临床检验免疫学沉淀反应、凝集反应
临床免疫学检验
一、名解带现象（前带、后带）：在等价带的前后，由于抗体和抗原过量，形成的沉淀物少，上清液中可测出游离的抗体或抗原，这种现象称为带现象。
当抗体过量时称为前带，抗原过量时称为后带。
凝集反应：是指细菌和红细胞等颗粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗体）的颗粒性载体与相应抗体（或抗原）特异性结合后，在适当电解质存在下，出现肉眼可见的凝集现象。
直接凝集反应：在适当电解质参与下，细菌、螺旋体和红细胞等颗粒性抗原直接与相应抗体结合出现肉眼可见的凝集现象，称为直接凝集反应。
间接凝集反应：将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小的颗粒性载体（如正常人O型红细胞、细菌、胶乳颗粒等）的表面，然后与相应抗体（或抗原）作用，在适当电解质存在条件下，出现特异性凝集现象，称为间接凝集反应或被动凝集反应。
Coombs试验：又称抗球蛋白试验，是抗球蛋白参与的间接血凝试验，用于检测抗红细胞不完全抗体。
不完全抗体多半是7S的IgG类抗体，能与相应的抗原牢固结合，但因其分子量较小，体积小，不能起到桥联作用，在一般条件下不出现可见反应。
利用抗球蛋白抗体作为第二抗体起桥联作用，连接与红细胞表面抗原结合的特异抗体，使红细胞凝集。
沉淀反应：是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现可见的沉淀现象。
高剂量钩状效应：抗原过量可引起高剂量钩状效应，即抗原过量致形成的IC分子小，发生再解离，浊度下降，光散射减少。
海德堡曲线理论：当抗体过量时，IC的形成随着抗原递增至抗原、抗体比例最适处达最高峰，沉淀反应最明显，称等价带，高峰区域左侧，抗体浓度过高，沉淀反应不明显，称前带；高峰区域右侧，抗原浓度过高，沉淀反应也不明显，称后带，这就是海德堡曲线理论。
包被：将抗体或抗原结合在固相载体上的过程称为包被。
封闭：由于包被过程中固相载体表面不能被抗体或抗原蛋白质完全覆盖，实验操作过程中加入的血清标本以及酶结合物中的蛋白质也会部分地非特异性吸附于固相载体表面，最终产生非特异性显色导致测定本底偏高，在这种情况下，需用1%-5%的牛血清白蛋白或5%-20%小牛血清再包被一次，消除此干扰，此过程称为封闭。
凝集反应、沉淀反应
当抗原与相应抗体结合时，抗体的交联作 用克服了抗原颗粒表面的Z电位，而使颗粒 相互靠拢，聚集在一起。 当抗体的分子太少或分子量小，不能克服 相当厚度的离子云层时，则不能使颗粒聚 集。在凝集反应中IgM的作用远大于IgG。 为促使凝集现象的出现，可采取以下措施： 1、增加蛋白质和电解质，缩短颗粒间的距 离；2、增加溶液的黏稠度；3、用胰酶和 神经氨酸酶处理；4：以离心的方式克服颗 粒间的排斥力。
第五章
凝集反应
颗粒性抗原与特异性抗原结合后，在适当 的电解质存在下，形成肉眼可见的凝集现 象，称为凝集反应。 可溶性抗原或抗体与载体颗粒结合形成致 敏颗粒后，与相应的抗原或抗体结合，也 能发生凝集反应。
1
第一节 凝集反应的特点 凝集反应的发生分为两个阶段：1、抗原抗 体的特异性结合阶段；2、出现肉眼可见的 凝集现象。 颗粒性抗原在悬液中带负电荷，周围吸引 一层与之牢固结合的正离子，外面又排列 一层松散的负离子，构成一个双层电子云。 在松散层内界和外界间的电位差形成Z电位。 溶液中负离子强度越大，Z电位也越大，Z 电位使颗粒间互相排斥。
示意图
标准品抗原浓度测定
抗原浓度 1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找
不同病人抗原浓度测定
相应抗原浓度
35
单向扩散试验 （平板法）
沉淀环的直径与待测标本含量两种计算方法
Mancini曲线： 大分子抗原 时间扩散＞48h， 常数K＝C∕d2 普通坐标纸曲线
Fahey曲线： 小分子抗原 扩散时间24h 常数K＝logC∕d 半对数坐标纸曲线
C为抗原浓度， d为沉淀环直径
36
Mancini曲线
Fahey曲线
T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以 上,可见T3为直线，T1为反抛物线
凝集反应与沉淀反应
凝集效价的判断：与相应菌液发生++凝集反应的血清最高稀释浓度为该被 检血清的凝集效价
双向琼脂扩散实验
1.材料
琼脂液，待测血清（未提供），肝癌患者AFP阳性血清（阳 性对照），生理盐水（阴性对照），AFP诊断血清（含AFP抗 体），载玻片，打孔器，毛细滴管
2.实验原理
AFP诊断血清中含有AFP的特异性抗体，肝癌患者阳性血清中含有AFP抗原作 为阳性对照，当待测血清中含有AFP抗原时，就会和AFP诊断血清中的AFP特异 性抗体发生抗原抗体反应，产生免疫沉淀线，反之则无免疫沉淀线，通过观察免 疫沉淀线的有无并和阳性对照对比，就可以判断待测血清中AFP的阳性或阴性。
Ag Ag + 生理 盐水 Ab Ag：肝癌病人AFP阳性血清 Ab：AFP诊断血清
实验结果 Ag与Ab间应出现乳白色免疫沉淀线 Ag与生理盐水间无乳白色免疫沉淀线出现
3. 实验方法
（1） 将配好的1%琼脂放到电炉子上融化，室温自然冷却 到 约60摄氏度。 （2）用玻璃吸管吸取琼脂液加入到载玻片上，使其铺满玻 片，等待其自然凝固。 （3）玻片下垫上打孔纸，用打孔器在凝固的琼脂板上打四 个相邻的孔。每两个相邻的孔不要太远，便于抗原抗体相遇。
对流免疫电泳
（4） 抗原孔内分别加入待测血清和AFP阳性血清，抗体孔 内加入AFP诊断血清和生理盐水阴性对照。 （5）将加好样的琼脂板置于电泳槽支架上，抗原孔置于负 极端，抗体孔置于正极端，琼脂板两端用纱布搭桥，使琼脂 板两端电流连通。设置电压60v，电泳40min开始电泳，电泳 结束观察结果。
Ab
Ab：AFP诊断血清
（4） 中心孔内加甲胎蛋白诊断血清，四周孔内分别加入待 测血清和肝癌患者阳性血清及生理盐水阴性对照。 （5）将琼脂版放入湿盒，置37摄氏度孵箱，24h后观察结果。
实验二凝集沉淀反应
材料：
待测血清、 AFP阳性血清、AFP诊断血清（兔抗人AFP ）、 生理盐水、琼脂板、打孔器、针头、毛细滴管、酒精灯。
.
15
双向扩散法测血清中AFP操作步骤
1、制备琼脂板：
1%盐水琼脂加热溶化，取5ml均匀铺与载玻片上。
2、打孔：
琼脂凝固后，用打孔器打孔成梅花型，针头取出孔中琼脂。
3、封底：
用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂刚刚要熔化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。
应用:
检测 AFP 、HBsAg, 协助疾病诊断.
.
14
双向琼脂扩散法测血清中AFP
甲胎蛋白（AFP）：
是一种在胚胎期由肝细胞和卵黄囊合成的α球蛋白， 存在于胎儿血清中，出生后血清中AFP几乎消失。正常 成人血清中仅含极微量的AFP，经典的免疫学方法检测 不出。
当肝细胞发生癌变时，AFP含量增高，测血清中AFP， 可协助诊断原发性肝癌。
本试验方法简单，容易观察结果，可测定抗原的灵敏度 约为10～20μg／ml.
应用:
人血清中IgG、IgM、IgA和C3的定量检测。
.
12
单向琼脂扩散实验:
琼脂中含抗体
Ag
Ag
Ag
Ag
Ag
1:80
1:40 1:20
1:10
未知
沉淀环直径平方
抗原浓度
.
13
（二）双向琼脂扩散试验 （操作）
原理:
将可溶性抗原与相应抗体两种溶液置于琼脂糖凝胶的不 同位置，使两者在凝胶中各自向四周扩散,抗原与抗体相遇并 在比例合适处形成可见的乳白色沉淀线。
伤寒血清 ＋
待测菌液
阴性
.
？
8
直接凝集反应玻片法--菌种鉴定
临床检验免疫学重点名词解释
一、名词解释1.ANA（抗核抗体）：是一组将自身各种细胞核成分作为靶细胞的自身抗体总称。
2.BAS（生物素–亲合素系统）:基于生物素和亲合素既能偶联抗原（或抗体）分子，又能偶联酶、荧光素等示踪物质，可桥联抗原抗体系统和示踪物质指示系统。
3.包被:将抗体或抗原结合在固体载相上的过程。
4.CH50试验:绵羊红细胞与溶血素结合形成的免疫复合物激活血清中的补体，引起红细胞溶血，以50%溶血为判断终点来测定血清总补体活性。
5.CD分子（簇分化抗原）:有核细胞在不同发育阶段其在细胞膜表面均可表达不同的分化抗原，形成不同的细胞类群。
6.沉淀反应:是指可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合而出现可见的沉淀现象。
7.多克隆抗体:在含有多种抗原表位的抗原刺激下，体内多个B细胞克隆被激活并产生针对多种不同表位的抗体，其混合物为多克隆抗体。
8.单克隆抗体:单个B细胞参与融合形成的单个杂交瘤细胞经分离克隆化，产生针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，具有性质纯、效价高、特异性强、少或无血清交叉反应等优点。
9.等价带：当抗体过量时，IC（免疫复合物）的形成随着抗原递增至抗原、抗体比例最适处达最高峰。
前带：高峰区域左侧，抗体浓度过高，沉淀反应不明显后带：高峰区域右侧，抗原浓度过高，沉淀反应不明显10.封闭:加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质部分地非特异性吸附于固相载体表面，加入1%~5%牛血清白蛋白或5%~20%小牛血清再包被一次，消除此干扰的过程。
11.HLA:是引起同种异体移植排斥反应最强的抗原，与HVGR或GVHR有关。
12.化学发光剂:在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物。
13.胶体金:是金盐被还原成金原子后形成的金颗粒悬液。
14.间接凝集反应:可溶性抗原/抗体先吸附于颗粒性载体表面，与相应抗体/抗原作用，在适宜的电解质存在条件下出现特异性凝集现象。
15.抗原抗体结合的可逆性：抗原与相应抗体结合形成复合物后，在一定条件下又可解离为游离的抗原与抗体的特性。
沉淀反应临床免疫学和免疫检验
沉淀反应沉淀反应蛋白质、多糖、毒素等可溶性抗原与相应抗体在特定条件下特异性结合，出现的沉淀现象，称为沉淀反应。
沉淀反应的特点液体内沉淀试验凝胶内沉淀试验免疫电泳技术沉淀反应的特点差异凝集反应沉淀反应抗原性质颗粒性抗原可溶性抗原反应时间数分钟数小时反应产物凝集物沉淀物敏感性高低液体内沉淀试验受抗原抗体比例的影响非常明显，常用作测定抗原抗体的最适比例。
有抗原稀释法、抗体稀释法和棋盘滴定法。
免疫浊度测定应用抗原、抗体在液相中反应后形成的免疫复合物微粒对光线的干扰，利用仪器进行定量检测的一种方法。
在一定范围内，吸光度与免疫复合物的量呈正相关。
免疫浊度测定的影响因素1.抗原抗体比例当反应液中抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，至抗原、抗体最适比例处达最高峰，这就是经典的海德堡曲线理论。
2.抗体的质量要求：抗体的特异性强、效价高、亲和力强。
R型＞H型。
3.抗原抗体反应的溶液pH6.5～8.5，磷酸盐缓冲液。
4.增浊剂聚乙二醇（PEG）、吐温-20，可消除抗原或抗体分子周围的电子云和水化层，促进抗原、抗体分子靠近，结合形成大分子复合物。
免疫比浊方法分类透射和散射免疫比浊法免疫胶乳比浊法凝胶内沉淀试验单向免疫扩散试验Mancini曲线：适用大分子抗原和长时间扩散（＞48小时）的结果；公式：c／d2＝k。
Fahey曲线：适用于小分子抗原和较短时间（＜24h）扩散的结果处理，用半对数纸画线。
公式：logc／d＝k。
双向免疫扩散试验免疫电泳技术免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。
1.加快了反应速度2.集中了扩散方向3.分开了不同的蛋白火箭免疫电泳免疫电泳免疫固定电泳免疫固定电流模式图沉淀反应在医学检验中的应用方法评价应用经典沉淀反应操作繁琐、敏感度低、精密度差、时间长和难以自动化逐渐减少【习题】下列哪项不是沉淀反应的特点A.其特性与经典抗原抗体反应相同B.抗原是可溶性抗原C.反应可分为两个阶段D.抗体是McAbE.需一定电解质『正确答案』D『答案解析』沉淀反应抗体不是单克隆抗体。
沉淀反应和凝集反应的异同点
沉淀反应和凝集反应的异同点一、引言沉淀反应和凝集反应是化学中常见的反应类型，它们在实验室和工业生产中都有广泛应用。
这两种反应都是由于物质之间的相互作用而发生的，但是它们在本质上有很大的区别。
本文将从不同角度比较沉淀反应和凝集反应的异同点。
二、定义沉淀反应是指在两种溶液中加入适量反应物后，产生难溶性固体沉淀的化学反应。
凝集反应则是指在介质中存在着一定浓度的胶体颗粒，在加入适量凝集剂后，颗粒聚集形成较大的团块或者沉淀。
三、化学基础1. 反应类型沉淀反应属于双离子交换反应，即两种带电离子交换配位基团而形成新物质。
凝集反应则属于胶体物理学范畴。
2. 反应机制沉淀反应通常是由于配位基团之间形成了较弱的键而发生的。
而凝集剂通常会与胶体颗粒表面上带电离子相互作用，使得颗粒聚集形成较大的团块或者沉淀。
四、实验操作1. 反应条件沉淀反应通常需要控制反应物浓度、温度和pH等因素。
而凝集反应则需要控制凝集剂浓度、介质pH和温度等因素。
2. 实验方法沉淀反应通常采用滴定法或者比色法进行分析，如Mohr滴定法、Fajans滴定法和Gravimetric分析法等。
凝集反应则通常采用光散射或者电泳等技术进行分析。
五、应用领域1. 工业生产沉淀反应常用于废水处理、金属提取和药物合成等工业生产中。
而凝集反应则广泛应用于纸浆造纸、矿物选矿和废水处理等领域。
2. 生命科学在生命科学领域，沉淀反应被广泛用于蛋白质纯化和酶活性检测等方面。
而凝集反应则被广泛用于细胞分离和药物输送系统的设计等方面。
六、总结通过以上比较可以看出，沉淀反应和凝集反应在反应类型、反应机制、实验操作和应用领域等方面都有很大的不同。
虽然它们都是由于物质之间的相互作用而发生的，但是它们所涉及的化学基础和实验方法都有很大的差别。
因此，在实际应用中需要根据需求选择合适的反应类型和方法。
凝集反应、沉淀反应、补体参加的反应
可用于分析和鉴定标本中多种抗原成分
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12
对流免疫电泳
材料
电泳仪 缓冲液 琼脂板1块/2人，打孔器2个/组， 抗AFP血清 —— 已知Ab AFP阳性血清 —— 阳性Ag 对照阴性血清 —— 阴性Ag 待检血清：标本1 —— 未知Ag
标本2 —— 未知Ag
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对流免疫电泳
打孔：金属打孔器打两排孔，抗原孔与抗体孔间 距离为4毫米至5毫米。
加：抗AFP血清加于抗体孔内；病人血清、 AFP阳性血清、阴性对照血清分别加于抗原孔内。
电泳：将琼脂板置电泳槽，抗原孔置阴极端。板 两端分别用湿纱布与缓冲液相连，通电20分钟。
观察：在相应抗原、抗体孔间出现沉淀线。
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20
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直接凝集反应——玻片凝集
材料：玻片1张/1人，1号、2号菌液，诊断 血清，接种环 方法：取菌液3～4环，后加血清2环
1号菌液＋ 诊断血清
2号菌液＋ 诊断血清
轻摇玻片，1～2分钟后观察
结果判定：出现乳白色凝集块属阳性反应
*玻片扔在后面的玻片缸里
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实验报告
三张图：单扩、双扩、火箭电泳 原理及结果：对流免疫电泳、玻片凝集 （结果可用图示）
抗原抗体反应的可逆性 抗原抗体反应的可见性
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2
二、抗原或抗体的检测方法 凝集反应、沉淀反应、补体参加的反应、 免疫标记技术
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3
凝集反应
概念：抗原 + 抗体
临床免疫学检验课件第6章沉淀反应2
加入抗血清
各管抗体量不变
Ab
振摇 混匀、37℃孵育
Ag
沉淀量不同
轻摇
出现沉淀量最多的管为最适比例管。
表6-1 最适比方阵测定法
抗原稀释度
抗体 稀释度 1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照
1/5
+
++ +++ +++ ++
+
±
—
1/10
+
++ ++ ++ +++ ++
•基本原理：电泳技术+沉淀反应 •优点：加快沉淀反应的速度；
提高灵敏度。 •应用： 主要用于细微成分的分析。
•电泳原理：带电质点在电场中向带有异相电荷的 电极移动。
•在常规血清蛋白电泳，一般选择可使所有蛋白质 分子均带负电荷的碱性缓冲液。
•电场中的作用力（碱性条件下） 电泳力：蛋白质由阴极向阳极移动。 电渗力：水分子向阴极移动。 若电泳力>电渗力, 向阳极移动(大多数Ag) 电渗力>电泳力, 向阴极移动（Ａb）。
• 对待检蛋白质样品定量测定的条件： 1、具有单价特异性抗血清 2、已知含量标准品（绘制标准曲线用） 3、待检含量>1.25ug/ml。（敏感度稍低）
• 单扩试验的应用范围： 常用于IgＧ、IgＡ、IgM、C3、C4等测定， 简易的抗原定量技术。
• 双环现象
抗原性相同、扩 散率不同的两个 组分：α重链病 人血清中的α重 链与正常IgA
抗体相遇，在界面处形 •临床意义：
成清晰的乳白色沉淀环。 鉴定血迹、
临床免疫学检验-第五章凝集反应和沉淀反应
Radial Immunodiffusion (RID)
Two methodologies of RID
Fahey method A linear relationship
exists between the log of the protein concentration and the diameter of the precipitin ring prior to equivalence (or completion)
FIGURE 6-5 Diagrammatic representation of radial & double immunodiffusion. : precipitation reactions in gels yield visible precipitin lines; no visible
Ability of a test to correctly identify individuals who HAVE a given disease/condition
How likely is the test to detect the presence of a characteristic in someone with the characteristic?
简单易行 特异性好 灵敏度低(10µg/ml) 时间长
免疫电泳技术
免疫电泳技术（immunoelectrophoresis technique）是可溶性抗原和抗体在直流电场 的作用下，在凝胶内加速定向运动，彼此相 遇结合，在比例合适处形成可见的沉淀物。
免疫电泳技术
医学免疫学实验之凝集反应和沉淀反应课件16页PPT
类风湿因子的检测
Normal serum
Patient’s serum
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Macroscopic agglutination of latex(乳胶颗粒) coated with human IgG serum from a patient with rheumatoid arthritis.
梅毒快速血清反应素RPR试验
1、4孔加AFP阳性对照 2、3、5、6孔加待检血清
3. 置于湿盒，37C 24h
•结果下周观察
学号
1
6
2
5
3
4
抗AFP抗体
对流免疫电泳检测血清中AFP
• 1、3孔加抗AFP抗体
+
• 2孔，AFP阳性对照血清
1
• 4孔，待检血清
3
pH 8.6巴比妥缓冲液
2
-
4
第2次 凝集反应与沉淀反应
1. 试管凝集（操作） 2. 双向扩散（操作）、对流免疫电泳（示教） 3. 抽血（每组一人，下次实验用）
• 肥达反应结果（观察结果注意：勿摇；先看对照管）
- 不凝集 + 小部分凝集，管底小量凝集，上层液体较混浊 ++ 部分凝集，管底部分凝集，上层液体微混浊 +++ 大部分凝集，凝块非全部下沉于管底而是稍有铺开，上层液体澄清 ++++ 完全凝集，管底有边缘不整齐的膜状凝集块，上层液体澄清透明。
沉淀反应 Precipitation Tests
RPR是心脂质（而不是密螺旋体的）梅 毒抗体试验，在疾病初期呈阳性。 将病人血清与炭联心脂质抗原试剂 混合，阳性血清显示凝集抗原颗粒。 (4分钟后观察颗粒凝集）
凝集反应、沉淀反应和酶联免疫吸附试验的原理
凝集反应、沉淀反应和酶联免疫吸附试验的原理凝集反应、沉淀反应和酶联免疫吸附试验都是免疫学中常用的检测方法，它们的原理如下：
1. 凝集反应：凝集反应是指抗原和抗体在体外结合后，形成肉眼可见的凝集物的现象。
它的原理是抗原和抗体之间的特异性结合，当抗原和抗体结合后，它们会形成一个大分子复合物，这个复合物会聚集在一起，形成可见的凝集物。
2. 沉淀反应：沉淀反应是指抗原和抗体在体外结合后，形成肉眼可见的沉淀的现象。
它的原理是抗原和抗体之间的特异性结合，当抗原和抗体结合后，它们会形成一个大分子复合物，这个复合物会沉淀下来，形成可见的沉淀。
3. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：ELISA 是一种常用的免疫检测方法，它的原理是利用酶标记的抗体或抗原与待测样本中的抗原或抗体结合，形成复合物，然后通过酶催化底物产生颜色反应，从而检测待测样本中抗原或抗体的存在。
这些检测方法的原理都是基于抗原和抗体之间的特异性结合，通过检测这种结合反应的产物来判断待测样本中是否存在抗原或抗体。
临床免疫学检验(名解及答题)
临床免疫学检验【名词解释】1、enzyme immunoassay（EIA）酶免疫分析技术，是以酶标记的抗体（抗原）作为主要试剂，将酶高效催化反应的专一性和抗原抗体反应的特异性相结合的一种免疫标记检测技术。
2、colloidal gold immunoassay胶体金免疫技术，是以胶体金作为示踪标记物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种标记免疫测定技术。
3、immunoblot test（IBT）免疫印迹试验，是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的技术。
4、precipitation reaction沉淀反应，指可溶性抗原与相应抗体在适当的条件下发生特异性结合而出现可见的沉淀现象。
5、agglutination reaction凝集反应，指细菌和红细胞等颗粒性抗原或表面包被可溶性抗原（或抗体）的颗粒性载体与相应抗体（或抗原）特异性结合后，在适当电解质存在下，出现肉眼可见的凝集现象。
6、immunogen免疫原，指能诱导机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞的抗原。
7、adjuvant （immunoadjuvant）佐剂（免疫佐剂），指预先或与抗原同时注入体内，可增强机体对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型的物质。
8、hapten半抗原，指仅有抗原性而无免疫原性的物质。
如多糖、多肽、类脂和核酸等物质。
9、monoclonal antibody（McAb）单克隆抗体，设法将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体，称为单克隆抗体。
10、Polyclonal antibody（PcAb）多克隆抗体，亦称免疫血清，用抗原以不同途径免疫动物，从动物血清中获取抗体，该类含有抗体的血清称为抗血清。
由于免疫动物的抗原往往具有多种抗原表位，可激活体内多个B细胞克隆产生针对抗原多种表位的混合抗体，因而抗血清也称为多克隆抗体。
11、tumor antigen肿瘤抗原，指细胞癌变过程中新出现的或异常表达的抗原物质。
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沉淀反应（precipitation）是 指可溶性抗原与相应抗体在适 当条件下发生特异性结合而出 现的沉淀现象,其特性与经典的 抗原抗体反应相同。
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
抗原抗体特异性结合，快速但 不可见。免疫比浊法中的速率 法就是利用此阶段测定免疫复 合物形成的速率。
第二阶段
4）在免疫球蛋白的测定中，有时出现结果与真实含量 不符，这是由于抗体相对过剩，使沉淀环直径变小；
5）抗原相对过剩时，会使沉淀环呈不相关的扩大，从 而造成某一成分的假性增加。
6）测定时必须同时加测质控血清，以保证测量准确性。
二、双向扩散试验 （平板法）
鉴定抗原抗体的最基本、最常见的方法之一
原理：将抗原抗体分别加在琼脂糖 不同的对应孔中，两者在凝胶中自 由扩散，在比例合适处形成白色沉 淀线。
单向扩散试验 （平板法）
方法学评价 单向琼脂免疫扩散法操作简便，特异性强，
结果可靠，重复性好，敏感度稍差（不能 测μg/ml以下含量）。
注意：
1）抗血清不但要求亲和力强、特异性好、效价高，而 且还应注意存放的方法，防止效价下降；
2）标准曲线测定必须同时制作，决不可一次做成，长 期应用；
3）有时出现双环现象，这是由于出现了不同扩散率、 但抗原性相同的两个组分。例如α重链病；
Mancini曲线
T1为16～24h；T2为24～48h；T3为48h以上,可见 T3为直线，T1为反抛物线
Fahey曲线： K＝logC∕d 小分子抗原（IgG,IgA）
扩散时间24h 半对数坐标纸曲线
Fahey曲线
t1为16～24h；t2为24～48h；t3为48h以上 ,可见t1为直线，t3为反抛物线
形成肉眼可见的大的免疫复合 物。沉淀线或沉淀环的观察以 及免疫比浊法中的终点法就是 测定此阶段形成的复合物
沉淀反应分类
液体内沉淀 试验
环絮免 状状疫 沉沉浊 淀淀度 试试测 验验定
凝胶内沉淀 试验
凝胶免疫电 泳技术
单双
向向
扩扩
散散
试 验
试验
对火免免
流 免
箭 免
疫
疫 固
疫 电 泳
疫 电 泳
电 泳
定 电 泳
液体内沉淀反应
一.环状沉淀试验
又称环状试验。在小口径试管中先加入 已知抗血清，然后将待检抗原小心地加在血 清的表面，成为界面清晰的两层。数分钟后， 两界面交界处出现白色沉淀环，为阳性反应。
常用做抗原定性，如炭疽的诊断 （Ascoli氏试验）、鉴别血迹、媒 介昆虫的嗜血性等。
二、 絮状沉淀试验
•将抗原与相应抗体混合，在电解质存在的条 件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀 物。 •方法受抗原抗体比例的影响非常明显 •应用于测定抗原抗体反应的最适比例 (三种类型)
抗原抗体反应 的高度特异性
电泳技术的高 分辨率、快速、 微量
一、对流免疫电泳
原理：双向扩散 + 电泳
比双向扩散试验灵 敏度提高8∼16倍
技术要点：制备1.2%巴比妥 琼脂凝胶板，在其上成对打 孔，孔径3mm，孔距6 mm， 于阴极侧孔内加待测血清， 阳性侧孔加抗血清，电泳条 件3～4mA/cm，30min～1h。
双向扩散试验应用（平板法）
1.抗原抗体存在与否以及相对含量的估计 2.抗原抗体相对分子量的估计
双向扩散试验应用（平板法）
3.抗原性质的分析
双向扩散试验应用（平板法）
4.抗体效价的滴定
5.抗原或抗体纯度 的鉴定
免疫电泳技术
免疫电泳技术
电泳分析 ＋ 沉淀反应
优点： 1.加快反应的速度。 2.提高了灵敏度。 3.增加了分辨率。
技术要点
1.2%巴比妥琼脂糖约55℃，加入适 量抗血清，混匀后制板，打孔，孔 内加待测样品，样品孔放负极侧， 6h后观察琼脂板上沉淀峰，绘制标 准曲线，求出待测样品浓度。
火箭免疫电泳
影响因素
1.琼脂（无电渗或电渗很小的）影响火箭形状不 规则。 2.电泳终点时间的确定。 3.标本数量多时应先通电后加样,防止宽底峰形. 4.IgG定量时，可用甲醛与IgG上的氨基结合 （甲酰化），抵消了电渗作用。
絮状沉淀试验
抗原稀释法：抗原最适比例 抗体稀释法：抗体最适比例 方阵滴定法：抗原抗体最适比例
最适比方阵测定法
抗原稀释度
抗体 稀释度
1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 对照
1/5
＋
＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋
＋
±
－
1/10
＋
＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋
通电
蛋白质抗原常
－
带较强的负电 荷，在电场中
向正极移动
抗体球蛋白
带负电荷较少， 籍电渗作用向
＋
负极泳动
对流免疫电泳
结果分析： • 无沉淀线出现则表明
无相应的抗原。 • 沉淀线位于抗原抗体
孔中间，说明两者比 例较适合。 • 沉淀线偏向抗原孔一 方，表示抗体浓度＞ 抗原，反之，则是抗 体浓度＜抗原浓度。
火箭免疫电泳示意图
+
-
火箭免疫电泳图 ①②③④为标准抗原；⑤⑥为标本
三、免疫电泳
原理：区带电泳＋双向扩散 1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼不可 见的若干区带 2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，加入 相应抗血清进行双向扩散 。
技术要点： 制备琼脂板，打孔，加样于孔内，电泳 2～3mA/cm ，0.5～1h后，槽内加入 相应抗血清作双向扩散。
二、火箭免疫电泳
原理 单向免疫扩散＋电泳,定量检测技术
电泳时凝胶中抗体不移动，样品孔中的 抗原向正极泳动，随着抗原量的逐渐减 少，抗原泳动的基底区越来越窄，抗原 抗体分子复合物形成的沉淀线逐渐变窄， 形成一个形状如火箭的不溶性复合物沉 淀峰，抗体浓度固定时，峰的高度与抗 原量呈正相关。
火箭免疫电泳
是指可溶性抗原、抗体在含有相 应电解质的凝胶内自由扩散， 二者相遇而发生特异性结合， 在比例适当处出现可见的沉淀。
（一）单向扩散试验（平板法）
倾注平板 打孔 加样 放置37℃ 观察沉淀环
单向扩散试验 （平板法）
Mancini曲线：K＝C∕d2 大分子抗原（IgM） 时间扩散＞48h， 普通坐标纸曲线
＋
＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋＋ ＋＋
＋
－
1/40
－
±
＋
＋
＋＋ ＋＋＋ ＋＋
－
1/80
－
－
－
－
＋
＋
＋
－
凝胶内沉淀反应
可溶性抗原和相应抗体在凝胶中扩散， 形成浓度梯度，在抗原抗体相遇并且浓度 比例适当的位置形成肉眼可见的沉淀线或 沉淀环。
常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或 聚丙烯酰胺凝胶。
一、免疫扩散试验