葡聚糖的应用

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(1-3)b-D-Glucan TAL-RM(鲎试验非内毒素反应物 )
活化G因子 凝固酶
G因子
凝固酶原
显色寡肽
寡肽+显色基团(黄色) (光度法测定)
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分析前注意事项


采用无热原采血管 抽血后2h内送检 血标本4-8℃最多存放48h 检测环境应保持清洁
20
1,3-β-D-葡聚糖相关影响因素
系统性念珠菌病患者 IgG亚型体液水平升高
抗细胞壁碎片IgG1抗体(IgG1-CW) 抗磷酸肽甘露聚糖片段IgG2抗体(IgG2-PPM)
系统性念珠菌病患者 IgG1-CW/ IgG2-PPM比值升高

结论
1,3-β -D-葡聚糖以及IgG1-CW、IgG2-PPM可用于早期诊断系统性 念珠菌病 . 1,3-β -D-葡聚糖与IgG亚型相结合检测可提高阳性预测值,有效指导 早期抗真菌药物治疗 .
1,3-β-D-葡聚糖检测与临床
李智山 襄阳市中心医院医学检验部
1
侵袭性真菌感染率上升—
AIDS
2
医学和相关科学的进步
危重病人的存活期延长
延长了真菌感染 的 高 危 期
使此类患者业已增加 的人数进一步扩大
严重真菌感染迅速上升势头
是日益严重的威胁!
3
真菌感染的危险因素:






中心静脉插管 尿道插管 广谱抗生素 气管插管 腹部外科 肠胃外营养 营养不良 住院时间
30 刘英其. 中国卫生检验杂志2009年9月第19卷第9期
例7
血清1,3-β-D-葡聚糖检测在念珠菌菌血症诊断中的价值
四组间比较: F=119.493,P<0101; 细菌菌血症组、念珠菌口咽定植组、健康对照组三组间的比较:F=3104,P>0.105; 念珠菌菌血症组与细菌菌血症组、念珠菌口咽定植组、健康体检组的两两比较: P值均<0.01; 细菌菌血症组Vs念珠菌口咽定植组、细菌菌血症组Vs健康对照组、念珠菌口咽定 植组Vs健康对照组的两两比较:P值均>0.05.
用于诊断深部真菌感染各指标ROC曲线下面积
AUC
95%置信区间
葡聚糖
真菌培养 真菌涂片
0.887
0.840 0.833
0.795-0.979
0.744-0.936 0.738-0.927
29 赵勇,王红,等. 中国真菌学杂志2007年8月第2卷第 4期
例7
血清1,3-β-D-葡聚糖检测在念珠菌菌血症诊断中的价值
8
非培养方法优点


快速报告结果 敏感性提高 取材简便 多以真菌在致病状态产生的物质为检 测标志物,结果阳性提示有致病性 定量检测可判断感染严重程度及疗效 评估
9
非培养诊断的方法简介

真菌细胞壁成分

(1-3) - β- D-葡聚糖检测(G试验)

真菌抗原检查

半乳甘露聚糖(galactomannan) 抗原 (GM) 甘露聚糖(mannan)抗原 隐球菌荚膜多糖抗原(乳胶凝集试验)
刘英其. 中国卫生检验杂志2009年9月第19卷第9期
31
例8
血浆1,3-β -D-葡聚糖与抗深部白色念珠菌感染 药物疗效关系的实验研究
本文采用110只小鼠随机分成3组,空白对照组、模型组、氟康唑组,建立深 部白色念珠菌感染的动物模型。 定量检测血浆中1,3-β-D-葡聚糖的含量,双肾组织匀浆液培养计数菌落数。 用于探讨深部真菌感染小鼠血浆1,3-β-D-葡聚糖水平与抗真菌药物疗效的 关系。
4
感染之前定殖
侵袭性真菌感染

条件致病性真菌
念珠菌病 曲霉病 隐球菌病 其他

5
诊断方法



影像学 组织病理学/细胞学 培养 血清学 分子生物学方法:
传统的方法
Platelia Aspergillus ELISA Fungitell assay PCR(unavailable)

麦角固醇

B1, 3葡聚糖合成酶
葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁 中 1,3-β-D-葡聚糖占真菌壁成 分50%以上,是真菌细胞壁上 的特有成分 以1,3-β-糖苷键连接的葡萄 糖残基骨架作为主链 以分支状1-6-β-D葡萄糖残 基作为侧链
15
1,3-β -D-葡聚糖特性




对热极为稳定,高压121℃并不能使其灭活。在念珠菌 和曲霉菌细胞壁中含量较多,对G实验灵敏。 当真菌进入人体血液或深部组织后,经吞噬细胞的吞 噬、消化等处理后,(1-3)-β-D-葡聚糖可从胞壁中释 放出来,从而使血液及其它体液中含量增高。当真菌 在体内含量减少时,机体免疫系统可将其清除。 在浅部真菌感染中,(1-3)-β-D-葡聚糖未被释放出来, 故其在体液中的量不增高。 可用于检测念珠菌、毛孢子菌、曲霉菌、镰刀菌、卡 氏肺孢子菌 不可检测隐球菌、接合菌(根霉/毛霉等)
21
1,3-β-D-葡聚糖检测临床价值




早期诊断:侵袭性真菌感染增多且复杂,早期症状无 特异性,往往被原发病掩盖,病程长,发现较晚,死 亡率高。因此对深部真菌感染治疗成败的关键在于早 期诊断。 指导用药:快速确定真菌感染后,选择好治疗方案,有 针对性使用抗真菌类药物。为临床选用副作用小,疗 效高,价格适宜的药物提供准确的依据。 评价效果:应用抗真菌药物后,定期检测血浆中葡聚 糖浓度变化,评价选用药物的有效性。 监护病程:监护深部真菌感染易感人群的病发状态。 动态观察:易感人群,监测临床疗效。
28 刘芳,吴彤,等. 中国实验血液学杂志 Journal of Experimental Hematology 2009
例6
血浆1,3-β -D葡聚糖对深部真菌感染诊断的研究
统计学结果提示血浆葡聚糖水平对深部真菌 感染诊断的准确性优于单纯依靠各种标本真 菌培养或真菌涂片是否阳性对深部真菌感染 的判断。
以下情况可出现假阳性:


使用纤维素膜进行血透,标本或患者暴露于纱布或其 他含有葡聚糖的材料; 静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品; 链球菌血症; 操作者处理标本时存在污染; 使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食 物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也 可能造成假阳性。
各处理组不同时间点血浆1,3-β-D-葡聚糖的比较
组别 模型组 治疗前 4791.47±4415.99 治疗第1天 治疗第3天 治疗第5天
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曲霉菌半乳甘露聚糖(GM)
Figure 1-10 Noncompetitive sandwich method of immunoassay
23
例1
1,3-β-D-葡聚糖与循环半乳甘露聚糖的检测比较: 用于治疗和监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病


中性粒细胞减少症患者40例 (发展为曲霉菌病的高危人群) 该研究选择1,3-β-D-葡聚糖(BG)和半乳甘露聚糖(GM) 两个指标 用于监测中性粒细胞减少性成人曲霉菌病患者 BG和GM两项指标均可用于指导临床诊断和治疗真菌性疾 病, 但BG可早于GM升高. BG和GM联合检测用于曲霉菌病 的诊疗, 其特异性和阳性率均为100% . 结论: BG和GM联合检测有助于临床鉴定血液病患者是否合并真 菌感染, 并将单一试验假阳性给诊疗带来的影响降低到最小 .
12岁 348 pg/ml 2岁 374 pg/ml 14岁 491 pg/ml 13岁 754 pg/ml 14岁 947 pg/ml 94例(78%) <60 pg/ml 8例(7%) 60-79 pg/ml 18例(15%) >180pg/ml 高值 5例

结论
• 研究数据显示, 健康儿童的1,3-β-D-葡聚糖水平高于健康成人 . • 该指标用于儿童感染性疾病的诊断应慎重, 1,3-β-D-葡聚糖在儿童 群体的正常值区间有待进一步研究 .
对2007年1月至2009年4月的25例念珠菌菌血症患者、60例细菌菌血症患者、25 例念珠菌口咽定植者、20例健康体检者的血清1,3-β-D-葡聚糖含量进行比较分析。 念珠菌菌血症组的血清1,3-β-D-葡聚糖含量为115.2±42.3 ng/L,明显高于其他各 组,其他各组间的血清1,3-β-D-葡聚糖含量无显著差异。 结论:血清1,3-β-D-葡聚糖的检测是诊断念珠菌菌血症的有效指标。
25 P.Brian Smith, Daniel K.Benjamin,Jr, etc. CLINICALAND VACCINE IMMUNOLOGY,July2007
例3
半乳甘露聚糖和1,3-β-D-葡聚糖用于诊断血液肿 瘤患者烟曲霉菌感染敏感性较低 收集患者82例 侵袭性真菌感染组 22例 其他真菌感染组 镰刀菌/接合菌/丝孢菌感染 17 例 念珠菌感染 23例 对照组(血液肿瘤患者非真菌感染) 20例 414份血清标本检测GM 409份血清标本检测BG 侵袭性曲霉菌病患者在留取血清标本前已接受抗真菌药物治 疗 (包括聚烯类、氮杂茂类、棘球白素类等)
12
(1,3) - β- D-葡聚糖检测
13
真菌细胞膜、壁结构
mannoproteins
β1,3 b1,6 葡聚糖 磷脂 双分 子层
b1,3葡聚糖 合成酶
几丁质 麦角固 醇
羊毛固醇C-14去甲基化酶 14位还原和7-8位异构酶 14 角鲨烯环氧化酶
1,3-β -D-葡聚糖结构

糖蛋白类

葡聚糖 几丁质
D-阿拉伯糖醇

真菌特异的代谢产物


真菌 DNA 的检测
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临床诊断、拟诊的微生物学
1 合格痰标本直接镜检发现菌丝,且连续培养 ≥2次分离到同种真菌 2支气管肺泡灌洗液 (BALF)经直接镜检发现菌 丝真菌培养阳性 3 痰液或BALF直接镜检发现新生隐球菌 4 乳胶凝集法检测隐球菌荚膜多糖抗原阳性 5 G实验连续两次阳性 6 GM实验连续两次阳性

结论 对于血液肿瘤患者合并侵袭性真菌感染的诊断, BG的敏感度优于GM .
R.Y.Hachem, D.P.Kontoyiannis, etc. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Jan.2009
26
例4
1,3-β -D-葡聚糖和抗白色念珠菌细胞壁抗原的IgG 亚型抗体用于系统性念珠菌感染诊疗
24 Carmen Pazos, Jose Ponton, etc. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,Jan.2005

例2
儿童1,3-β-D-葡聚糖水平研究

120名儿童 7月—8岁 1,3-β-D-葡聚糖定量检测结果: 中位数 32 pg/ml 平均值 68±128 pg/ml
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侵袭性真菌感染的诊断标准 EORTC/MSG2008修订版

宿主因素 临床特征 病原学


真菌镜检 真菌培养 组织病理学检查 血清学检查方法(间接证据)

CSF隐球菌抗原阳性——确诊 GM-test, G-test——临床诊断
Clinical Infectious Diseases 2008; 46
16

“G”试验缘何而来?
17
定量检测1-3-β-D葡聚糖的方法
光度(浊度) 法 动态浊度法 终点浊度法 光度(显色) 法 动态显色法 终点显色法
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G 试 验 的 基 本 原 理

1-3-β-D-葡聚糖可特异性激活鲎的变形细胞裂解 物中的G因子,引起裂解物发生颜色变化,故称G试 验。
试验反应机理图:
6
真菌病实验室诊断主要内容
准确、快速检出真菌病原体 真菌镜检 真菌培养 组织病理 生理生化 血清学方法 分子生物学
7
镜检和培养方法

敏感性低
血培养:在肿瘤和血液病病人中,50%尸检 证实深部念珠菌感染的病例血培养阴性。


培养结果阳性仅表示存在某种真菌,区 分定植和感染困难 培养时间长 有些标本采集困难
27 N.Kondori, L.Edebo,etc. CLINICAL AND DIAGN源自文库STIC LABORATORY IMMUNOLOGY,Mar.2004
例5
血浆1,3-β -D葡聚糖检测对血液病患者侵袭性 真菌感染的诊断价值
本研究收集疑为IFI的血液病患者血浆标本162例,其中化疗后患者85例,造血干细 胞移植后患者77例。 按照欧洲癌症研究治疗组织及真菌研究组(EORTC/MSG)诊断标准,所有病例中有 确定诊断2例,临床诊断18例,拟诊75例,排除诊断67例。 结果表明:以20 ng/m l为诊断界值,G试验的敏感性、特异性、阳性预测值(PPV)和 阴性预测值(NPV)分别为75%、91%、72.4%和92.4%。
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