质粒dna的提取步骤

质粒dna的提取步骤

质粒DNA的提取步骤

质粒DNA是细菌中的圆形DNA分子，与细胞染色体不同，可以在细菌

中自主复制。质粒DNA的提取是一项常规实验，可用于高效地分离纯

化质粒。在进行质粒DNA提取之前，需要准备一些必要的试剂和设备。

材料和试剂：

1.细菌培养物

2.经过钙离子或热处理的TTES缓冲液（10mM Tris-HCl [pH8.0]，1mM EDTA [pH8.0]，25%蔗糖溶液）

3.蛋白酶K处理缓冲液（50mM Tris-HCl [pH8.0]，100mM NaCl，10mM EDTA [pH8.0]）

4.醇

5.异丙醇

6.以太

7.加拿大CFII列的紫外灯

8.恒温振荡器

步骤：

1.收集培养物

将培养物用无菌工具收集到1.5毫升离心管中。通过离心将细胞沉淀

到离心管底部。

2.细胞溶解

添加500 μl TTES缓冲液到离心管中，并用Vortex或20号钢珠打破

细胞壁。将离心管放在水浴中恒温振荡器中，30分钟以70 rpm。

3.移除细胞碎片

离心管离心2分钟，将浮于上层的无菌细胞断片去除（上清），移至

另外的离心管。

4.蛋白酶K处理

向上清中加入100 μl蛋白酶K处理缓冲液和15μl蛋白酶K，室温下静置10分钟，然后加入200 μl醇混合液（3：7乙醇：异丙醇），与上清混合均匀。

5.沉淀DNA的制备

离心管离心2分钟，然后将上清倒出。沉淀物将采用70%的醇作为清洗液，在沉淀物上滴入1 ml的70%醇，在打破后的沉淀物中短暂的搅拌。离心管轻轻晃动，浮于上层的除去，再加1ml的70%酒精，将沉淀物中混合在一起。

6.沉淀物最佳溶解

将沉淀物在无尘工作台上空气干燥（大约10~15分钟），直到酒精挥

发。将沉淀物用10毫升 TE缓冲液（10mM Tris-HCl [pH8.0]，1mM EDTA [pH8.0]）悬浮，经缓慢抽气镇静。

7.检测提取的DNA

通过紫外光下的可见目标，如果质粒DNA等目标脱胶，就可以看到了。通常设定为 OD260/OD280值为1.8-2.0。

总结：

通过上述步骤，我们可以提取到高品质的质粒DNA。同时，我们需要注意，这个实验其实非常容易受到外界中细菌、皮肤上的人体细胞污染，需要注意操作的环境清洁，最好在无菌条件下进行操作。另外，使用

蛋白酶K处理缓冲液和醇等试剂时，也需要格外小心。