简述种子扩大培养的一般步骤
种子的扩大培养 (2)
了解基本概念、种子培养的一般过程及培养各阶段 的目的要求；
理解种子培养的各种影响因素； 掌握接种方法、种子质量控制方法、种子培养中的
问题分析及处理手段。
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第一节 基本概念
◆种子培养 指提供给种子适宜的生长繁殖条件，使种子能够 迅速生长成合格的菌体的过程。
◆种子的扩大培养 休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后， 再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质 量纯种的过程。
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3.菌丝结团 （现象？） ◆主要原因：①搅拌；②通气；③孢子量小；④
泡沫大等 ◆处理方式：分析原因，对症解决
4.种子罐泡沫大 ◆主要原因：①玉米浆的质量有波动； ②消沫剂的质量有问题； ◆处理方式：间歇搅拌，提高罐压，加大空气翻
腾液面压泡，待菌丝长起来后泡沫即可减小
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养易于被菌体直接吸收和利用，成分适当，氮源、维 生素含量较高。
②营养成分要尽可能和发酵培养基接近，且略稀 薄为宜。 （2）培养条件
①温度 温度高，细胞中的生化反应快，生长速率 快；菌体蛋白质、核酸等对温度较敏感，温度过高可 能被破坏。微生物生长温度在-10～95℃。发酵菌株 生长最适温度为20～40℃。
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②pH值 影响微生物对营养物质的吸收、酶的形成及 其活力等。大多数为pH4～9，少数在pH<2或>10。
③通气量 保证菌种代谢对氧的需求，提高种子的质 量。
④搅拌 保证溶氧及种子罐内各处条件均一，利于种 子的培养。可避免菌丝结团、粘壁等现象发生。
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二、常见问题及其处理手段
1.种子生长缓慢： ◆主要原因：①原材料质量的波动； ②接种孢子量不足；
利用两端压力差，液体从高压流向低压的接种方法。 ①孢子悬液接种 ②种醪接种
6 种子制备及扩大培养
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3+湿度
制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量 有较大的影响。
相对湿度 （%） 15~19 25~30 40~45 活孢子计数 （亿/支） 1.2 2.3 5.7
斜面外观 上部稀薄、下部稠略黄 上部薄、中部均匀发白 一片白，孢子丰富，稍皱
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3+湿度
例如土霉素生产菌种龟裂链霉菌，孢子制备时发现：
种子制备及扩大培养
一、定 义
将保存的生产菌种接入试管斜面 活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐 逐级放大培养过程而获得一定数量和 质量的纯种。
1
（一）种子的要求
性能： 活力旺盛、生理形状稳定； 数量： 能满足大容量发酵罐的要求； 无杂菌污染； 保持稳定的生产能力。
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（二）种子的制备过程
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1.实验室阶段
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2.种龄与接种量
种龄需经过多种实验来确定。
嗜碱性芽孢杆菌生产碱性蛋白酶， 12小时最好。
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2.种龄与接种量
大接种量可以缩短发酵罐中菌 丝繁殖的时间，使产物的形成 提前到来，并可减少杂菌的生 长机会。
接种量过大会引起溶氧不足，影响 产物合成；而且会过多移入代谢废 物，也不经济；
过小会延长培养时间，降低发酵罐 的生产率。
(与目的产物的产量有一定关联的)酶活力
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谷氨酸种子制备举例
2， 一级种子培养 目的：大量繁殖活力强的菌体， 培养基组成应以少含糖分，多含有机氮为主，培养 条件从有利于长菌考虑。 (1) 培养基组成 葡萄糖 2.5％ 尿素 0.5％ 硫酸镁 0.04％ 磷酸氢二钾 0.1％ 玉米浆 2.5~3.5％(按质增减) 硫酸亚铁、硫酸锰 各2ppm PH 7.0
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确定种子罐级数需注意的问题
6 种子的扩大培养【发酵工程】
C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种：
可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡 培养，获得菌丝体，作为种子。
例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。
D、不产孢子的细菌： 生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32C，培养18—24小时，即可移入250 mL
6 种子扩大培养
种子扩大培养概念：
指将保存在砂土管、冷凉干燥管中处休眠状态的生 产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子 耀逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种过程。
目前发酵灌容积已达几十或几百立方米。如按10 ％的种子计算，就要投入几或几十立方米的种子，要 从试管中的菌种逐级扩大为生产用种子，是一个由实 验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不 同的生产品种和菌种种类而异。
MYPG培养基：3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克 蛋白胨、10克葡萄糖和20克琼脂于l升水中。
二、生产车间种子制备
种子罐培养原则： 采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐
等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体 在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
接种方法：
孢子悬浮液：一般采用微孔接种法。 摇瓶菌丝体种子：可在火焰保护下接入种子罐或采用压 差法接入。 种子罐之间或发酵罐间的移种：主要采用压差法，由种 子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降 至零，否则会引起染菌。
1、生长快的细菌，种子用量少，种子罐相应也少。
例如：谷氨酸生产中，茄子瓶种子接入种子罐子 32C培养7一10小时，即可按入发酵罐作为种子，这称为 一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。
2、生长较慢的菌种，种子用量大，种子罐相应也多。
种子扩大培养
对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以 用摇瓶液体培养法。孢子接入含液体培养基的摇瓶 中，恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。 如：用灰色链霉菌生产链霉素
用卡那链霉菌生产卡那霉素
对于不产孢子的细菌，生产上一般采用将试管 斜面菌种接入茄瓶斜面或摇瓶培养 如：谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸
4，酶活力 种子液中某种酶的活力，与目的产物的 产量有一定的关联。
如土霉素发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关 系，可通过测定种子液中淀粉酶的活力判断种子质量
二、影响种子质量的因素
（一）影响孢子质量的因素
1、培养基
构成孢子培养基的原材料，其产地、品种、加工方法和用 量都会对孢子的质量造成影响 如： 四环素、土霉素生产中，配制产孢斜面培养基用的 麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢 子质量均有一定影响。 制备霉菌用的大米，其产地、颗粒大小、均匀程度不 同，孢子质量也不同。
2、培养温度和湿度 温度： 温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。 如龟裂链霉菌在高于37˚C培养时，孢子接入 发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前， 菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般各生 产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。
湿度：制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量 和质量有较大影响。
虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定，但 也与所选用工艺条件有关。 如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体 的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
2）各级种子的移种方法
孢子悬浮液一般采用微孔接种法接种，摇瓶菌丝种子 可在火焰保护下接入种子罐。 种子罐与发酵罐间的接种方式主要采用差压法
简述种子扩大培养的一般步骤
简述种子扩大培养的一般步骤种子扩大培养是一种常用的细胞培养技术，用于从少量的起始细胞种子扩大培养大量的细胞。
一般情况下，种子扩大培养的步骤包括以下几个方面：1. 选择合适的培养基，根据所培养细胞的特性和需求，选择适合的培养基。
常见的培养基有DMEM、RPMI-1640等，可以根据需要添加适当的补充物如血清、生长因子等。
2. 准备种子细胞，从原始培养物中取出一定数量的细胞作为起始种子。
细胞可以通过离心、洗涤等方法获得。
3. 细胞计数和调整，使用细胞计数仪对种子细胞进行计数，以确定种子细胞的浓度。
根据需要，可以通过离心和重新悬浮的方式调整种子细胞的浓度。
4. 接种种子细胞，将调整后的种子细胞悬浮液加入到培养皿或培养瓶中。
种子细胞的密度应根据所需的扩大倍数和培养容器的大小进行合理调整。
5. 细胞培养条件的控制，将接种的培养皿或培养瓶放入细胞培养箱中，控制培养箱的温度、湿度和二氧化碳浓度等环境参数，以提供适宜的生长条件。
6. 细胞生长监测，定期观察和记录细胞的生长情况，包括细胞形态的变化、细胞数量的增加等。
可以使用显微镜观察细胞形态，也可以通过细胞计数仪等设备对细胞数量进行监测。
7. 细胞传代，当种子细胞达到一定的生长程度时，可以进行细胞传代，即将细胞分离并重新接种到新的培养皿或培养瓶中。
传代的目的是避免细胞过度密集和资源耗竭，以保证细胞的健康生长。
8. 细胞收获，根据需要，可以在细胞达到预期生长程度后，将细胞收获下来进行后续的实验或应用。
收获细胞时，可以使用适当的方法如离心、洗涤等将细胞从培养皿或培养瓶中分离出来。
以上是种子扩大培养的一般步骤。
具体的操作细节可能会因细胞类型、培养条件和实验目的的不同而有所差异。
在进行种子扩大培养时，需要严格控制培养条件，遵循无菌操作规范，以确保细胞的健康生长和培养的成功。
简述种子扩大培养的一般流程
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种子扩大培养的一般步骤
种子扩大培养的一般步骤
种子扩大培养是指通过培养一定数量的种子，生产大量的细胞或微生物的过程。
它是微生物或细胞生产工艺中的重要步骤，能够保证生产规模的扩大和产品的稳
定性。
种子扩大培养的一般步骤如下。
第一步是种子的制备。
在种子扩大培养之前，需要从已有的种子中选取优良的种子，将其经过预处理后进行制备。
预处理的方法可以包括冷冻保存、干燥保存等。
制备好的种子需要进行质量检测，以确保种子的质量符合要求。
第二步是种子的扩增。
在种子扩大培养过程中，需要将制备好的种子接种到适当的培养基中，并进行适当的处理，以促进种子的生长和繁殖。
常见的处理方法
包括控制培养基的pH值、添加适量的营养物质等。
扩增过程需要进行一定时间的
培养，以便种子充分生长繁殖。
第三步是种子的收获。
种子扩大培养完成后，需要进行收获。
在收获的过程中，需要进行分离、过滤、浓缩等操作，以获取目标产物。
此外，还需要对产物进行纯化和检测，以确保产物的质量符合要求。
总之，种子扩大培养是微生物和细胞生产工艺中不可或缺的步骤，对于产品的质量和产量都有着重要的影响。
在实际应用中，需要根据具体情况进行调整，以
确保最终的产物能够满足要求。
生产工艺第二章 种子制备 第三节种子的扩大培养
第三节 种子的扩大培养
此菌丝即可移到发酵罐作为种子，这称为二级种子罐 扩大培养，也称三级发酵。一般50m3发酵罐都采用三级发 酵。又如生长更慢的菌种，链霉素生产菌种灰色链丝菌， 一般采用三级种子罐扩大培养。在小型发酵罐（5～30L） 中进行试验时，也有采用直接孢子或菌丝体接入罐中发酵 的，这称一级发酵。
第三节 种子的扩大培养
（2）霉菌孢子的制备 霉菌的孢子培养，一般以大米、 小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基。这是由 于这些农产品中的营养成分较适合霉菌的孢子繁殖，而且 这类培养基的表面积较大，可获得大量的孢子。霉菌的培 养一般为25～28℃，培养时间为4～14天。
（3）细菌培养物的制备 细菌的斜面培养基多采用碳 源限量而氮源丰富的配方，牛肉膏、蛋白胨常用作有机氮 源。细菌培养温度大多数为37℃，少数为28℃，细菌菌体 培养时间一般1～2天，产芽孢的细菌则需培养5～10天。
第三节 种子的扩大培养
3．种子质量的判断 由于菌种在种子罐中的培养时间较短，可供分析的参数 较少，使种子的内在质量难以控制，为了保证各级种子移种 前的质量，除了保证规定的培养条件外，在过程中还要定期 取样测定一些参数以观察基质的代谢变化及菌丝形态是否正 常。在生产通常测定的参数为：①pH；②培养基灭菌后磷、 糖、氨基氮的含量；③菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 （色素、颗粒等）；④其他参数，如接前抗生素含量、某种 酶活力等。 用酶活力来判断种子的质量是一种新的尝试，如土霉素 发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关系。从表 2-4可以看出如种子液化淀粉能力强即淀粉酶活力高的，则 接入发酵罐后土霉素发酵单位也高，反之则低。因此，在选 用种子时，用测定种子液中淀粉酶的活力来判断种子质量的 方法是可取的。
种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可 减少由于多次移种而带来染菌的机会。但也必须考虑尽量 延长菌丝体（培养物）在发酵罐中生物合成产物的时间， 缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发 酵罐的生产率[产物/(ml·h)]。
简述种子扩大培养的一般步骤 -回复
简述种子扩大培养的一般步骤-回复种子扩大培养是一种将少量微生物种子扩大到足够大规模的过程，旨在提供足够数量的微生物群体来满足后续实验、生产或其他应用的需求。
以下是一般的种子扩大培养的步骤，以帮助读者了解如何进行该过程。
第一步：选择合适的培养基选择适合微生物生长和扩大的培养基是种子扩大培养的关键。
适当的培养基应提供充足的营养物质，并满足微生物所需的生长条件。
常用的培养基包括肉汤、葡萄糖盐水、大豆蛋白胨等。
第二步：准备种子培养物在进行种子扩大培养之前，需要从已有的培养物中选取足够的种子来投入到扩大培养中。
为了保证选取到的种子是纯种的，可以通过进行单克隆分离、传代培养等方法进行处理。
此外，在选取种子时，应注意培养物的活性、稳定性和适用性。
第三步：接种种子培养物将选取的种子投入到预先准备好的培养基中。
这个步骤中，可以根据需要进行稀释，以及添加其他辅助物质，如辅菌素、酵母提取物等。
然后，将培养基和种子充分混合，使种子均匀分布在培养基中。
第四步：培养条件调节为了促进种子的生长和繁殖，在进行扩大培养之前，需要对培养条件进行调节。
常见的调节因素包括温度、pH值、溶氧量和搅拌速度等。
这些因素的调节应根据具体微生物的要求和实际情况进行。
第五步：扩大培养将接种好的种子培养物置于培养器中并进行适当的培养。
培养时间和培养条件的选择取决于所需扩大的规模和种子的特性。
一般来说，种子的扩大培养时间在24到72小时之间，取决于微生物的生长速率和繁殖能力。
第六步：评估培养效果在培养结束后，需要对培养物进行评估，以确定种子扩大培养的效果。
通过检测细菌总数、活菌数、菌落形态、菌落大小等指标，可以评估培养的结果。
此外，还可以进行其他相关的生化和生物学分析以获取更详细的信息。
第七步：收获和保存一旦培养物达到了所需的数量和质量，就可以进行收获和保存。
此时，可以通过分装或冷冻等方法将培养物保存起来，以备后续实验或应用使用。
通过以上的步骤，可以实现对微生物种子的有效扩大培养，得到足够数量和质量的微生物群体。
种子扩大培养
选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基； 营养上要易于被菌体直接吸收和利用； 营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要 高
营养成分要尽可能与发酵培养基相近。
6.2.2培养条件
（1）温度 温度对多数品种斜面孢子质量有显著 的影响。 如土霉素生产菌种在高于37˚C培养时， 孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基 氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等 现象。 一般各生产单位都严格控制孢子斜面的培 养温度。
2，生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或 MYPG培养基（培养基配制：3克麦芽浸出物，3克 酵母浸出物，5克蛋白胨，10克葡萄糖和20克琼脂 与升水中）的斜面上，于4℃冰箱内保藏。每年移 种3-4次。将保存的酵母菌种接入含10ml麦芽汁的 试管中，再于25℃培养2-3天后，再扩大至含有 250-500ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于 25℃培养2天后，移种至含有5-10L麦芽汁的卡氏培 养罐中，于15-20℃培养3-5天即可作含100L麦芽汁 的发酵罐种子。从三角瓶到卡氏培养罐培养期间， 均需定时摇动或通气，使酵母菌液与空气接触，以 有利与酵母菌的增殖。 麦芽汁试管斜面→麦芽汁试管→麦芽汁三角瓶→麦 芽汁卡氏罐种子罐
舒琴， 林产化学与工业，2004
镜检：24小时多个杆菌首位相连成线形，处于繁殖旺盛期 30小时开始出现芽孢
4，接种量
接种量：是指移入的种子液体 积和接种后培养液体积的比例。 接种量的大小决定于生产菌种 在发酵罐中生长繁殖的速度， 采用较大的接种量可以缩短发 酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时 间，使产物的形成提前到来， 并可减少杂菌的生长机会。
种龄 培养条件
培养基
6.2.1培养基
生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其 主要原因是原材料质量波动。
菌种扩大培养技术
谷氨酸菌斜面
赖氨酸菌斜面
与
三角瓶培养
三角瓶培养
菌
种
特
30m3种子罐培养
3m3种子罐培养
性
有 关
300m3发酵罐发酵
30m3种子罐培养
300m3发酵罐发酵
（三）种子扩大培养的阶段
实验室种子制备阶段
生产车间种子制备阶段
实验室种子制备阶段一般包括斜面种子的培养、实验室内 进行的固体或液体培养基的种子扩大培养。 在无菌操作条件下，将试管斜面接种到摇瓶中，经恒温振 荡培养形成大量菌体的过程，称为摇瓶培养。
实例二： 葡萄糖 45g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L ， 磷酸二氢钾 1.5 g/L ，糖蜜 125g/L ， 玉米浆 250g/L，纯生物素18.8 μg/L， 硫酸亚铁、硫酸锰 各2ppm ，实消， 121℃保温10min，实消前不需调节pH， 实消降温后用液氨调节至pH7.0。
2. 培养条件
接种量 培养温度
0.03~0.5% 32~34℃
种子罐有夹套或盘管或列管等装置。 采用循环冷却水进行降温。
搅拌转速
150~200 r/min
根据种子罐容积和搅拌叶径而定，通常容积大的种子罐 设计搅拌速度会小一些。
通气比
0.15~0.44 vvm
vvm ：1m3液体1min通入空气的体积。
OD 650 值
1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
1
3
5
7
9 11 13
培养时间（小时）
流加液氨培养 添加尿素培养
实例一与实例二的培养结果， 说明了什么问题？
无菌空气
5. 二级种子接入发酵罐的操作
【精选】第五章种子扩大培养
二、生产车间种子制备
以实验室制备的孢子或摇瓶营养细胞做 种子，经种子罐扩大培养后，满足发酵罐对 种子的要求。
种子罐培养原则：
采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐 等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体 在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
接种方法：
摇瓶菌丝体种子： 可在火焰保护下接入种子罐或 采用压差法接入。
一级种子接入发酵罐发酵称为二级发酵 二级种子接入发酵罐发酵称为三级发酵
。。。。。。。
依次类推 可知发酵的级数=种子级数+1
种子罐级数的意义：
种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制， 并可减少移种带来染菌机会。
但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时 间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时 间，以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数 不宜过少。
C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种
可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡 培养，获得菌丝体，作为种子。
例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。
D、不产孢子的细菌 生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32℃，培养18-24h，即可移入250mL摇瓶
液体培养基，32℃培养12h，即可作种子罐种子。 例如：谷氨酸棒状杆菌。
（3）将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中， 就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率， 并且也有利于减少染菌的机会。
（4）对于不同产品的发酵过程来说，必须根 据菌种生长繁殖速度快慢及生产的规模决定种子 扩大培养的级数。
种子液(几或几十立方米)
按10%接种量
发酵罐(几十或几百立方米)
由实验室制备到车间生产 的过程
种子制备的过程大致可分为：
实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段
种子的扩大培养
液体深层种子罐从底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成 微小气泡以促进氧的溶解。该法容易按照生产菌种对于代谢 的营养要求一级不同生理时期的通气、搅拌、温度与培养基 中氢离子等条件，选择最佳培养条件。
四、种子质量的控制
（二）影响种子质量的因素及控制
培养基
（1）营养成•分种适龄合：种是子指培种养子的罐需中要培养的菌丝体开始移入
种子培养要求一定量的种子，在适宜的培养基中，控制一定的培养条 件和培养方法，从而保证种子正常生长。
工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类型。
❖静置培养即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养。 ❖通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给 空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称好气培养法。
（1）放线菌孢子的制备
a) 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含 有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白 胨和一些无机盐等。
b) 碳源和氮源不要太丰富（碳源约为1％，氮源不超过0.5 ％），干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。
c) 放线菌斜面的培养温度大多数为28℃，少数为37℃，培 养时间为5～14天。
菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生 长，延滞期短。
菌种生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率和 种子培养液的特性等符合要求。
菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求。 无杂菌污染，保证纯种发酵。 菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。
二、种子制备的过程
从工业发酵的角度来说，种子制备分成两个 阶段：
摇瓶培养基配方和培养条件与种子罐相似。
常采用母瓶、子瓶两级培养。种子培养基要求比 较丰富和完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有 利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓， 子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近于种子罐的 培养基配方。
第三章 种子扩大培养
• 4．生产上的防止菌种的变异和衰退，采取以下措施 • （1）适宜的保存方法：主要原理是利用低温、干燥、
真空；如斜面、砂土、矿物油。 • （2）限制使用期：斜面1-2月移植；砂土1-2年。 • （3）减少传代次数，限制菌种的开启次数，为防染菌 • （4）定期分纯：必用单细胞或单孢子的分离，分离后
第三章 种子扩大培养
1
• 1、种子扩大培养：将保存在砂土管，冷冻干燥管中处 于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经扁 瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质 量的纯种的过程。
这些纯种培养物称为种子。
• 2．种子培养任务：保持生产菌种的优良生产性能，得 到比较纯净的种子，菌健壮，还要有足够的量，以供 大规模生产用。
种量0.1-5%，酵母菌10%，霉菌放线菌7-15%（但霉菌也有少 的，如制霉菌素，Nystatir只用1%）
②根据种子质量：活力高则接种量少 • 现相当多的产品采用大接种量，如庆大霉素发酵的接种量达20-
25%， • 大接种量优点和缺点:
15
• 优点： • a.可缩短发酵罐中菌的生长期，则产物合成的时间可提前，则
• 种子培养质量的好坏，关系到发酵产物的产量、质量。 • 3．生产菌种的基本要求 • 一个发酵产物可有多种产生菌，但产生菌不等于生产
菌，作为生产菌要有一定条件和要求：
2
• （1）高产稳产性能：合成能力高，遗传性相对稳定（遗传特 性包括生产性能，生理特性，形态特性）菌种不衰退、难变异。
• （2）要求较粗放：较易培养，生长繁殖较快，可利用比较多 种的原料，此原料要求经济易得。培养快表现在发酵周期短， 生产工艺简便——用一般的生产方法可生产，易提炼，要有一 定抗污染的能力，包括抗杂菌，抗噬菌体。
第四节种子扩大培养一种子扩大培养的任务工业生产规模的
适宜时间：以菌体处于生命力极为旺盛的对数生长期（exponential phase），且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为适宜。
嗜碱性芽孢杆菌（Bacillus alkalophilus)生产碱性蛋白酶（alkaline proteinase/protease） ，培养１２小时接种，酶活最高。
一般相对湿度40~45%时孢子数量最多，孢子颜色均匀，质量较好。
培养时间和冷藏时间对种子和孢子形成都有影响。
如土霉素菌种孢子斜面培养四天左右，即于4℃冰箱保存，发现冷 藏7~8天菌体自溶，而培养五天以后冷藏，20天未发现自溶。
链霉素生产菌，斜面孢子在6 ℃冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一 个月降低8%。
二. 种子扩大培养(制备)阶段
实验室种子的制备： 生产车间种子制备:
A 实验室种子的制备：
e.g 产黄青霉菌(P.chrysogonum)
原始菌种 斜面试管 获得孢子
250ml 茄子瓶（大米或小米） 25 ~28 ℃ ，4~14天
成熟（在真空下抽去水分，使水分含量在10%以下
，于4 ℃冰箱保存）。
体培养基的摇瓶中，于摇床上培养，获得菌丝体，作为种子。
不产孢子的细菌，如生产谷氨酸的棒状杆菌 （Corynebacterium）、短杆菌（Brevibacterium），生产上一般 采用斜面营养细胞进行扩培，再转入液体摇瓶培养，获得细胞 悬液再接种。
e.g. Glutamic acid-producer：（谷氨酸生产菌） 原始菌种（出发菌种） 固体试管斜面（32 °C ，18~24小时）
而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率［产物／ml·h］。
发酵——种子的扩大培养
发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
二、实验室阶段
1、培养物选择的原则
目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终 的培养物可分为两类：
对于不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培 最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培 养。
种子异常分析 菌种生长速度，过快或过慢 菌丝结团 菌丝粘壁
本章小节：
了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念 理解种子扩培的目的和要求 掌握控制种子质量的基本方法和手段
感谢聆听！
培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培 养12小时。
培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基
一级种子质量要求
种龄：12h pH值：6.4± 0.1 光密度：净增OD值0.5以上
残糖：0.5％以下 无菌检查：(-)
噬菌体检查： (-)
镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐
1、斜面 (AS1.299)
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2
培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细
生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次
2. 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%，硫酸镁0.04% pH7.0
培养条件：27℃，40小时 接种量：200亿孢子/吨 目的：长菌体 4、二级种子 培养基：同上 培养条件：27℃、10-14小时 接种量：10%
发酵工程第五章 种子扩大培养
• ④酶活力高。（因为菌丝体密度大） • ⑤对于固体培养，通常用于固体发酵，由于产物 浓度大，易于分离，可以有效的降低产品分离成 本。
• 缺点：
• （1）生产劳动强度较大，占地面积大，不宜自 动化生产。 • （2）容易污染其他霉菌。 • （2）周期长。 • （3）培养过程中环境条件控制较难。
2、液体培养 • 培养基配制成液体，接种培养。
第五节 种子制备过程举例
一、谷氨酸生产的种子制备 制备过程 斜面菌种
→一级种子培养
→二级种子培养
→发酵
1、斜面 (AS1.299)
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2
培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细 生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次
• 种子移种方法 孢子悬浮液采用微孔接种法；摇瓶菌丝 体种子可在火焰接种或差压法；种子罐之 间或发酵罐间接种采用差压法
第四节 影响种子质量的因素
一、种子质量标准
发酵工业生产上常用的种子质量标准，大致有 如下几个方面：
• • • • •
细胞或菌体 生化指标 产物生成量 酶活力 此外，种子应确保无任何杂菌污染
二、影响种子质量的因素
（一）影响孢子质量的因素
（二）影响种子质量的因素
（一）影响孢子质量的因素 培养基
培养条件
培养时间和冷藏时间 种龄 接种量
（二）影响种子质量的因素 培养基
培养条件
种龄 接种量
• 种龄：种龄(seed age)指种子罐中培养的种子开始 移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 • 适宜时间：以菌体处于生命力极为旺盛的对数 生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时， 较为适宜。 • 接种量：接种量(seed volume)是指移入的种子的 体积和接种后培养液的体积比。 • 接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中的繁 殖速度。
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简述种子扩大培养的一般步骤
种子扩大培养是一种常用的微生物培养方法，用于从初始培养物中扩大微生物数量，以便进行后续实验或工业应用。
一般而言，种子扩大培养的步骤包括以下几个方面：
1. 培养基准备，选择适当的培养基，根据目标微生物的需求添加合适的营养物质和pH调节剂。
培养基的配制需要严格按照配方和操作规程进行，以确保培养基的质量和一致性。
2. 种子接种，从初始培养物中选择合适的菌株或菌落，通过无菌技术将种子接种到含有适当培养基的培养容器中。
接种时需要注意保持无菌操作，避免外界的污染。
3. 培养条件调控，根据目标微生物的生长特性和要求，调节培养条件，包括温度、pH值、氧气供应和搅拌速度等。
这些条件的调节可以促进微生物的生长和代谢活性，从而实现种子的扩大。
4. 培养过程监测，在培养过程中，需要定期监测微生物的生长情况，可以通过测量生物量、菌落形态观察、代谢产物测定等方法进行。
监测结果可以帮助调整培养条件，以达到最佳的生长效果。
5. 收获和处理，当微生物达到预定的生长状态时，可以进行收获。
收获方法根据具体情况而定，可以选择简单的离心沉淀、滤液
或离子交换等方法。
收获后的种子可以进行后续的实验或工业应用。
6. 清洁和消毒，在种子扩大培养结束后，要进行培养容器和设
备的清洁和消毒工作，以防止微生物的交叉污染和感染。
总结起来，种子扩大培养的一般步骤包括培养基准备、种子接种、培养条件调控、培养过程监测、收获和处理，以及清洁和消毒。
这些步骤的严格执行可以确保种子扩大培养的成功，并提供足够的
微生物种子用于后续实验或工业应用。