(Excitation intensity) 60%，发射波段 500∼700 nm. 激光共聚焦照片采集条件如下：激发光波长 488 nm，采 集波长 510∼540 和 570∼600 nm. 通过对比分析推断共轭 结构单元对荧光的贡献.
波段采集到了稳定的荧光，与壳聚糖荧光微球的荧光波长一致. 据此可推断壳聚糖微球的自发荧光主要源于⎯C==N⎯
C==C⎯共轭结构单元.
关键词：壳聚糖微球；自发荧光；机理；合成；共轭结构
中图分类号：O622.6
文献标识码：A
文章编号：1009−606X(2011)03−0487−05
1 前言
随着对功能高分子微球研究的深入，荧光微球作为 一种新型材料受到广泛关注，并在生物医学领域广泛应 用. 传统的荧光微球是指负载有荧光物质、受外界能量 刺激能激发出荧光的固体微粒. 其荧光物质负载通常需 采用荧光标记或包埋荧光物质，而这种标记或包埋方法 存在某些分子难用荧光标记、荧光物质易泄露、难准确 定量等问题[1−3]. 因此，制备稳定的自发荧光微球，能有 效克服现有荧光微球在应用上存在的缺点.
第3期
宋春艳等：壳聚糖微球的自发荧光机理
489
⎯C==N⎯C==C⎯结构单元在自发荧光中的贡献. 为便于观察荧光特性，分别制备了合成产物、壳聚
糖溶液和戊二醛溶液的乳液，用激光共聚焦显微镜对 3 种乳滴进行光谱扫描分析，同时对壳聚糖微球及 3 种乳 滴在 488 nm 激发波长下激发，采集 510∼540 和 570∼600 nm 波长下的共聚焦照片. 以合成产物为内油相 O1，以 相互溶解的硅油为外油相 O2，采用均质乳化法制备合成 产物的乳滴 O1/O2，其中 O1:O2 为 1:5(ϕ)，在 14 000 r/min 转速下均质乳化 1 min. 壳聚糖溶液乳滴和戊二醛溶液 乳滴制备条件如下：分别以壳聚糖溶液和戊二醛水溶液 为水相，以液体石蜡和石油醚混合物(体积比 1:2)为油 相，其中含 4%(ω)乳化剂 PO-500，在 6000 r/min 转速 下均质乳化 1 min. 取乳液各 1 滴置于激光共聚焦小皿 中，在激光共聚焦下扫描各乳滴的荧光光谱，并拍摄荧 光照片. 激光共聚焦荧光光谱扫描条件如下：频带宽度
本研究小组的最新研究[4]发现，以戊二醛为交联剂 交联固化得到的壳聚糖微球具有明显且稳定的自发荧 光，其共聚焦显微镜光谱分析结果如图 1[5]所示，表明 在 488 nm 激发下，壳聚糖微球在 510∼540 和 570∼600 nm 处有 2 个发射峰，荧光强度较高且不易猝灭，这为壳聚 糖微球在体内分布的定量和定性研究提供了可能.
O2 High temperature
H3C
H C C H2
H2 C CN
H CH3
CH3 C CH3
CH3
2.3.2 结构鉴定 合成产物的纯度采用高效液相色谱−质谱联用仪进
行分析，高效液相分析条件为：色谱柱 Agilent Zobarx SB C18 柱(150 mm ×2.1 mm, 5 µm)，流动相采用乙腈:水(乙 腈 95%∼5%)进行梯度洗脱，流速 1 mL/min，进样量 10 µL，洗脱时间 40 min，产物检测波长 254 nm，柱温 30℃. 质谱分析(ESI−MS−MS)条件为：离子源喷射电压 3.5 kV，毛细管温度 275℃，夹套气(N2)流速为 35 Arbitary Units，检测方式为正离子检测.
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0 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190
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图 4 合成产物的高效液相色谱−质联用分析结果 Fig 4 HPLC−MS analysis of synthesized product
合 成 产 物 的 ⎯C==N⎯C==C⎯ 结 构 采 用 傅 立 叶 红 外光谱仪进行分析：将 1 mL 合成产物装入样品池中， 利用自动扣除溶剂背景吸收功能，测定并记录波数范围 为 4 000∼400 cm−1、分辨率为 4 cm−1 的合成产物的透过 率−波数光谱图，用于合成产物的价键辨认. 2.3.3 荧光特性分析
H3C
H C C H2
H C C
CH3
CH3 C CH3 N CH3 Mw=153.14
2.1 材料与试剂 2- 氨 基-2- 甲基 丙 烷 (99%， 分 析 纯 ，美 国 Acros
Orcanics 公司)，顺-2-甲基-2-戊烯醛(98%，分析纯，美 国 Acros Orcanics 公司)，乙腈和三氟乙酸(TFA)为色谱 纯(美国 Dima 公司)，乳化剂 PO-500(Hexaglycerin penta) 由日本阪本药品工业株式会社提供. 2.2 实验装置与分析仪器
Intensity (a.u.)
1750000 1500000 (a) HPLC 1250000 1000000
750000 500000 250000
0 0 5 10
154.3
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(b) MS
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Relative abundance
100.3 106.9
60
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142.0 145.1 153.7
glutaraldehyde
2 实验
2.3 实验方法 2.3.1 合成
5 mL 顺-2-甲基-2-丁烯醛中加入 5 mL 叔丁胺(2-氨 基-2-甲基丙烷)，醛基/氨基摩尔比为 1:1，在冰浴下磁 力搅拌反应 1 h. 反应式如下：
H3C
H C
H C
C H2
C H3C
H3C
+
O
H2N
C
1h 0℃
CH3 CH3
具有共轭结构的产物在一定波长的激发光照射下 被激发，分子从激发态返回基态时，释放能量产生荧光. 合成产物采用荧光光谱仪和激光共聚焦显微镜 2 种手段 进行荧光光谱分析. 首先取合成产物 5 mL，用一定量纯 乙腈稀释溶解后，用容量瓶定容至 15 mL，产物浓度约 0.16 mol/mL，使用时稀释至 1.6 µmol/L 后取 1.5 mL 加 入荧光光谱仪的样品池中，在固定激发波长 488 nm 下 进行产物的光谱扫描(500∼700 nm)，得到合成产物的二 维荧光光谱，同时，在 200∼900 nm 的激发波长下进行 扫描，并在 200∼900 nm 发射波长范围内采集合成产物 的荧光强度得到合成产物的三维荧光光谱. 将合成产物 的荧光光谱与壳聚糖微球的荧光光谱进行对照，验证
第 11 卷第 3 期 2011 年 6 月
过程工程学报 The Chinese Journal of Process Engineering
Vol.11 No.3 June 2011
壳聚糖微球的自发荧光机理
宋春艳 ， 1,2 王连艳 1， 吴有斌 1， 张 竞 1， 马光辉 1， 张 栩 2
Biblioteka Baidu
(1. 中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190；2. 北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029)
wanglianyan@home.ipe.ac.cn.
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过程工程学报
第 11 卷
OH
Chitosan HO
H2C
(CH2)2
C H
CH
N Chitosan
O O n
N
N Chitosan
CH
CH
H2 C (CH2)2 CH C C CH2
n
CH
N Chitosan
图 2 壳聚糖与戊二醛交联反应示意图 Fig.2 Scheme of crosslinking reaction between chitosan and
Relative fluorescence intensity
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500
550
600
650
700
Wavelength (nm)
图 1 壳聚糖自发荧光微球的荧光光谱[5] Fig.1 Fluorescence spectrum of chitosan microspheres[5]
虽然以戊二醛为交联剂所制壳聚糖微球具有稳定 的自发荧光性质，但对壳聚糖微球自发荧光机理仅有一 些推测[6]，并没有明确的解释. 因此对壳聚糖微球的自 发荧光机理进行深入研究，有助于荧光微球设计及荧光 调控，以制备更多不同种类的自发荧光微球，通过不同 给药途径实现不同的临床用途，同时也可利用微球的荧 光实现对微球的高灵敏度、操作简便快速的分析等，为 后续应用提供理论指导.
荧光物质的荧光与其结构密切相关[6]，荧光物质一 般具有以下条件：(1)大的共轭π键结构；(2)刚性平面 结构；(3)给电子取代基增加荧光，得电子取代基使荧光 减弱；(4)最低单线电子激发态 S1 的性质：最低激发态 为 π−π∗跃迁产生的荧光强度大，最低激发态为 n−π∗跃 迁产生的荧光较弱. 荧光的产生常常对应体系中不饱和 键的 π−π∗和 n−π∗跃迁. 戊二醛在水溶液中由于脱水和 缩合作用产生α−β不饱和双键(⎯C==C⎯)[7]，以戊二醛 的三聚体形式存在. 通过分析戊二醛与壳聚糖交联反应 的产物结构式(如图 2 所示)，推测在壳聚糖微球的结构 中有 2 种不饱和双键，一种是戊二醛三聚体中的 ⎯C==C⎯双键，另一种是壳聚糖上的氨基与交联剂的 醛基交联后生成的新双键⎯C==N⎯[8], 2 种双键在壳聚 糖微球空间结构中形成了⎯C==N⎯C==C⎯共轭结构， 其在 488 nm 波长激光的激发下发生电子跃迁，跃迁的 电子在返回基态过程中产生荧光现象. 为验证上述推 测，本研究设计合成了具有⎯C==N⎯C==C⎯结构的物 质 N-叔丁基-2-甲基-2-戊烯亚胺，通过荧光光谱分析确 证共轭结构单元⎯C==N⎯ C==C⎯对壳聚糖微球荧光 的贡献，从而对壳聚糖微球自发荧光机理进行阐释.
收稿日期：2011−04−18，修回日期：2011−05−11 基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：50703043)；国家高技术研究发展计划(863)基金资助项目(编号：2007AA09Z439) 作者简介：宋春艳(1984−)，女，河北省邢台市人，硕士研究生，微生物与生化药学专业；王连艳，通讯联系人，Tel: 010-82544931, E-mail:
85-2 型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)， TCS SP2 Leica 激光共聚焦显微镜(德国 Leica 公司)， AXIOS 型 X 荧光光谱仪(XRF, 荷兰 PANalytical B.V 公 司)，FT/IR-660 傅立叶红外光谱仪(日本分光株式会)， 高效液相色谱−质谱联用仪(LCQ Deca xp, 美国 Thermo Finnigan 公司). 合成反应装置如图 3 所示.
3 结果与讨论
3.1 N-叔丁基-2-甲基-2-戊烯亚胺的合成与表征 合成产物的高效液相色谱分析结果如图 4(a)所示.
由图可见，在 9.41 min 处有明显的色谱峰. 对其进行质 谱分析，结果表明谱峰对应的物质分子量为 154.3 [图 4(b)]，与 C(CH3)3⎯N==CH⎯C(CH3)==C⎯CH2⎯CH3 的 相对分子质量一致，且谱峰面积约占总峰面积的 92%， 表明合成的物质体系中含具有共轭亚胺结构 C(CH3)3⎯N==CH⎯C(CH3)==C⎯CH2⎯CH3 的产物.
摘 要：为验证壳聚糖的自发荧光机理，以顺-2-甲基-2-丁烯醛和 2-氨基-2-甲基丙烷为原料，在−14℃无水无氧条件下
合成了具有⎯C==N⎯C==C⎯结构单元的产物，通过傅立叶红外光谱和液质联用技术进行结构确认，并对合成产物进
行了荧光光谱扫描和激光共聚焦光谱扫描分析. 结果表明，合成的物质在 488 nm 激发下，于 510∼540 和 570∼600 nm
N2
N2
Magnetic rod Thermometer
Ice-water bath
图 3 实验装置示意图 Fig.3 Schematic diagram of experimental apparatus
反 应 合 成 的 具 有 ⎯C==N⎯C==C⎯ 结 构 单 元 的 产 物为亚胺类化合物，在室温或高温中易分解，尤其在有 氧条件下会氧化成胺类化合物. 为确保合成亚胺产物的 纯度，反应需在−14℃且无水无氧条件下进行. 反应结束 后，得到的反应产物体系为黄色油状液体.
(Band width) 30 nm，步进(Lambds stepwise) 3 nm，激发 光强度(Excitation intensity) 60%，发射波段 500∼700 nm. 激光共聚焦照片采集条件如下：激发光波长 488 nm，采 集波长 510∼540 和 570∼600 nm. 通过对比分析推断共轭 结构单元对荧光的贡献.
波段采集到了稳定的荧光，与壳聚糖荧光微球的荧光波长一致. 据此可推断壳聚糖微球的自发荧光主要源于⎯C==N⎯
C==C⎯共轭结构单元.
关键词：壳聚糖微球；自发荧光；机理；合成；共轭结构
中图分类号：O622.6
文献标识码：A
文章编号：1009−606X(2011)03−0487−05
1 前言
随着对功能高分子微球研究的深入，荧光微球作为 一种新型材料受到广泛关注，并在生物医学领域广泛应 用. 传统的荧光微球是指负载有荧光物质、受外界能量 刺激能激发出荧光的固体微粒. 其荧光物质负载通常需 采用荧光标记或包埋荧光物质，而这种标记或包埋方法 存在某些分子难用荧光标记、荧光物质易泄露、难准确 定量等问题[1−3]. 因此，制备稳定的自发荧光微球，能有 效克服现有荧光微球在应用上存在的缺点.
第3期
宋春艳等：壳聚糖微球的自发荧光机理
489
⎯C==N⎯C==C⎯结构单元在自发荧光中的贡献. 为便于观察荧光特性，分别制备了合成产物、壳聚
糖溶液和戊二醛溶液的乳液，用激光共聚焦显微镜对 3 种乳滴进行光谱扫描分析，同时对壳聚糖微球及 3 种乳 滴在 488 nm 激发波长下激发，采集 510∼540 和 570∼600 nm 波长下的共聚焦照片. 以合成产物为内油相 O1，以 相互溶解的硅油为外油相 O2，采用均质乳化法制备合成 产物的乳滴 O1/O2，其中 O1:O2 为 1:5(ϕ)，在 14 000 r/min 转速下均质乳化 1 min. 壳聚糖溶液乳滴和戊二醛溶液 乳滴制备条件如下：分别以壳聚糖溶液和戊二醛水溶液 为水相，以液体石蜡和石油醚混合物(体积比 1:2)为油 相，其中含 4%(ω)乳化剂 PO-500，在 6000 r/min 转速 下均质乳化 1 min. 取乳液各 1 滴置于激光共聚焦小皿 中，在激光共聚焦下扫描各乳滴的荧光光谱，并拍摄荧 光照片. 激光共聚焦荧光光谱扫描条件如下：频带宽度
本研究小组的最新研究[4]发现，以戊二醛为交联剂 交联固化得到的壳聚糖微球具有明显且稳定的自发荧 光，其共聚焦显微镜光谱分析结果如图 1[5]所示，表明 在 488 nm 激发下，壳聚糖微球在 510∼540 和 570∼600 nm 处有 2 个发射峰，荧光强度较高且不易猝灭，这为壳聚 糖微球在体内分布的定量和定性研究提供了可能.
O2 High temperature
H3C
H C C H2
H2 C CN
H CH3
CH3 C CH3
CH3
2.3.2 结构鉴定 合成产物的纯度采用高效液相色谱−质谱联用仪进
行分析，高效液相分析条件为：色谱柱 Agilent Zobarx SB C18 柱(150 mm ×2.1 mm, 5 µm)，流动相采用乙腈:水(乙 腈 95%∼5%)进行梯度洗脱，流速 1 mL/min，进样量 10 µL，洗脱时间 40 min，产物检测波长 254 nm，柱温 30℃. 质谱分析(ESI−MS−MS)条件为：离子源喷射电压 3.5 kV，毛细管温度 275℃，夹套气(N2)流速为 35 Arbitary Units，检测方式为正离子检测.