质粒DNA的制备
DNA抽提和质粒DNA制备
琼脂水解酶：将含DNA的凝胶进行消化， 琼脂糖水解成二糖，释放DNA，后使用 酚抽提方法回收DNA
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问题
从细胞或组织中分离DNA时，常用蔗糖， 目的是（ ） A 抑制核酸酶
• B 保护DNA，防止断裂 C 加速蛋白质变性 D 有利于细胞破碎
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用SDS-酚抽提DNA时，SDS浓度十分重要， 当SDS浓度为0.1%时，（ ）
1．菌株类型 2．质粒的大小 3．细菌染色体DNA变性条件强弱的控制 4．细菌的培养与收集
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（四）碱裂解法原理：
在 pHl2.0-12.6 碱 性 环 境 中 ， 线 性 的大分子量细菌染色体DNA变性， 而共价闭环(CC)质粒DNA仍为自然 状态。
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将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件 下，染色体DNA之间交联形成不溶性网 状结构。大部分DNA和蛋白质在去污剂 SDS的作用下形成沉淀，而CC质粒DNA 仍然为可溶状态。
上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅， DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约 80kb。
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• 4 异丙醇沉淀法：基本同1法，仅用二倍 容积异丙醇替代乙醇，可去除小分子 RNA（在异丙醇中可溶状态）。
• 5 表面活性剂快速制备法：用Triton X-100或 NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K 或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。
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DNA回收
主要是从电泳中分离回收DNA片段。 回收原则：尽量提高回收率
去除回收DNA样品中的污染物
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电泳到DEAE-纤维素膜 ： DEAE是一种阴离子交换纤维素，可以吸 附带有负电荷的DNA分子。
在所需条带前插入DEAT-纤维素膜，继续电泳 至条带DNA都到膜上，取出洗下。 500bp-5kb的DNA片段回收率较好，纯度高。 但不适用于分子量超过10kb和单链DNA。
1实验 质粒DNA的制备
pDC315
三．实验方法
１．挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中（含AmP 50μg/ml）， ３７℃强烈摇荡过度。
２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒， 弃上清，用１ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一 次，弃上清，取沉淀。
３．将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀，冰 上放置5分钟。
质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞 一些表型，是比病毒更简单的原始生命。
质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到 雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子.
１９５２年由Lederburg正式命名为质粒。
质粒类型
质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒 和 严紧型质粒
1.松弛型质粒 松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功
８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。 ９． １２０００g ,4 ℃离心５分钟。 １０．弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒
数次，１２000g 于4 ℃离心２分钟。 １１．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。 １２．加入50μl TE（含20μg/ml RNA 酶，不含DNA酶）溶解
从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的 碱变性法； 煮沸法； SDS法； 羟基磷灰石层析法等 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、
碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法 既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连 接与转化。
碱变性法基本原理
在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA 变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。
能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长 的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制 依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染 色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的 拷贝数可达2000-3000拷贝。
质粒dna的提取步骤
质粒dna的提取步骤质粒DNA的提取步骤质粒DNA是细菌中的圆形DNA分子，与细胞染色体不同，可以在细菌中自主复制。
质粒DNA的提取是一项常规实验，可用于高效地分离纯化质粒。
在进行质粒DNA提取之前，需要准备一些必要的试剂和设备。
材料和试剂：1.细菌培养物2.经过钙离子或热处理的TTES缓冲液（10mM Tris-HCl [pH8.0]，1mM EDTA [pH8.0]，25%蔗糖溶液）3.蛋白酶K处理缓冲液（50mM Tris-HCl [pH8.0]，100mM NaCl，10mM EDTA [pH8.0]）4.醇5.异丙醇6.以太7.加拿大CFII列的紫外灯8.恒温振荡器步骤：1.收集培养物将培养物用无菌工具收集到1.5毫升离心管中。
通过离心将细胞沉淀到离心管底部。
2.细胞溶解添加500 μl TTES缓冲液到离心管中，并用Vortex或20号钢珠打破细胞壁。
将离心管放在水浴中恒温振荡器中，30分钟以70 rpm。
3.移除细胞碎片离心管离心2分钟，将浮于上层的无菌细胞断片去除（上清），移至另外的离心管。
4.蛋白酶K处理向上清中加入100 μl蛋白酶K处理缓冲液和15μl蛋白酶K，室温下静置10分钟，然后加入200 μl醇混合液（3：7乙醇：异丙醇），与上清混合均匀。
5.沉淀DNA的制备离心管离心2分钟，然后将上清倒出。
沉淀物将采用70%的醇作为清洗液，在沉淀物上滴入1 ml的70%醇，在打破后的沉淀物中短暂的搅拌。
离心管轻轻晃动，浮于上层的除去，再加1ml的70%酒精，将沉淀物中混合在一起。
6.沉淀物最佳溶解将沉淀物在无尘工作台上空气干燥（大约10~15分钟），直到酒精挥发。
将沉淀物用10毫升 TE缓冲液（10mM Tris-HCl [pH8.0]，1mM EDTA [pH8.0]）悬浮，经缓慢抽气镇静。
7.检测提取的DNA通过紫外光下的可见目标，如果质粒DNA等目标脱胶，就可以看到了。
通常设定为 OD260/OD280值为1.8-2.0。
碱裂解发制备质粒DNA原理
碱裂解发制备质粒DNA原理碱裂解法是一种常用的制备质粒DNA的方法，其原理是通过使用碱性溶液将细菌细胞膜和核酸中的蛋白质进行裂解，从而分离出质粒DNA。
下面将详细介绍碱裂解法的原理和步骤。
碱裂解法的原理是利用强碱溶液（如NaOH或KOH）对细菌细胞进行裂解，同时可去除细胞膜及其上的蛋白质，使质粒DNA从细胞内部释放出来。
此外，碱性环境可以使DNA表现为单链结构，这使得DNA与其他形式的核酸（如RNA和DNA-蛋白复合物）有所区别，有助于后续的提取和纯化。
制备质粒DNA的碱裂解法的步骤如下：1.菌液培养：选取含有质粒的细菌菌株，在适宜的培养基中培养至合适的生长期。
2.收获细菌细胞：采用离心等方法将细菌细胞从菌液中收集。
通常使用蒸馏水进行细菌菌液的稀释，以确保细菌能够在蒸馏水中悬浮均匀。
3.清洗细菌细胞：使用理化方法（如洗涤剂、EDTA、乙醇等）将细菌细胞洗净。
这一步骤的目的是去除掉附着在细菌细胞表面的杂质，减少对后续步骤的影响。
4.裂解细菌细胞：将清洗后的细菌细胞悬浮在碱性溶液（如0.2MNaOH）中，使其完全裂解。
碱性溶液的作用是破坏菌细胞膜结构，去除蛋白质，并使DNA变为单链结构。
5. 中和反应：在细菌细胞裂解后，添加中和剂（如2 M Tris-HCl, pH 7.4），将溶液的pH值迅速调整到酸性，以中和碱性溶液中的氢氧根离子。
6.沉淀DNA：通过离心将细菌细胞碎片和其他残余物沉淀下来，将上清液（含有质粒DNA）收集。
7.聚集DNA：通过旋转浓缩、加入盐类或乙醇等方法，将质粒DNA聚集成颗粒状沉淀。
8. 洗涤和纯化：使用缓冲液（如低浓度Tris-HCl或盐溶液）洗涤和纯化质粒DNA，去除残余的盐和杂质。
9.确定DNA浓度和纯度：通过分光光度法或凝胶电泳等方法，测定质粒DNA的浓度和纯度，以确定提取的质粒DNA是否适合下游实验。
总之，碱裂解法通过利用强碱溶液裂解细菌细胞，去除蛋白质，使质粒DNA释放出来，并通过离心、沉淀、洗涤和纯化等步骤，得到高纯度的质粒DNA。
质粒DNA提取及纯化
质粒DNA 提取纯化、DNA 电泳检测实验目的1．掌握质粒DNA 的制备的原理和方法2．了解质粒琼脂糖凝胶电泳分离二、实验原理1．质粒DNA 的制备方法质粒(Plasmid) 是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA 分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。
细菌质粒大小介于1～200Kb 之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA 。
质粒DNA 的制备包括3 个步骤：①培养细菌，使质粒DNA 大量扩增；②收集和裂解细菌；③分离和纯化质粒DNA 。
主要方法包括：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS ；煮沸裂解法：沸水煮沸40 秒；SDS 裂解法：10%SDS ，一般用于质粒大量提取。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA 的用途进行选择。
本实验选择碱裂解法提取质粒DNA 。
2．碱裂解法质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH 值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA 变性，去除变性条件又可以使DNA 复性。
碱裂解法根据共价闭合环状质粒DNA 和线性染色体DNA 在拓扑学上的差异来分离质粒DNA 。
SDS 是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。
SDS 处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA 及细菌基因组DNA 从细胞中同时释放出来。
细菌环状基因组DNA 在操作过程中会断裂成线状DNA 分子，在pH 值介于12.0 ～12.5 这个狭窄的范围内，线性的DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA 的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕结合在一起。
当加入pH4.8 乙酸钾缓冲液时，pH 恢复至中性，因为共价闭合环状的质粒DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA 恢复原来构型，保持可溶性状态。
质粒dna的制备实验报告
质粒dna的制备实验报告质粒DNA的制备实验报告引言：DNA（脱氧核糖核酸）是生物体内负责遗传信息传递的重要分子。
质粒DNA是一种环状的双链DNA分子，广泛存在于细菌和其他一些原核生物中。
质粒DNA具有自主复制的能力，并携带了一些对细菌有益的基因信息。
因此，质粒DNA的制备对于基因工程研究和生物技术应用具有重要意义。
实验目的：本实验旨在通过离心、溶解、酶切及纯化等步骤，制备出高纯度的质粒DNA样品。
实验材料与方法：1. 细菌培养液：含有目标质粒DNA的细菌培养物。
2. 离心管：用于离心沉淀细菌。
3. 离心机：用于离心沉淀细菌和质粒DNA。
4. 细胞裂解缓冲液：含有细胞裂解所需的缓冲盐和酶切酶。
5. 酶切酶：用于切割质粒DNA。
6. 蛋白酶K：用于降解细胞中的蛋白质。
7. 酚/氯仿：用于提取DNA。
8. 异丙醇：用于沉淀DNA。
9. 纯化缓冲液：用于纯化DNA样品。
实验步骤：1. 收获细菌：将培养液离心10分钟，将菌体沉淀收集至离心管中。
2. 细胞裂解：加入适量的细胞裂解缓冲液，使菌体充分裂解，并加入蛋白酶K降解蛋白质。
3. DNA提取：加入等体积的酚/氯仿混合液，轻轻摇动离心管使两相混合，离心分离上下两相。
4. DNA沉淀：将上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻摇动离心管使DNA沉淀。
5. DNA纯化：将DNA沉淀洗涤至纯化缓冲液中，离心沉淀DNA，去除上清液。
6. 测定DNA浓度：使用比色法或荧光法等方法测定DNA的浓度。
结果与讨论：经过上述步骤，我们成功制备出了高纯度的质粒DNA样品。
通过测定DNA浓度，我们可以得到质粒DNA的含量。
实验中使用的细菌培养物中含有目标质粒DNA，经过细胞裂解和酶切等步骤，我们成功地将质粒DNA从其他细胞组分中分离出来。
酚/氯仿提取和异丙醇沉淀的操作使得DNA得以纯化和浓缩。
最后，使用纯化缓冲液洗涤和离心沉淀，去除上清液，进一步提高了DNA的纯度。
质粒dna的碱法大量制备,实验报告
质粒dna的碱法大量制备,实验报告大量制备质粒DNA方法SDS碱裂解法制备质粒DNA：大量制备用碱和SDS处理可以从大规模（500ml）的细菌培养物中分离质粒DNA，所获得的质粒则可通过柱层析或CsCl-溴化乙锭梯度离心进一步纯化：材料：缓冲液和溶液：碱裂解液I：50mmol/L 葡萄糖25mmol/L Tris-HCl （pH8.0）10mmol/L EDTA （pH8.0）（溶液I一次可配制100ml，在15psi[1.05kg/cm2]压力下蒸汽灭菌15min，保存于4摄氏度。
）碱裂解液II：0.2 N NaOH （从10N贮存液中现用稀释）1% （m/V）SDS（溶液II要现用现配，室温下使用）碱裂解液III：5mol/L 乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml双蒸水（去离子水）28.5ml 所配成的溶液中钾的浓度为3mol/L，乙酸根的浓度为5mol/L。
保存于4摄氏度，用时置于冰浴中。
）另需：乙醇异丙醇STETE（pH8.0）溶菌酶（10mg/ml）现在开始实验：细胞的制备：1. 挑取转化细菌的单菌落，接种到30ml含适当抗生素的培养基中。
注：a. 试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4倍。
b. 试管不宜盖的太紧c. 应在剧烈振摇下温育2. 在适当的温度和摇速下培养菌液直至对数生长期晚期（OD600约为0.6）。
3. 在含500mlLB、YT或Terrific培养液（预热到37摄氏度）及适当抗生素的烧瓶（2L）中接种25ml对数生长期晚期的菌液，将此培养液在37摄氏度剧烈振摇（300r/min）培养约2.5小时。
注：最后菌液的OD600值应为0.4。
由于不同菌株的生长速度不同，可稍微延长或缩短培养时间，使最终的OD值为0.4。
4. 若质粒为低或中拷贝数的松弛型质粒，在培养液中添加2.5ml 浓度为34mg/ml的氯霉素，使其终浓度为170微克/ml。
注：对于高拷贝数的质粒不需要添加氯霉素。
质粒DNA的制备和酶切
实验十五质粒DNA的制备和酶切一、实验目的及背景质粒时细菌内的共生型遗传因子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。
质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子，1952年由Lederburg正式命名为质粒。
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极为广泛的应用价值。
本实验要求掌握最常用的质粒的提取方法。
从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的如碱变性法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石栏层析法等。
各个方法分离是依据宿主菌株类型，质粒分子大小，碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且得率较高，获得的质粒可以用于酶切，连接与转化。
碱变性法基本原理是，在pH为12.0-12.6的碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。
将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA 和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可去除大部分细胞碎片，染色体DNA，RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。
在获得较纯的质粒后，我们常常会利用核酸限制性内切酶对质粒进行酶切，就可以达到在体外有目的地对遗传物质DNA进行改造。
核酸限制性内切酶，是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶，能够以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH。
根据限制酶的识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性可分为I/II/III型三大类，II型酶就是通常指的DNA限制性内切酶，他们能识别双链DNA的特异序列，并在这个序列内进行切割，产生特异的DNA片段。
II型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别序列一般为4~6个碱基对的反转重复序列，可以切割DNA 产生三种不同的切口：①5’端突出②3’端突出③平末端。
实验：质粒 DNA 的制备、鉴定、转化及目标基因的诱导表达
实验：质粒DNA的制备、鉴定、转化及目标基因的诱导表达——参考《分子生物学实验》等一、实验目的1. 了解质粒DNA的性质，掌握碱裂解法提取质粒的方法；2. 了解电泳在生物大分子中分离和鉴定的基本原理，掌握琼脂糖凝胶的制备以及琼脂糖凝胶电泳在DNA片段分离中的应用方法；3. 了解感受态细胞的制备方法，学习DNA化学转化方法的过程；4. 掌握蛋白质的诱导表达方法及聚丙烯酰胺凝胶电泳在蛋白质鉴定中的应用。
二、实验原理（一）质粒DNA的提取-碱裂解法细菌质粒是一类双链、闭合环状的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、可以独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份。
通常情况下它可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：1. 培养细菌，使质粒DNA大量扩增；2.收集和裂解细菌；3. 分离和纯化质粒DNA。
提取质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。
在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。
本实验使用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。
在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。
当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。
质粒dna的提取方法
质粒dna的提取方法质粒DNA提取是分子生物学实验中非常常见的操作，用于从细菌中提取质粒DNA进行后续的实验分析。
下面我将介绍一种常用的质粒DNA提取方法——碱裂解法（alkaline lysis method），该方法简单、快速、成本低且适用于大规模提取。
实验原理：碱裂解法是利用碱性溶液来破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放出其中的质粒DNA。
在碱性条件下，细菌细胞壁和细胞膜会被溶解，质粒DNA则在此过程中被保护在碱性溶液中。
接着，通过中和和沉淀步骤，可从碱性溶液中纯化出质粒DNA。
实验步骤：1. 首先，从含有目标质粒的细菌培养物中制备菌液。
将培养物转移到离心管中，以12000 rpm离心10分钟。
2. 弃去上清液，将菌体沉淀重悬于缓冲液中。
缓冲液的配制：用10 mM Tris-HCl缓冲溶液溶解10 mM EDTA（pH 8.0），并加入0.1 mg/mL的蛋白酶K。
3. 加入缓冲液至菌体重悬菌液中，混匀。
4. 加入等量的0.2 M NaOH-1% SDS（含SDS版本）或0.2 M NaOH-0.5% SDS （不含SDS版本），轻轻翻转混匀。
5. 在室温下孵育5-10分钟，将混合物中的碱裂解酶活化。
6. 加入等体积的3 M醋酸钠（pH 5.5）以中和混合物。
7. 在室温下孵育5-10分钟，使沉淀物凝结。
8. 离心上述混合物，12000 rpm，10分钟。
9. 弃去上清液，加入适量的75%乙醇洗涤沉淀。
10. 再次离心，弃去上清液。
11. 干燥质粒DNA沉淀，通常可以在室温下自然干燥，不要使用高温或吹风机等加热工具。
12. 使用适量的Tris-EDTA缓冲液（pH 8.0）溶解质粒DNA沉淀，以得到浓度适宜的质粒DNA溶液。
实验注意事项：1. 在实验操作过程中，尽量避免使用手部直接接触NaOH和SDS，以免引起刺激。
2. 防止质粒DNA受到外源DNA（例如基因组DNA）的污染，可在处理前使用DNase酶或RNase酶处理样品。
显微注射用质粒DNA的制备
显微注射用质粒DNA的制备用于显微注射的DNA的纯度对于成功产生转基因小鼠是极其关键的。
细菌内毒素或有机物的污染都可能显著降低转基因DNA的整合效率和/或显微注射后胚胎的存活率。
目前有许多方法可以制备高纯度的质粒DNA，为了保证显微注射服务的成功率，我们通常推荐以下方法制备用于显微注射的质粒DNA。
推荐的质粒DNA制备方法:1、用以下任意一种试剂盒制备质粒DNA:NucleoBondPC20Kit(Clontech:Cat#740571);QiagenEndoFreePlasmidKit(Qiagen:Cat#12362);或QiagenPlasmidMaxiKit(Qiagen:Cat#12162)。
2、取20μg质粒DNA，通过限制性内切酶将目的片段从质粒载体上分离出来。
用含有0.1-0.2μg/ml溴化乙锭(EB)的1xTAE缓冲液配制0.8%的琼脂糖凝胶对样品进行电泳。
3、用一块干净的刀片在长波紫外光下将片断切割出来(因短波紫外光可能会破坏DNA 因此不推荐使用)。
4、按如下方法纯化DNA片段:-对于小于10Kb的DNA片段，用QiagenQiaquickGelExtractionKit(Cat#28704)纯化，并在最后一步用40μl质粒注射缓冲液洗脱DNA。
-对于10-40Kb的DNA片段，用QiagenQIAEXIIGelExtractionKit(Cat#20021)纯化，并且在最后一步用40μl质粒注射缓冲液洗脱DNA。
5、用分光光度计(如NanoDrop)测量DNA浓度。
6、在琼脂糖凝胶上检验100ngDNA，并与已知浓度及大小的等份DNA标准品(例如GibcoHighDNAMassLadder:Cat#10496-016)进行比较。
4°C保存。
7、客户需要向我们提供至少50μl溶解在注射缓冲液中的DNA，并且浓度不低于100ng/μl，同时需要附上DNA的凝胶电泳图片。
质粒 dna 的制备 -回复
质粒dna 的制备-回复质粒DNA的制备是基因工程研究中的重要步骤之一。
质粒是一种闭环的DNA分子，常见于细菌细胞中，可以在实验室中被抽取和制备。
以下将步骤一步一步详细回答。
第一步：选择质粒在质粒DNA制备之前，首先需要确定所需的质粒。
质粒通常携带了一些目标基因或DNA片段的克隆。
第二步：选择宿主细菌质粒DNA通常在细菌中复制和扩增。
因此，在制备质粒DNA之前，需要选择一个适合的宿主细菌菌株。
常用的宿主菌株有大肠杆菌（Escherichia coli）等。
第三步：培养细菌选择合适的培养基、温度和培养时间来培养所选择的宿主细菌。
这是质粒DNA制备的关键步骤之一，因为它会影响到质粒DNA的收获量和质量。
第四步：开展质粒DNA的提取在培养期间，细菌会承载质粒DNA的复制。
要提取质粒DNA，可以采用各种提取方法，如碱裂解法、酚-氯仿法、盐析法等。
这些方法可以帮助去除细菌细胞的膜和蛋白质，并纯化质粒DNA。
碱裂解法是一种常用的质粒DNA提取方法。
首先，收获培养液中的细菌细胞，并用缓冲溶液悬浮它们。
然后，加入一定浓度的碱性裂解液，通过破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放质粒DNA。
接下来，通过酸化将碱性溶液中的DNA中和，并用酚冷萃取的氯仿分离DNA。
最后，通过沉淀和洗涤纯化DNA。
第五步：校验并测量质粒DNA提取得到质粒DNA后，可以通过凝胶电泳和紫外光谱来检验其质量和纯度。
凝胶电泳可以用于确定DNA的大小，并检查是否有附带的核酸。
在紫外光谱下，可以测量DNA的吸光度来估计其浓度。
第六步：保存质粒DNA提取和测量质粒DNA之后，应该保存这些DNA样品以备后续实验使用。
质粒DNA可以通过冷冻保存，在-20或-80的低温下稳定保存。
总结：质粒DNA 的制备是实验室中进行基因工程研究的重要步骤。
首先，选择所需的质粒和合适的宿主细菌。
然后，培养细菌菌株，使其承载和复制质粒DNA。
接下来，利用提取方法从细菌中提取和纯化质粒DNA，并通过凝胶电泳和紫外光谱校验其质量和浓度。
质粒的大量制备
（二）质粒DNA 的大量制备:1：在200 mL 的LB 培养基中加入200μL 的相应的抗生素，然后接种适量含有目的质粒的菌液，于37 ℃摇床中，以200 rpm 的转速振荡培养12-14 h。
2：在50 mL收集管中放入吸附柱，并将2.5 mL 的平衡液BL 加在吸附柱上，以8000 rmp 4℃离心2 min，弃废液，再将吸附柱重新放入收集管。
3：在离心管中加入过夜培养的菌液，以8000 rmp 4℃离心5 min，弃上清，并去除残留在管壁上的液体。
4：在上述离心管中加入8 mL 的溶液P1，在振荡器上充分震荡以彻底使菌体裂解。
5：再向上述离心管中加入8 mL 的溶液P2，然后温和的上下摇动液体7~9 次，在室温条件下静置5 分钟。
6：再向上述离心管中加入8 mL 的溶液P4，然后温和的上下摇动混合液7~9 次，待其充分混匀使混合溶液成白色絮状沉淀，在室温条件下静置10 min，然后以8000 rmp 4℃离心10 分钟，然后将上清转移至过滤器CS1 中，在新的50 mL 离心管中收集滤液。
7：向滤液加入其0.3 倍体积的异丙醇，翻转摇匀后将其转移至吸附柱中。
在室温条件下静置5 分钟。
8：在室温条件下以8000 rmp 4℃离心2 分钟，弃废液，再将吸附柱放入收集管中。
9：在吸附柱中加入10 mL 的漂洗液PW，以8000 rmp 4℃离心2 min，将收集管中的废液倒掉倒，然后将吸附柱再次放入收集管中。
10：将第9 步的操作重复一遍11：在吸附柱中加入3 mL 的无水乙醇，以8000 rmp 在室温条件下离心2 分钟，倒掉废液。
12：再次将吸附柱重新放入收集管中，以8000 rmp 离心5 分钟，为了彻底的去除从残留在吸附柱中的漂洗液PW。
13：然后将吸附柱重新放入一个干净的50 mL 离心管中，在吸附柱的膜中间滴入1~2 mL 的洗脱缓冲液TB，在室温条件下静置10min，以8000 rmp 离心 2 分钟，然后将50mL 离心管中的液体转移至新的1.5 mL 的EP 管中，置于-20 保存备用。
大量制备质粒DNA(传统碱裂解法、PEG8000纯化)
大量制备质粒DNA（传统碱裂解法、PEG8000纯化）适用于从100-250ul菌液中制备100-200ug高拷贝质粒1．涂板、挑取单克隆菌落，加入LB选择性培养基中（高拷贝质粒用100-250ml,低拷贝用500ml），37℃振摇12-16小时。
2．收获菌液（用35ml离心管）：4℃ 5,000rpm 离心10min，弃上清，再次离心2min，吸除残留的培养液：（注意：这步可将离心沉淀后的菌斑-204℃冻存12-24小时，留待以后操作。
）3．以10ml溶液I重悬细菌。
4．加入溶液II 10ml,轻轻旋转、颠倒４－６次（不可过重，以免机械剪切基因组ＤＮＡ），室温放置５min（不可超过５min，避免过度消化）。
5．加入冰预冷的溶液III 10ml，迅速颠倒4-6次混匀，冰上放置20min，以促进沉淀形成。
6．4℃ 1，3000rpm（2，000g以上）离心30min，离心前应再次混合样品。
（也可用过滤纸过滤。
收集上清。
）7．上清入新管，以与上一步相同的条件离心15min，充分去除沉淀。
（如过滤此步可省）。
8．上清入新管，加入60%体积的异丙醇（约18ml ,室温，已避免增加盐沉淀），混匀，室温放置10min，4℃ 1，5000rpm离心30min（离心前应于管底作好标记），小心，缓慢地倒出上清，切勿将管底的DNA沉淀一并弃去。
9．清洗：70%乙醇20ml清洗沉淀物，4℃ 1，5000rpm离心10min小心，缓慢地倒出上清，充分凉干，溶于1XTE溶液3ml 中。
10. 加入等体积 3ml预冷的5M LiCL溶液,充分混匀, 4℃ 10,000rpm离心10min。
11. 上清入新管，加入等体积的异丙醇（6ml）沉淀，室温条件下以10,000rpm离心10min，弃上清，以70%乙醇10ml清洗沉淀物，4℃ 1，5000rpm离心10min，凉干，溶于1XTE 溶液500ul 中。
(也可分成两管，每管500ul，做成两管抽提。
DNA连接反应的步骤及说明
DNA连接反应的步骤及说明1.质粒DNA的制备：首先需要从大肠杆菌等细菌中提取质粒DNA。
通常方法是通过破碎细菌细胞并利用离心等步骤纯化质粒DNA。
也可以通过体外扩增技术如PCR获得所需的DNA片段。
2.DNA片段的制备：如果需要连接多个DNA片段，就需要对不同的DNA片段进行提取和纯化。
可以利用限制酶切、PCR等技术将所需的片段放入载体中。
3.线性化载体的制备：选取合适的载体，通常是质粒或噬菌体。
首先需要线性化载体，以便容纳连接的DNA片段。
这可以通过限制酶切除去所需连接部分的DNA序列来实现。
4.生成粘性末端：对于需要连接的DNA片段和线性化载体，需要使其末端具有互补碱基序列，以便后续的连接。
这可以通过在连接反应中引入适当的酶来完成，例如聚合酶、牛碱性磷酸酶等。
5.DNA连接反应的进行：将线性化载体与DNA片段放在连接反应的体系中，同时加入DNA连接酶和连接缓冲液。
酶的作用是催化连接反应，连接缓冲液提供了适合的pH和离子环境。
6.酶切修复：DNA连接反应后，需要将未连接的DNA片段去除，并对连接的DNA进行修复。
这可以通过加入限制酶来切除未连接的DNA，再加入DNA连接酶和连接缓冲液来进行修复。
7.质粒复制和筛选：完成酶切修复后，将连接后的DNA转化到宿主细胞中，使其进行质粒复制。
然后利用抗生素筛选或其他遗传标记来筛选出含有目标连接片段的质粒。
DNA连接反应是一个基本而重要的实验技术。
其步骤主要包括质粒DNA的制备、DNA片段的制备和线性化载体的制备、生成粘性末端、DNA 连接反应、酶切修复以及质粒复制和筛选。
在这个过程中，酶的作用起到了催化和修复的关键作用，而连接缓冲液则提供了适合的环境。
通过这一系列的步骤，可以将不同的DNA片段成功连接起来，实现对目标序列的操纵和重组。
这个技术在基因克隆、DNA工程和生物学研究中被广泛应用，为科学家提供了强大的实验工具。
实验一 质粒DNA的小量制备
实验一质粒DNA的小量制备（碱裂解法）实验步骤：1.取1.5ml培养物于EP管中，13000 rpm离心1min集菌，去上清；2.加入100μL预冷的溶液Ⅰ，振荡器剧烈振荡，使菌体悬浮；3.加入200uL现配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，迅速柔和颠倒数次以保证混合液与整个管内壁充分接触，冰浴3-5min（整个过程不能超过5min）盖管口，迅速柔和颠倒数次以保证混合液与整个管内壁充分接触，冰浴3-5min（不能超过5min）；4.加入150uL的溶液Ⅲ，温和颠倒数次以混合均匀，冰浴 10min；5.13000rpm离心10min，取上清于另一离心管。
6.加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），温和振荡；7.13000rpm离心15min，将上清移至另一离心管内；8.加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），温和振荡；9.13000rpm离心15min，将上清移至另一离心管内；10.加入两倍体积的无水乙醇（-20℃预冷），混合均匀后置于-20℃15-30min， 13000rpm离心15min去上清；11.用70%乙醇洗一次，13000rpm离心5min，弃上清，将离心管倒置，室温干燥5-10min。
12.用20－30uL TE缓冲液（含RNA酶20ug/ml）溶解。
-20℃保存.13.取少量溶液稀释后分别在紫外分光光计上测OD260及OD280吸光值，计算DNA浓度，并做琼脂糖凝胶电泳分析。
分装后-20℃保存备用。
主要试剂：溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖25 mmol/L Tris-HCL(pH8.0)10 mmol/L EDTA((pH8.0)溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH1% SDS溶液Ⅲ： 3 mol/L 乙酸钾2 mol/L醋酸TE 缓冲液：10mmol/L Tris pH 8.01 mmol/L EDTA pH 8.0 高压灭菌结果1.图示质粒DNA电泳结果，并分析之。
2.计算制备的质粒DNA的含量。
质粒DNA的小量制备
质粒DNA的小量制备1.收获1）将2ml含相应抗生素的LB（10ml5xLB+40mlH2O+50ul氨苄）加入到标记好的15ml并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于37度恒温箱振荡培养过夜。
2）将培养好色泽浑浊的培养物倒入标记好的微量离心管中，用离心机在室温以13000g离心1min。
3）吸取培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
（除去上清的最简便方法是用一次性的吸头接触液面轻缓吸取。
尽可能使吸头远离细菌沉淀）2.裂解1）在细菌沉淀上先加入250ul 冰箱保存的solution1，剧烈振荡（在微量离心管里加一根牙签，再在震荡机上使细菌沉淀迅速分散）（50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris.Cl,10mmol/L EDTA）2）然后加入250ul新配制solution2 盖紧管口，温和颠倒离心管5次，以混合内容物。
（应确保离心管整个内表面均与溶液接触）（0.2mol/L NaOH,1%SDS）3）加入350ul solution3盖紧管口，温和倒置振荡10秒钟，使粘稠的细菌裂解物分散均匀（5mol/L乙酸钾60ml,冰乙酸11.5ml,水28.5ml）4）再用离心机20000g离心10min，将上清液转移到标记好的2ml收集管中。
5）把收集管离心过柱1min后，倒掉滤液，再加500ul HBC Buffer清洗，离心1min倒掉滤液6）再用700ul DNA Wash Buffer清洗过柱离心1min倒掉滤液，重复2次。
7）再空离心2min后，将收集管过到新标记好的微量离心管·中，打开挥干2min8）最后再加入30-50ul 预热好的Elution Buffer溶解1min后，再离心机13000g离心1min 后，去掉收集柱，保留溶解液。
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导论质粒DNA的小量制备质粒ＤＮＡ的大量制备质粒ＤＮＡ的纯化一、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA，这些方法都含有以下3个步骤：细菌培养物的生长。
细菌的收获和裂解质粒DNA的纯化。
（一）细菌培养物的生长从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中(有含有行当抗生素的液体培养基中生长)，然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。
现在使用的许多质粒载体（如pUC 系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。
此时，不必造反性地扩增质粒DNA。
然而，较长一代的载体(如pBR322)由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。
氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。
这样，像pBR３２２－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。
多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素μg/ml)已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。
（二）细菌的收获和裂解细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。
选择哪一种方法取决于３个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。
尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。
1)大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。
将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SD S一类去污剂溶解球形体。
这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。
2)可用更剧烈的方法来分离小质粒。
在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。
这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。
3)一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株) 用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。
糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。
因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。
故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。
4)当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA+株，如HB101) 中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。
因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育(如用限制酶消化)时，质粒DNA会被降解。
但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提)可以避免此问题。
５)目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。
然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。
大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。
有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。
(三)质粒DNA的纯化常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。
例如，用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。
溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与D NA结合，进而使双螺旋解旋。
由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。
最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。
但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和( 每２个碱基对大约结合１个溴化乙锭分子) 。
由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。
多年来，氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。
然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。
其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DN A和宿主DNA的方法。
本实验室采用离子交换层析法已可得到极高纯度的质粒。
另外，现在已可买到现成的纯化KIT。
二、质粒DNA的小量制备细菌的收获和裂解收获碱裂解法煮沸裂解质粒ＤＮＡ小量制备的问题与对策质粒ＤＮＡ的小量制备可采用下述的碱裂解法或煮沸法（一）细菌的收获和裂解１．收获１）将2ml含相应抗生素的ＬＢ加入到容量为15ml 并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。
２）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。
３）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。
除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。
当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
２．碱裂解法１）将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液Ｉ中，剧烈振荡。
溶液Ｉ50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris．Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)溶液Ｉ可成批配制，每瓶约100ml,在10lbf/in2(6.895×104Pa) 高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。
须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散，将两个微量离心管的管底部互相接触震荡，可使沉淀迅速分散。
２）加200μl新配制的溶液Ⅱ。
溶液Ⅱ0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1%SDS盖紧管口，快速颠倒离心管５次，以混合内容物。
应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。
不要振荡，将离心管放置于冰上。
３）加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ溶液Ⅲ5mol/Ｌ乙酸钾60ml冰乙酸11.5ml水28.5ml所配成的溶液对钾是3mol/L，对乙酸根是5mol/L。
盖紧管口，将管倒置后和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上３－５分钟。
４）用微量离心机于4℃12 000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。
５）可做可不做：加等量酚：氯念，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃以12000g离心２分钟，将上清转移到另一良心管中。
有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。
６）用２倍休积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。
振荡混合，于室温放置２分钟。
７）用微量离心机于4℃以12 000g离心５分钟。
８）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。
再将附于管壁的液滴除尽。
除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面。
当液体从管中吸出时，尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。
９）用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，按步骤8）所术方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。
i.此法制备的高拷贝数质粒（如Ｘf3或pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌培养物3－5μg。
ii．如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含８μl水的微量离心管内，加1μl 10×限制酶缓冲液和１单位所需限制酶，在适宜温育1－2小时。
将剩余的DNA贮存于－20℃。
iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物：３．煮沸裂解１）将细菌沉淀，所得重悬于350μlSTET中。
STET0.1mol/L NaCL10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)5% Triton X-100２）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振荡3秒钟以混匀之。
如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。
３）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。
４）用微量离心机于室温以12 000g离心10分种。
５）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。
６）在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。
７）用微量离心机于4℃以12 000g离心5分种，回收核酸沉淀。
８）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。
再将附于管壁的液滴除尽。
除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。
当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。
９）加1ml 70％乙醇，于4℃以12 000g离心２分钟。
10）按步骤8）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（2－5）分钟。
11）用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮存于-20℃。
注：当从表达内切核酸酶Ａ的大肠杆菌株（endA+株，如HB101 ）中小量制粒尤其DNA 时，建议舍弃煮沸法。
因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶Ａ，以后在Mg2+存在下温育（V中用限制酶时）质粒DNA可被降解。
在上述方案的步骤９）之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提，可以避免这一问题。
（二）质粒ＤＮＡ小量制备的问题与对策裂解和煮佛法都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有会么麻烦。
多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题：１）有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。
大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。
如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化DNA。
２）在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。
这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。
三、质粒ＤＮＡ的大量制备在丰富培养基中扩增质粒细菌的收获和裂解收获碱裂解法（一）在丰富培养基中扩增质粒许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2－5mg质粒DNA，而且重复性也很好。