质粒DNA的制备
质粒DNA制备
另外，HB101及其它含有endA+基因型 的菌株表达中的核酸内切酶A，在煮沸 时不能完全失活， 在以后操作中， 只要有Mg2+存在(如内切酶反应缓冲液)， 核酸内切酶A就可将质粒DNA降解，而 影响实验结果。
若一定要用煮沸法提取这类菌株的质粒 DNA，不管是大量还是小量制备，必须 用酚、氯仿反复抽提几次．以去除该 酶．
半乳糖苷酶
X-gal
X + gal
无色
蓝色产物 半乳糖
若在含有X-gal的培养剂中，在乳糖操纵 子(lac operon)诱导物异丙硫半乳糖苷 (isopropylthiogalactoside，IPTG)的作 用下，细菌合成半乳糖苷酶，分解X—gal， 此菌落成为蓝色。
若lacZ基因被外源DNA片断插入而破坏， 则不能制造半乳糖苷酶，菌落为白斑。
6. 限制性内切酶单一切口
在质粒复制子以外的部位具有一种或多 种限制性内切酶的单一切口，便于外源 基因的插入。
若这种单一的限制性内切酶位点处于选 择标记基因的内部，外源基因片断插入 后会导致该基因失活便于筛选。
三、常用质粒载体
1. pBR322
pBR322是一种使用最广泛的质粒，全长 为4 363bp，由3种野生型质粒成分组成， ampr基因来自pRSF2124，tetr来自pSCl01， 复制起始点来自pM9。核苷酸的序次号， 以EcoRI序列GAATTC的第一个T为第一个核 苷酸。
在一些细胞中，一种质粒处于优势，而在 另一些细胞中，与之不相容的另一种质粒 却占尽上风。细菌生长几代之后，占少数 的质粒将会丧失殆尽，在原始细胞的后代 中可含有两种质粒中的任意一种，但不会 兼而有之。
通过检查不同质粒在同一细胞中共存的能 力，可以把它们分为若干不相容组。带有 相同复制子的质粒属于同一不相容组，而 带有不可互换成分的复制子的质粒则属于 不同的不相容组。现已发现30多个这样的 不相容组。
质粒dna的提取步骤
质粒dna的提取步骤质粒DNA的提取步骤质粒DNA是细菌中的圆形DNA分子，与细胞染色体不同，可以在细菌中自主复制。
质粒DNA的提取是一项常规实验，可用于高效地分离纯化质粒。
在进行质粒DNA提取之前，需要准备一些必要的试剂和设备。
材料和试剂：1.细菌培养物2.经过钙离子或热处理的TTES缓冲液（10mM Tris-HCl [pH8.0]，1mM EDTA [pH8.0]，25%蔗糖溶液）3.蛋白酶K处理缓冲液（50mM Tris-HCl [pH8.0]，100mM NaCl，10mM EDTA [pH8.0]）4.醇5.异丙醇6.以太7.加拿大CFII列的紫外灯8.恒温振荡器步骤：1.收集培养物将培养物用无菌工具收集到1.5毫升离心管中。
通过离心将细胞沉淀到离心管底部。
2.细胞溶解添加500 μl TTES缓冲液到离心管中，并用Vortex或20号钢珠打破细胞壁。
将离心管放在水浴中恒温振荡器中，30分钟以70 rpm。
3.移除细胞碎片离心管离心2分钟，将浮于上层的无菌细胞断片去除（上清），移至另外的离心管。
4.蛋白酶K处理向上清中加入100 μl蛋白酶K处理缓冲液和15μl蛋白酶K，室温下静置10分钟，然后加入200 μl醇混合液（3：7乙醇：异丙醇），与上清混合均匀。
5.沉淀DNA的制备离心管离心2分钟，然后将上清倒出。
沉淀物将采用70%的醇作为清洗液，在沉淀物上滴入1 ml的70%醇，在打破后的沉淀物中短暂的搅拌。
离心管轻轻晃动，浮于上层的除去，再加1ml的70%酒精，将沉淀物中混合在一起。
6.沉淀物最佳溶解将沉淀物在无尘工作台上空气干燥（大约10~15分钟），直到酒精挥发。
将沉淀物用10毫升 TE缓冲液（10mM Tris-HCl [pH8.0]，1mM EDTA [pH8.0]）悬浮，经缓慢抽气镇静。
7.检测提取的DNA通过紫外光下的可见目标，如果质粒DNA等目标脱胶，就可以看到了。
通常设定为 OD260/OD280值为1.8-2.0。
碱裂解发制备质粒DNA原理
碱裂解发制备质粒DNA原理碱裂解法是一种常用的制备质粒DNA的方法，其原理是通过使用碱性溶液将细菌细胞膜和核酸中的蛋白质进行裂解，从而分离出质粒DNA。
下面将详细介绍碱裂解法的原理和步骤。
碱裂解法的原理是利用强碱溶液（如NaOH或KOH）对细菌细胞进行裂解，同时可去除细胞膜及其上的蛋白质，使质粒DNA从细胞内部释放出来。
此外，碱性环境可以使DNA表现为单链结构，这使得DNA与其他形式的核酸（如RNA和DNA-蛋白复合物）有所区别，有助于后续的提取和纯化。
制备质粒DNA的碱裂解法的步骤如下：1.菌液培养：选取含有质粒的细菌菌株，在适宜的培养基中培养至合适的生长期。
2.收获细菌细胞：采用离心等方法将细菌细胞从菌液中收集。
通常使用蒸馏水进行细菌菌液的稀释，以确保细菌能够在蒸馏水中悬浮均匀。
3.清洗细菌细胞：使用理化方法（如洗涤剂、EDTA、乙醇等）将细菌细胞洗净。
这一步骤的目的是去除掉附着在细菌细胞表面的杂质，减少对后续步骤的影响。
4.裂解细菌细胞：将清洗后的细菌细胞悬浮在碱性溶液（如0.2MNaOH）中，使其完全裂解。
碱性溶液的作用是破坏菌细胞膜结构，去除蛋白质，并使DNA变为单链结构。
5. 中和反应：在细菌细胞裂解后，添加中和剂（如2 M Tris-HCl, pH 7.4），将溶液的pH值迅速调整到酸性，以中和碱性溶液中的氢氧根离子。
6.沉淀DNA：通过离心将细菌细胞碎片和其他残余物沉淀下来，将上清液（含有质粒DNA）收集。
7.聚集DNA：通过旋转浓缩、加入盐类或乙醇等方法，将质粒DNA聚集成颗粒状沉淀。
8. 洗涤和纯化：使用缓冲液（如低浓度Tris-HCl或盐溶液）洗涤和纯化质粒DNA，去除残余的盐和杂质。
9.确定DNA浓度和纯度：通过分光光度法或凝胶电泳等方法，测定质粒DNA的浓度和纯度，以确定提取的质粒DNA是否适合下游实验。
总之，碱裂解法通过利用强碱溶液裂解细菌细胞，去除蛋白质，使质粒DNA释放出来，并通过离心、沉淀、洗涤和纯化等步骤，得到高纯度的质粒DNA。
实验四 质粒DNA的提取
实验四质粒DNA的提取、电泳检测和酶切一、实验目的学会用碱裂解法小量制备质粒DNA。
二、实验原理质粒DNA是存在于细菌中的环状小分子DNA，不同于长链大分子的基因组DNA，游离于细胞质中。
由于细胞中的RNA可以被降解，大分子DNA可与细胞碎片一起沉淀而与质粒DNA分离。
质粒DNA的提取常用碱裂解法、煮沸法、SDS法、Triton-溶菌酶法等，其中以碱裂解法最为常用。
本方法有质粒DNA产量高、快速等优点。
其原理为：在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液调时，染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起；当K+取代Na+时，生成不溶的PDS, 这些复合物从溶液中沉淀下来。
通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。
混杂的RNA可用RNA酶（RNAase）消除。
再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质。
三、实验材料含有质粒pUC19的大肠杆菌菌株DH5a。
四、实验器具、药品试剂A、实验材料：•DH5a受体菌•pUC19B、实验仪器•高压灭菌锅•超净工作台•恒温摇床取•台式离心机(冷冻或非冷冻式)•旋涡振荡器•电泳仪•凝胶成像系统•培养用试管•量筒•冰盒•微量取液器（2ul，20ul，150ul，1000ul）•吸管头若干（2ul，20ul，150ul，1000ul）•EP管若干•一次性手套若干C、溶液药品：•LB培养基•氨苄青霉素(Amp,100 mg/ml)•20%SDS• 4 M NaOH•3M NaAc (pH5.2)•异丙醇•TE缓冲液(pH8.0)•RNAase A(10 mg/ml)•70%乙醇•无水乙醇•75％乙醇，•NEB 标准分子量片段(1kb DNA Ladder)，•Eco R I及Dra I（Dra II？）限制性核酸内切酶（TaKaRa），•Eco RI酶解缓冲液(10×H buffer)•10%琼脂糖•电泳缓冲液•EB染色液•溶液I－GET缓冲液：50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA，25 mMTris-HCl pH8.0。
质粒DNA提取及纯化
质粒DNA 提取纯化、DNA 电泳检测实验目的1．掌握质粒DNA 的制备的原理和方法2．了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离二、实验原理1．质粒DNA 的制备方法质粒(Plasmid) 是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA 分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。
细菌质粒大小介于1～200Kb 之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA 。
质粒DNA 的制备包括3 个步骤：①培养细菌，使质粒DNA 大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA 。
主要方法包括：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS ；煮沸裂解法：沸水煮沸40 秒；SDS 裂解法：10%SDS ，一般用于质粒大量提取。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA 的用途进行选择。
本实验选择碱裂解法提取质粒DNA 。
2．碱裂解法质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH 值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA 变性，去除变性条件又可以使DNA 复性。
碱裂解法根据共价闭合环状质粒DNA 和线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分离质粒DNA 。
SDS 是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。
SDS 处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA 及细菌基因组DNA 从细胞中同时释放出来。
细菌环状基因组DNA 在操作过程中会断裂成线状DNA 分子，在pH 值介于12.0 ～12.5 这个狭窄的范围内，线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕结合在一起。
当加入pH4.8 乙酸钾缓冲液时，pH 恢复至中性，因为共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA 恢复原来构型，保持可溶性状态。
实验五质粒DNA制备
实验五质粒DNA的制备【实验目的】1.了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用；2.把握质粒DNA分离和纯化的原理；3.学习碱裂解法和煮沸法分离质粒DNA的方式。
【实验原理】质粒是细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传而且给予宿主细胞特定的表型。
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。
与天然质粒相较,质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部份非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。
大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方式肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。
一个理想的克隆载体大致应有以下一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰操纵型；（2）具有多种经常使用的限制性内切酶的单个酶切位点；（3）能插入较大的外源DNA 片段；（4）具有容易操作的检测表型。
经常使用的质粒载体大小一样在1kb 至10kb 之间，如pBR322、pUC 系列、pGEM 系列和pBluescript（简称pBS）等。
通过改造的基因工程质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介，这种基因的运载工具在基因工程中具有极普遍的用途，而质粒的分离与提取那么是基因工程最经常使用、最大体的实验技术。
一样分离质粒DNA的方式都包括3个步骤：①培育细菌，使质粒DNA大量扩增；②搜集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA。
分离制备质粒DNA的方式很多，其中经常使用的方式有碱裂解法、煮沸法、SDS法和羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中能够依照宿主菌株的类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点和质粒DNA的用途选择不同的方式。
本实验介绍最经常使用的碱裂解法和煮沸法提取质粒DNA。
1. 碱变性法碱变性法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性和复性的不同而达到分离的目的。
质粒dna的制备实验报告
质粒dna的制备实验报告质粒DNA的制备实验报告引言：DNA（脱氧核糖核酸）是生物体内负责遗传信息传递的重要分子。
质粒DNA是一种环状的双链DNA分子，广泛存在于细菌和其他一些原核生物中。
质粒DNA具有自主复制的能力，并携带了一些对细菌有益的基因信息。
因此，质粒DNA的制备对于基因工程研究和生物技术应用具有重要意义。
实验目的：本实验旨在通过离心、溶解、酶切及纯化等步骤，制备出高纯度的质粒DNA样品。
实验材料与方法：1. 细菌培养液：含有目标质粒DNA的细菌培养物。
2. 离心管：用于离心沉淀细菌。
3. 离心机：用于离心沉淀细菌和质粒DNA。
4. 细胞裂解缓冲液：含有细胞裂解所需的缓冲盐和酶切酶。
5. 酶切酶：用于切割质粒DNA。
6. 蛋白酶K：用于降解细胞中的蛋白质。
7. 酚/氯仿：用于提取DNA。
8. 异丙醇：用于沉淀DNA。
9. 纯化缓冲液：用于纯化DNA样品。
实验步骤：1. 收获细菌：将培养液离心10分钟，将菌体沉淀收集至离心管中。
2. 细胞裂解：加入适量的细胞裂解缓冲液，使菌体充分裂解，并加入蛋白酶K降解蛋白质。
3. DNA提取：加入等体积的酚/氯仿混合液，轻轻摇动离心管使两相混合，离心分离上下两相。
4. DNA沉淀：将上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻摇动离心管使DNA沉淀。
5. DNA纯化：将DNA沉淀洗涤至纯化缓冲液中，离心沉淀DNA，去除上清液。
6. 测定DNA浓度：使用比色法或荧光法等方法测定DNA的浓度。
结果与讨论：经过上述步骤，我们成功制备出了高纯度的质粒DNA样品。
通过测定DNA浓度，我们可以得到质粒DNA的含量。
实验中使用的细菌培养物中含有目标质粒DNA，经过细胞裂解和酶切等步骤，我们成功地将质粒DNA从其他细胞组分中分离出来。
酚/氯仿提取和异丙醇沉淀的操作使得DNA得以纯化和浓缩。
最后，使用纯化缓冲液洗涤和离心沉淀，去除上清液，进一步提高了DNA的纯度。
质粒dna的碱法大量制备,实验报告
质粒dna的碱法大量制备,实验报告大量制备质粒DNA方法SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备用碱和SDS处理可以从大规模（500ml）的细菌培养物中分离质粒DNA，所获得的质粒则可通过柱层析或CsCl-溴化乙锭梯度离心进一步纯化：材料：缓冲液和溶液：碱裂解液I：50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris-HCl （pH8.0）10mmol/L EDTA （pH8.0）（溶液I一次可配制100ml，在15psi[1.05kg/cm2]压力下蒸汽灭菌15min，保存于4摄氏度。
）碱裂解液II：0.2 N NaOH （从10N贮存液中现用稀释）1% （m/V）SDS（溶液II要现用现配，室温下使用）碱裂解液III：5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml双蒸水（去离子水）28.5ml 所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。
保存于4摄氏度，用时置于冰浴中。
）另需：乙醇异丙醇STETE（pH8.0）溶菌酶（10mg/ml）现在开始实验：细胞的制备：1. 挑取转化细菌的单菌落，接种到30ml含适当抗生素的培养基中。
注：a. 试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4倍。
b. 试管不宜盖的太紧c. 应在剧烈振摇下温育2. 在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期（OD600约为0.6）。
3. 在含500mlLB、YT或Terrific培养液（预热到37摄氏度）及适当抗生素的烧瓶（2L）中接种25ml对数生长期晚期的菌液，将此培养液在37摄氏度剧烈振摇（300r/min）培养约2.5小时。
注：最后菌液的OD600值应为0.4。
由于不同菌株的生长速度不同，可稍微延长或缩短培养时间，使最终的OD值为0.4。
4. 若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒，在培养液中添加2.5ml 浓度为34mg/ml的氯霉素，使其终浓度为170微克/ml。
注：对于高拷贝数的质粒不需要添加氯霉素。
质粒DNA的制备和酶切
实验十五质粒DNA的制备和酶切一、实验目的及背景质粒时细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。
质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子，1952年由Lederburg正式命名为质粒。
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极为广泛的应用价值。
本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。
从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的如碱变性法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石栏层析法等。
各个方法分离是依据宿主菌株类型，质粒分子大小，碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且得率较高，获得的质粒可以用于酶切，连接与转化。
碱变性法基本原理是，在pH为12.0-12.6的碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。
将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA 和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可去除大部分细胞碎片，染色体DNA，RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
在获得较纯的质粒后，我们常常会利用核酸限制性内切酶对质粒进行酶切，就可以达到在体外有目的地对遗传物质DNA进行改造。
核酸限制性内切酶，是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶，能够以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH。
根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为I/II/III型三大类，II型酶就是通常指的DNA限制性内切酶，他们能识别双链DNA的特异序列，并在这个序列内进行切割，产生特异的DNA片段。
II型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别序列一般为4~6个碱基对的反转重复序列，可以切割DNA 产生三种不同的切口：①5’端突出②3’端突出③平末端。
实验：质粒 DNA 的制备、鉴定、转化及目标基因的诱导表达
实验：质粒DNA的制备、鉴定、转化及目标基因的诱导表达——参考《分子生物学实验》等一、实验目的1. 了解质粒DNA的性质，掌握碱裂解法提取质粒的方法；2. 了解电泳在生物大分子中分离和鉴定的基本原理，掌握琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法；3. 了解感受态细胞的制备方法，学习DNA化学转化方法的过程；4. 掌握蛋白质的诱导表达方法及聚丙烯酰胺凝胶电泳在蛋白质鉴定中的应用。
二、实验原理（一）质粒DNA的提取-碱裂解法细菌质粒是一类双链、闭合环状的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、可以独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份。
通常情况下它可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：1. 培养细菌，使质粒DNA大量扩增；2.收集和裂解细菌；3. 分离和纯化质粒DNA。
提取质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验使用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。
在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。
质粒dna的提取方法
质粒dna的提取方法质粒DNA提取是分子生物学实验中非常常见的操作，用于从细菌中提取质粒DNA进行后续的实验分析。
下面我将介绍一种常用的质粒DNA提取方法——碱裂解法（alkaline lysis method），该方法简单、快速、成本低且适用于大规模提取。
实验原理：碱裂解法是利用碱性溶液来破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放出其中的质粒DNA。
在碱性条件下，细菌细胞壁和细胞膜会被溶解，质粒DNA则在此过程中被保护在碱性溶液中。
接着，通过中和和沉淀步骤，可从碱性溶液中纯化出质粒DNA。
实验步骤：1. 首先，从含有目标质粒的细菌培养物中制备菌液。
将培养物转移到离心管中，以12000 rpm离心10分钟。
2. 弃去上清液，将菌体沉淀重悬于缓冲液中。
缓冲液的配制：用10 mM Tris-HCl缓冲溶液溶解10 mM EDTA（pH 8.0），并加入0.1 mg/mL的蛋白酶K。
3. 加入缓冲液至菌体重悬菌液中，混匀。
4. 加入等量的0.2 M NaOH-1% SDS（含SDS版本）或0.2 M NaOH-0.5% SDS （不含SDS版本），轻轻翻转混匀。
5. 在室温下孵育5-10分钟，将混合物中的碱裂解酶活化。
6. 加入等体积的3 M醋酸钠（pH 5.5）以中和混合物。
7. 在室温下孵育5-10分钟，使沉淀物凝结。
8. 离心上述混合物，12000 rpm，10分钟。
9. 弃去上清液，加入适量的75%乙醇洗涤沉淀。
10. 再次离心，弃去上清液。
11. 干燥质粒DNA沉淀，通常可以在室温下自然干燥，不要使用高温或吹风机等加热工具。
12. 使用适量的Tris-EDTA缓冲液（pH 8.0）溶解质粒DNA沉淀，以得到浓度适宜的质粒DNA溶液。
实验注意事项：1. 在实验操作过程中，尽量避免使用手部直接接触NaOH和SDS，以免引起刺激。
2. 防止质粒DNA受到外源DNA（例如基因组DNA）的污染，可在处理前使用DNase酶或RNase酶处理样品。
显微注射用质粒DNA的制备
显微注射用质粒DNA的制备用于显微注射的DNA的纯度对于成功产生转基因小鼠是极其关键的。
细菌内毒素或有机物的污染都可能显著降低转基因DNA的整合效率和/或显微注射后胚胎的存活率。
目前有许多方法可以制备高纯度的质粒DNA，为了保证显微注射服务的成功率，我们通常推荐以下方法制备用于显微注射的质粒DNA。
推荐的质粒DNA制备方法:1、用以下任意一种试剂盒制备质粒DNA:NucleoBondPC20Kit(Clontech:Cat#740571);QiagenEndoFreePlasmidKit(Qiagen:Cat#12362);或QiagenPlasmidMaxiKit(Qiagen:Cat#12162)。
2、取20μg质粒DNA，通过限制性内切酶将目的片段从质粒载体上分离出来。
用含有0.1-0.2μg/ml溴化乙锭(EB)的1xTAE缓冲液配制0.8%的琼脂糖凝胶对样品进行电泳。
3、用一块干净的刀片在长波紫外光下将片断切割出来(因短波紫外光可能会破坏DNA 因此不推荐使用)。
4、按如下方法纯化DNA片段:-对于小于10Kb的DNA片段，用QiagenQiaquickGelExtractionKit(Cat#28704)纯化，并在最后一步用40μl质粒注射缓冲液洗脱DNA。
-对于10-40Kb的DNA片段，用QiagenQIAEXIIGelExtractionKit(Cat#20021)纯化，并且在最后一步用40μl质粒注射缓冲液洗脱DNA。
5、用分光光度计(如NanoDrop)测量DNA浓度。
6、在琼脂糖凝胶上检验100ngDNA，并与已知浓度及大小的等份DNA标准品(例如GibcoHighDNAMassLadder:Cat#10496-016)进行比较。
4°C保存。
7、客户需要向我们提供至少50μl溶解在注射缓冲液中的DNA，并且浓度不低于100ng/μl，同时需要附上DNA的凝胶电泳图片。
质粒dna提取实验报告
质粒dna提取实验报告质粒DNA提取实验报告引言：质粒DNA提取是分子生物学研究中常用的技术手段之一。
通过提取质粒DNA，我们可以获得特定的基因片段，进一步进行基因克隆、转染、PCR扩增等实验。
本实验旨在探究质粒DNA提取的方法和步骤，并验证提取的质粒DNA是否纯度高、浓度适宜。
材料与方法：1. 细菌培养：选择含有目标质粒的细菌菌株，如大肠杆菌。
2. 培养基制备：制备含有适当抗生素的LB培养基。
3. 菌液培养：在培养基中接种细菌菌液，培养至适当的生长期。
4. 细菌收获：离心细菌培养液，收集菌体沉淀。
5. 细胞裂解：使用裂解液将细菌细胞壁破裂，释放细胞内的DNA。
6. 蛋白质沉淀：通过加入盐溶液，将蛋白质沉淀下来。
7. DNA沉淀：加入酒精，使DNA沉淀出来。
8. 洗涤：使用乙醇洗涤沉淀的DNA，去除杂质。
9. 干燥：将洗涤后的DNA干燥至无水状。
结果与讨论：经过以上步骤，我们成功提取到了质粒DNA。
下面将对实验结果进行分析和讨论。
首先，我们需要评估提取的质粒DNA的纯度。
常用的方法是使用比色法或分光光度法测量DNA溶液的吸光度比值（A260/A280）。
纯度较高的DNA溶液其吸光度比值通常在1.8-2.0之间。
如果比值低于1.8，说明可能存在蛋白质、RNA 或其他杂质的污染，需要进一步纯化处理。
其次，我们需要评估提取的质粒DNA的浓度。
常用的方法是使用比色法或分光光度法测量DNA溶液的吸光度（A260）。
通过测量吸光度并使用标准曲线，我们可以计算出DNA的浓度。
在实验中，我们可以根据需要调整DNA的浓度，以适应后续实验的要求。
此外，我们还可以通过琼脂糖凝胶电泳来评估提取的质粒DNA的完整性。
将DNA样品与DNA标准品一同加载到琼脂糖凝胶上，经电泳分离后，通过比较DNA带的大小和形态，我们可以初步判断提取的质粒DNA是否完整。
在实验过程中，需要注意的是避免DNA的降解。
DNA在裂解液中容易受到核酸酶的降解，因此在裂解过程中应尽量避免长时间的暴露。
质粒的大量制备
（二）质粒DNA 的大量制备:1：在200 mL 的LB 培养基中加入200μL 的相应的抗生素，然后接种适量含有目的质粒的菌液，于37 ℃摇床中，以200 rpm 的转速振荡培养12-14 h。
2：在50 mL收集管中放入吸附柱，并将2.5 mL 的平衡液BL 加在吸附柱上，以8000 rmp 4℃离心2 min，弃废液，再将吸附柱重新放入收集管。
3：在离心管中加入过夜培养的菌液，以8000 rmp 4℃离心5 min，弃上清，并去除残留在管壁上的液体。
4：在上述离心管中加入8 mL 的溶液P1，在振荡器上充分震荡以彻底使菌体裂解。
5：再向上述离心管中加入8 mL 的溶液P2，然后温和的上下摇动液体7~9 次，在室温条件下静置5 分钟。
6：再向上述离心管中加入8 mL 的溶液P4，然后温和的上下摇动混合液7~9 次，待其充分混匀使混合溶液成白色絮状沉淀，在室温条件下静置10 min，然后以8000 rmp 4℃离心10 分钟，然后将上清转移至过滤器CS1 中，在新的50 mL 离心管中收集滤液。
7：向滤液加入其0.3 倍体积的异丙醇，翻转摇匀后将其转移至吸附柱中。
在室温条件下静置5 分钟。
8：在室温条件下以8000 rmp 4℃离心2 分钟，弃废液，再将吸附柱放入收集管中。
9：在吸附柱中加入10 mL 的漂洗液PW，以8000 rmp 4℃离心2 min，将收集管中的废液倒掉倒，然后将吸附柱再次放入收集管中。
10：将第9 步的操作重复一遍11：在吸附柱中加入3 mL 的无水乙醇，以8000 rmp 在室温条件下离心2 分钟，倒掉废液。
12：再次将吸附柱重新放入收集管中，以8000 rmp 离心5 分钟，为了彻底的去除从残留在吸附柱中的漂洗液PW。
13：然后将吸附柱重新放入一个干净的50 mL 离心管中，在吸附柱的膜中间滴入1~2 mL 的洗脱缓冲液TB，在室温条件下静置10min，以8000 rmp 离心 2 分钟，然后将50mL 离心管中的液体转移至新的1.5 mL 的EP 管中，置于-20 保存备用。
大量制备质粒DNA(传统碱裂解法、PEG8000纯化)
大量制备质粒DNA（传统碱裂解法、PEG8000纯化）适用于从100-250ul菌液中制备100-200ug高拷贝质粒1．涂板、挑取单克隆菌落，加入LB选择性培养基中（高拷贝质粒用100-250ml,低拷贝用500ml），37℃振摇12-16小时。
2．收获菌液（用35ml离心管）：4℃ 5,000rpm 离心10min，弃上清，再次离心2min，吸除残留的培养液：（注意：这步可将离心沉淀后的菌斑-204℃冻存12-24小时，留待以后操作。
）3．以10ml溶液I重悬细菌。
4．加入溶液II 10ml,轻轻旋转、颠倒４－６次（不可过重，以免机械剪切基因组ＤＮＡ），室温放置５min（不可超过５min，避免过度消化）。
5．加入冰预冷的溶液III 10ml，迅速颠倒4-6次混匀，冰上放置20min，以促进沉淀形成。
6．4℃ 1，3000rpm（2，000g以上）离心30min，离心前应再次混合样品。
（也可用过滤纸过滤。
收集上清。
）7．上清入新管，以与上一步相同的条件离心15min，充分去除沉淀。
（如过滤此步可省）。
8．上清入新管，加入60%体积的异丙醇（约18ml ,室温，已避免增加盐沉淀），混匀，室温放置10min，4℃ 1，5000rpm离心30min（离心前应于管底作好标记），小心，缓慢地倒出上清，切勿将管底的DNA沉淀一并弃去。
9．清洗：70%乙醇20ml清洗沉淀物，4℃ 1，5000rpm离心10min小心，缓慢地倒出上清，充分凉干，溶于1XTE溶液3ml 中。
10. 加入等体积 3ml预冷的5M LiCL溶液,充分混匀, 4℃ 10,000rpm离心10min。
11. 上清入新管，加入等体积的异丙醇（6ml）沉淀，室温条件下以10,000rpm离心10min，弃上清，以70%乙醇10ml清洗沉淀物，4℃ 1，5000rpm离心10min，凉干，溶于1XTE 溶液500ul 中。
(也可分成两管，每管500ul，做成两管抽提。
DNA连接反应的步骤及说明
DNA连接反应的步骤及说明1.质粒DNA的制备：首先需要从大肠杆菌等细菌中提取质粒DNA。
通常方法是通过破碎细菌细胞并利用离心等步骤纯化质粒DNA。
也可以通过体外扩增技术如PCR获得所需的DNA片段。
2.DNA片段的制备：如果需要连接多个DNA片段，就需要对不同的DNA片段进行提取和纯化。
可以利用限制酶切、PCR等技术将所需的片段放入载体中。
3.线性化载体的制备：选取合适的载体，通常是质粒或噬菌体。
首先需要线性化载体，以便容纳连接的DNA片段。
这可以通过限制酶切除去所需连接部分的DNA序列来实现。
4.生成粘性末端：对于需要连接的DNA片段和线性化载体，需要使其末端具有互补碱基序列，以便后续的连接。
这可以通过在连接反应中引入适当的酶来完成，例如聚合酶、牛碱性磷酸酶等。
5.DNA连接反应的进行：将线性化载体与DNA片段放在连接反应的体系中，同时加入DNA连接酶和连接缓冲液。
酶的作用是催化连接反应，连接缓冲液提供了适合的pH和离子环境。
6.酶切修复：DNA连接反应后，需要将未连接的DNA片段去除，并对连接的DNA进行修复。
这可以通过加入限制酶来切除未连接的DNA，再加入DNA连接酶和连接缓冲液来进行修复。
7.质粒复制和筛选：完成酶切修复后，将连接后的DNA转化到宿主细胞中，使其进行质粒复制。
然后利用抗生素筛选或其他遗传标记来筛选出含有目标连接片段的质粒。
DNA连接反应是一个基本而重要的实验技术。
其步骤主要包括质粒DNA的制备、DNA片段的制备和线性化载体的制备、生成粘性末端、DNA 连接反应、酶切修复以及质粒复制和筛选。
在这个过程中，酶的作用起到了催化和修复的关键作用，而连接缓冲液则提供了适合的环境。
通过这一系列的步骤，可以将不同的DNA片段成功连接起来，实现对目标序列的操纵和重组。
这个技术在基因克隆、DNA工程和生物学研究中被广泛应用，为科学家提供了强大的实验工具。
质粒dna提取的方法
质粒dna提取的方法
提取质粒DNA的常用方法主要有：
1. 碱裂解法：将含有质粒DNA的细菌株进行裂解，使细菌质粒DNA与蛋白质分离。
一般使用碱性裂解缓冲液（如0.2 M NaOH）和含有细菌裂解酶（如SDS）的胰酶溶液进行裂解，然后使用中性盐溶液（如3 M醋酸钠）进行酸性沉淀，最后通过离心分离沉淀的质粒DNA。
2. 除菌剂法：使用含有除菌剂（如SDS）的裂解缓冲液直接裂解细菌细胞，使质粒DNA与细菌蛋白质分离。
然后使用物理方法（如离心）分离DNA和蛋白质，最后使用醋酸盐沉淀法分离质粒DNA。
3. 膜裂解法：将含有质粒DNA的细菌株均匀涂在含有质粒DNA结合断裂物的特殊膜上，经裂解后，膜上会形成质粒DNA的斑点。
然后使用洗脱缓冲液将质粒DNA从膜上洗脱，得到纯化的质粒DNA。
4. 商业化质粒DNA提取试剂盒：市面上有各种质粒DNA提取试剂盒可供选择，这些试剂盒能够提供简便、快速、高产量且高质量的质粒DNA纯化方法。
根据试剂盒的不同，步骤和原理会有所区别。
不同的方法适用于不同的实验目的和样品类型，请根据具体情况选择合适的提取方法。
质粒DNA的小量制备
质粒DNA的小量制备[摘要] 从大肠杆菌中抽提质粒dna的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，因而被各实验室广泛采用。
[关键词] 质粒dna 碱裂解法快速提取（一）实验目的及原理从大肠杆菌中抽提质粒dna的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法，碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的dna可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。
（二）试剂与器材1.器材：微量移液器、1.5ml离心管、各种移液器头、台式高速离心机、高压灭菌锅、冰块2.试剂：（1）溶液ⅰ：50mmol/l葡萄糖、10mmol/l edta，20mmol/l 25mmtris-hcl ph8.0。
（2）溶液ⅱ：0.4mol/l naoh（临用前用10mol/l naoh贮存液现用现稀解），2%sds sds（十二烷基硫酸纳）10％母液的配制。
（3）溶液ⅲ：60ml 5mol/l 醋酸钾，5ml冰醋酸，28.5ml h2o。
（4）te缓冲液：10mmol/l tris-hcl, 1mmol/l edta（ph8.0）。
（5）100%乙醇，70％乙醇。
（6）上样缓冲液(6×)：0.25% 溴酚兰，40％(w/v)蔗糖水溶液或30％的甘油。
（7）5×tris-硼酸（tbe）缓冲液。
（8）5×tris-乙酸（tae）缓冲液。
3.材料：（1）含puc系列质粒的大肠杆菌；（2）琼脂糖。
（三）实验步骤1.质粒dna的小量提取。
(1)取四支1.5ml离心管，编号为1、2、3、4。
用加样枪加各个溶液。
(2)分别吸取200μl培养液加入这四个离心管中，在离心机（12 000r/min）离心10min，弃上清液，收集菌体。
(3)在1、2、3号分别加入200μl溶液ⅰ，4号加入用等量蒸馏水代替，在快速混匀器上使菌体均匀悬浮。
(4)在1、2、4号加入200μl溶液ii，在3号加入（未加naoh，只加了sds）的溶液ii轻柔颠倒混匀。
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导论质粒DNA的小量制备质粒DNA的大量制备质粒DNA的纯化一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA,这些方法都含有以下3个步骤：细菌培养物的生长。
细菌的收获和裂解质粒DNA的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中（有含有行当抗生素的液体培养基中生长），然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC 系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体（如pBR322）由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR322一类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素闻付1）已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于3个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1）大质粒（大于15kb）容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS 一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
2）可用更剧烈的方法来分离小质粒。
在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。
这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。
3）一些大肠杆菌菌株（如HB101的一些变种衍生株）用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯一溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。
糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。
因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。
故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。
4）当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株（endA+株，如HB101）中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。
因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育（如用限制酶消化）时，质粒DNA会被降解。
但如果通过一个附加步骤（用酚：氯仿进行抽提）可以避免此问题。
5）目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。
然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。
大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。
有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相（三）质粒DNA的纯化常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状这样两个性质。
例如，用氯化铯一溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。
溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。
由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。
最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。
但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和（每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子）。
由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。
多年来，氯化铯一溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA的首选方法。
然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。
其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。
本实验室采用离子交换层析法已可得到极高纯度的质粒。
另外，现在已可买到现成的纯化KIT。
二、质粒DNA的小量制备细菌的收获和裂解收获碱裂解法煮沸裂解质粒DNA小量制备的问题与对策质粒DNA的小量制备可采用下述的碱裂解法或煮沸法（一）细菌的收获和裂解1.收获1）将2ml含相应抗生素的18加入到容量为15ml并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。
2）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。
3）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。
当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
2.碱裂解法1）将细菌沉淀，所得重悬于100m用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。
溶液I50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.Cl（pH8.0）10mmol/LEDTA（pH8.0）溶液I可成批配制，每瓶约100ml，在10lbf八n2（6.895104Pa）高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。
须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。
2）加200m新配制的溶液H。
溶液II0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1%SDS盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。
应确保离心管的整个内表面均与溶液I接触。
不要振荡，将离心管放置于冰上。
3）加150m用冰预冷的溶液ni溶液ni5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L,对乙酸根是5mol/L。
盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液ni在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3—5分钟。
4）用微量离心机于4c12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。
5）可做可不做：加等量酚：氯念，振荡混匀，用微量离心机于4℃以12000g离心2分钟，将上清转移到另一良心管中。
有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。
6）用2倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。
振荡混合，于室温放置2分钟。
7）用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟。
8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。
再将附于管壁的液滴除尽。
除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。
当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
9）用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8）所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。
i .此法制备的高拷贝数质粒（如X f3或pUC）,其产量一般约为：每毫升原细菌培养物一5闻。
ii .如果要通过限制酶切割反应来分析DNA,可取1川DNA溶液加到另一含8m水的微量离心管内，加1"10限制酶缓冲液和1单位所需限制酶，在适宜温育1—2小时。
将剩余的DNA贮存于一20℃。
iii .此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物：3.煮沸裂解1）将细菌沉淀，所得重悬于350"STET中。
STET0.1mol/LNaCL10mmol/LTris.Cl（pH8.0）1mmol/LEDTA（pH8.0）5%TritonX-1002）加25"新配制的溶菌酶溶液［10mg/ml用10mmol/LTris.Cl（pH8.0）配制］，振荡3秒钟以混匀之。
如果溶淮中pH低于8.0,溶菌酶就不能有效发挥作用。
3）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。
4）用微量离心机于室温以12000g离心10分种。
5）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。
6）在上清中加入40m5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420m异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。
7）用微量离心机于4℃以12000g离心5分种，回收核酸沉淀。
8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。
再将附于管壁的液滴除尽。
除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。
当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。
9）加1ml70%乙醇，于4℃以12000g离心2分钟。
10）按步骤8）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（2—5）分钟。
11）用50"含无DNA酶的胰RNA酶（20*/ml）的TE（pH8.0）溶解核酸稍加振荡，贮存于-20℃。
注：当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株（endA+株，如HB101）中小量制粒尤其DNA 时，建议舍弃煮沸法。
因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A,以后在Mg2+存在下温育（V中用限制酶时）质粒DNA可被降解。
在上述方案的步骤9）之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提，可以避免这一问题。
（二）质粒DNA小量制备的问题与对策裂解和煮佛法都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有会么麻烦。
多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题：1）有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。
大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。
如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化DNA。
2）在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。
这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。
三、质粒DNA的大量制备在丰富培养基中扩增质粒细菌的收获和裂解收获碱裂解法（一）在丰富培养基中扩增质粒许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2—5mg质粒DNA,而且重复性也很好。