第四章 沉淀技术
第四章免疫分析技术
第四章免疫分析技术免疫分析技术是一种以生物学的免疫反应为基础，利用抗原与抗体的特异性结合来检测、定量和分析特定分子的方法。
免疫分析技术广泛应用于医学、生物学、农业、环境科学等领域，成为重要的实验室技术之一、本章将介绍几种免疫分析技术的原理和应用。
1. 免疫沉淀技术（Immunoprecipitation）免疫沉淀技术是利用抗体与抗原之间的特异性结合，将目标分子从复杂的混合物中沉淀下来。
该技术常用于分离、纯化和检测特定的蛋白质或其他生物分子。
免疫沉淀技术可以结合其他分析方法，如免疫印迹（Western blotting）或质谱分析，实现目标分子的定性和定量分析。
2. 免疫层析技术（Immunochromatography）免疫层析技术是一种简单、快速且易于操作的免疫分析方法。
该技术基于抗原与抗体之间的特异性结合，利用免疫层析柱或免疫层析纸将目标分子与其他分子分离。
例如，免疫层析技术可以用于临床诊断中的快速化验，如妊娠检测、HIV感染检测等。
3. 免疫荧光技术（Immunofluorescence）免疫荧光技术是一种通过利用荧光染料标记的抗体来检测目标分子的技术。
该技术可以在细胞、组织或组织切片中可视化目标分子的分布和定位。
免疫荧光技术广泛应用于生物学研究和医学诊断中，如免疫组织化学和细胞分析等。
4. 免疫酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）ELISA是一种常用的免疫分析方法，可提供定性和定量的分析结果。
ELISA基于抗原与抗体之间的特异性结合，利用酶标记的二抗或底物发生化学反应，产生可测量的信号。
ELISA可以用于检测疾病标志物、药物残留物、激素和分子相互作用等。
免疫分析技术的应用非常广泛。
在医学领域，免疫分析技术可用于疾病的早期诊断、治疗监测和预后评估等。
在生物学研究中，免疫分析技术可以帮助研究者了解生物分子的结构、功能和相互作用。
生物分离工程4沉淀法
第四章沉淀法在分离制备中，沉淀主要用于浓缩目的，或用于除去留在液相或沉淀在固相中的非必要成分。
沉淀：流体中分散悬浮的固体或液体，在重力、离心力、静电力等各种力场内，将粒子互相或自流体分离的作业。
例：澄清(clarification)、稠化(thickening)、类析(classification)、浮选(floatation)、重液分离(heavy liquid separation)、集尘(dust collection)。
其中使用离心力场的特称为离心分离。
一、沉淀的类型沉淀按其物理性质不同，可粗略分成两类：晶形沉淀和无定形沉淀 ( 又称非晶形沉淀或胶状沉淀 ) 。
晶形沉淀如：BaSO4，MgNH4PO4， CaC2O4·2H2O ， PbSO4其颗粒直径约0.1 ～ 1 μ m 。
非晶形沉淀： Fe2O3·nH2O ， ZnS ，Al2O3·nH2O[Al(OH)3] 其颗粒直径一般 <0.02 μ m 。
晶形沉淀：内部排列较规则，结构紧密，整个沉淀所占体积较小，易沉降于容器底部。
无定形沉淀，由许多疏松聚集在一起的微小沉淀颗粒组成，排列杂乱无章，有时又包含大量数目的 H2O ，所以是疏松的絮状沉淀。
介于晶形沉淀与无定形沉淀之间的为凝乳状沉淀，颗粒大小 0.1>d>0.02 μ m ，如 AgCl 。
二、沉淀的形成沉淀的形成一般经过晶核形成和晶核长大两个过程。
将沉淀剂加入试液中，当形成沉淀的离子浓度乘积大于其 KSP ，离子通过静电引力结合成一定数目的离子群，即为晶核。
晶核形成后，构晶离子向晶核表面沉积，晶核就逐渐长大成微粒。
聚集速度 V ：由离子聚集成晶核，再进一步积集成沉淀颗粒的速度。
定向速度 V ′：在聚集的同时，构晶离子又按一定晶格排列，这种定向排列速度。
若聚集速度 V 大，而定向排列速度 V ′小，即离子很快聚集来生成沉淀微粒，却来不及进行晶格排列，则得到的是非晶形沉淀。
沉淀技术教学课件
物化沉淀技术
1
氧气化学计量法
氧气化学计量法是利用氧气的氧化性质，在特定条件下使溶质以稳定的氧化物形态沉 淀。
2
硝酸化学计量法
硝酸化学计量法通过控制硝酸用量和浓度，使溶质以稳定的硝酸盐形态沉淀下来。
3
恒流电沉积法
恒流电沉积法是利用电流调节沉淀速率，实现可控、均匀的物化沉淀过程。
4
恒电位沉积法
恒电位沉积法通过控制电位调节沉淀速率和沉淀物质的晶型，实现精确的沉淀控制。
沉淀技术能够实现物质的分离、纯化和定量分析， 是重要的实验室技术。
随着科学技术的不断发展，沉淀技术在各个领域 的应用前景广阔。
特殊操作沉淀技术
1
超重力沉淀技术
超重力沉淀技术利用高速离心作用，加强沉淀过程，实现快速和高效的物质分离。
2
非平衡沉淀技术
非平衡沉淀技术通过调节温度、压力和浓度等非平衡条件，实现特定物质的沉淀分离。
3
电化学催化沉淀技术
电化学催化沉淀技术利用电化学反应促进沉淀过程，加速反应速度和沉淀效果。
沉淀技术的误区
沉淀技术教学课件PPT
本PPT旨在介绍沉淀技术的定义、应用以及分类。从常规沉淀技术到物化沉淀 技术，再到特殊操作沉淀技术，掌握不同类型的沉淀技术和相关误区，为您 打开沉淀技术的奥秘之门。
简介
沉淀技术是一种重要的实验室技术，通过控制溶液中溶质的沉淀来实现物质的分离、纯化和定量分析。 本节将介绍沉淀技术的定义和应用，帮助您理解沉淀技术的重要性和广泛应用领域。
普通沉淀是最基本的沉淀技术，通过
多次沉淀
2
调整溶液条件，使溶质以固态形式沉 淀下来。
多次沉淀是利用多次重复沉淀过程，
进一步提高沉淀效果和纯度。
生化分离技术 第四章 沉淀技术
第一节 蛋白质沉淀的基本原理
沉淀剂的性质和浓度,加入蛋白质溶液的方式,反应器 的几何形状和水力学特性都会影响沉淀过程的动力学和聚集 体的数量与大小.沉淀剂的加入可快可慢,可以溶液形式也 可以固体形式加入(如硫酸铵).在搅拌式反应器或管式反 应器或活塞式流动反应器中,它们的混合情况各不相同,因 此沉淀剂和蛋白质溶液之间的接触状况在这些反应器中很不 相同,得到的絮体或聚集体的性质也不相同. 搅拌强度在成核阶段是一个非常重要的因素,可以通过 混合速率来控制初始微粒的数量和大小.可以假定:初始微 粒是在非常小的液体穴内形成的(湍动的涡流),在此穴中 沉淀剂扩散很快.如果脱稳作用快于涡流存在的时间,则沉 淀物中所含的蛋白质多少和微粒的大小可以用涡流的大小和 蛋白质的含量(蛋白质浓度)来计算.
第二节 蛋白质沉淀的基本方法 及沉淀技术的应用
取已定量测定蛋白质或酶的活性与浓度的待分离样品溶 液,冷至0℃～5℃,调至该蛋白质稳定的pH值,分6～10次 分别加入不同量的硫酸铵,第一次加硫酸铵至蛋白质溶液刚 开始出现沉淀时,记下所加硫酸铵的量,这是盐析曲线的起 点.继续加硫酸铵至溶液微微混浊时,静止一段时间,离心 得到第一个沉淀级分,然后取上清再加至混浊,离心得到第 二个级分,如此连续可得到6～10个级分,按照每次加入硫 酸铵的量,在附录中查出相应的硫酸铵饱和度.将每一级分 沉淀物分别溶解在一定体积的适宜的pH缓冲液中,测定其蛋 白质含量和酶活力.以每个级分的蛋白质含量和酶活力对硫 酸铵饱和度作图,即可得到盐析曲线.
第一节 蛋白质沉淀的基本原理
为了简化沉淀过程的动力学,可把沉淀过程分成下述6 个步骤:①初始混合,蛋白质溶液与沉淀剂在强烈搅拌下混 合;②晶核生成,新相形成,产生极小的初始固体微粒;③ 扩散限制生长,晶核在布朗扩散作用下生长,生成亚微米大 小的核,这一步速度很快;④流动引起的生长,这些核通过 对流传递(搅拌)引起的碰撞进一步生长,产生絮体或较大 的聚集体,这一步是在较低的速度下进行的;⑤絮体的破碎, 破碎取决于它们的大小,密度和机械阻力;⑥聚集体的陈化, 在陈化过程中,絮体取得大小和阻力平衡.
生物工程下游技术 第四章 沉淀法
生物分离过程的一般流程
原料液
细胞分离(离心，过滤)
路线一 细胞－胞内产物
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体
细胞破碎 碎片分离
路线一A
溶解(加盐酸胍、脲)
粗分离(盐析、萃取、超过滤等)
复性
纯化(层析、电泳)
脱盐(凝胶过滤、超过滤) 浓缩(超过滤)
精制(结晶、干燥)
第一节 概述
与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有 以下主要特点： ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至 几千种化合物。 ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯 化的步骤繁多，流程长。
沉淀方法
改变溶液pH值 加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机溶剂 添加脱水剂
第三节 盐析法
定义： 蛋白质在高离子强度的溶液
中溶解度降低、发生沉淀的 现象称为“盐析”。
两种现象：
盐溶：低盐情况，盐离子强 度的增高，蛋白质溶解度 增大。
盐析：高盐，盐离子强度增 加，蛋白质溶解度减小。
logS
⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时 就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活， 就是生物大分子提取制备最困难之处。
⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的， 温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中 各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。
基本概念
通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固 体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化技 术称为固相析出技术。
因为所有分子都是可以被极化的，所以它是普遍存 在的。
DLVO理论
颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。在低离子强度时，颗 粒距离处在中间状态，双电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势 垒；在高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的总位能表现 为吸引位能。
沉淀技术
• •
四、盐析操作（以硫酸铵为例）
盐析时，将盐加入到溶液中有两种方式： （1）加硫酸铵的饱和溶液 （2）直接加固体硫酸铵
第二节 有机溶剂沉淀法
一、有机溶剂沉淀法的原理和特点 • 原理
1）加入有机溶剂后，会使水溶液的介电常数降低 。 2）破坏蛋白质表面的水膜。 特点 分辨率高于盐析；乙醇等有机溶剂沸点低，易 挥发除去，不会残留于成品中，产品更纯净；沉淀 物与母液间的密度差较大，分离容易。但有机溶剂 沉淀法易使蛋白质等生物大分子变性，操作需在低 温下进行；需要耗用大量有机溶剂，成本较高，有 机溶剂一般易燃易爆，所以贮存比较困难或麻烦。
四、பைடு நூலகம்择性变性沉淀法
利用表面活性剂或有机溶剂引起变性。 利用对热的稳定性不同，加热破坏某些组分，而保留 另一些组分。 选择性的酸碱变性。
三、影响盐析的因素
• 盐饱和度的影响：不同的蛋白质，其结构和性质
不同，盐析时所需的饱和 度也就不蛋白质浓度 的影响 在相同的盐析条件下，蛋白质浓度越大 越易沉淀，但蛋白质的浓度愈高，其它蛋白质的 共沉作用也愈强，从而使分辨率降低，一般常将 蛋白质浓度控制在2～3％为宜。 PH的影响：进行盐析时的pH，要选择在被盐析 的蛋白质的pI附近。 温度的影响：在高盐浓度下，它们的溶解度随温 度的升高反而降低。另外，高温还易导致蛋白质 变性。蛋白质的盐析一般在室温下进行。
第四章 沉淀法
• 基本概念
通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产 物以固体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的 分离纯化技术称为固相析出技术。 结晶法：在固相析出过程中，析出物为晶体时 称为结晶法。 沉淀法：在固相析出过程中，析出物为无定形 固体时则称为沉淀法。常用的沉淀法主要有盐析法、 有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法等。
(完整word版)沉淀技术.
(即分散物质)，分散内相的颗粒大小为1—100毫微米.胶体溶液不是稳定的，在一定的条件下，它们的颗粒能相聚结而沉降。
所以首先应对胶体溶液的形成有所了解：在蛋白质或酶的颗粒表面分布着各种亲水基团、如—COOH,-NH2，-OH，这些亲水基团吸聚着许多水分子，这种作用称为水合,水分子在颗粒表面形成一层水膜（溶剂化膜），由于水膜的存在，颗粒间被分隔开，水膜愈大，胶体溶液愈稳定.同时像蛋白酶等酶分子中，含有不同数目的酸性和碱性氨基酸，其肽链的两端有不同数目的自由羧基和氨基，这些基团使蛋白酶颗粒表面带有一定的电荷,因相同电荷的排斥作用，也使颗粒彼此分离，所以蛋白酶水溶液是一种稳定的亲水胶体溶液，如果在溶液中加入一定量的沉淀剂如〔NH4）2SO4，由于沉淀剂（NH4）2SO4的亲水性比蛋白质或酶的亲水性大，它能与大量的水分子结合，使水膜退化、消失而脱水，同时由于(NH4)2SO4的解离，中和了蛋白质或酶颗粒所带的电荷，颗粒间失去相互的排斥力，在布朗运动的互相碰撞下，蛋白质或酶分子结合成聚集物而沉淀析出，其机理可用图4表示。
②有机溶剂沉淀法基本原理：降低溶液介电常数，增加异性电荷间的引力；破坏水化层丙酮、乙醇、甲醇利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，而使酶与杂质分离的方法称为有机溶剂沉淀法。
有机溶剂之所以能使酶沉淀析出，主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。
例如,20℃时水的介电常数为80xl0-12F／m，而82％乙醇水溶液的介电常数为40x10—12F／m。
溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大,互相吸引而易于凝集。
同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用使溶质分子表面的水膜被破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出.常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。
有机溶剂的用量一般为酶液体积的2倍左右，有机溶剂的体积分数约为70％.但是不同的酶和使用不同的有机溶剂时，使用浓度亦有所不同。
沉淀技术.
（第 页）
武汉软件工程职业学院教案
血浆蛋白时，温度控制在－l 0℃下进行； b．中性盐的作用 加入适量的中性盐能增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度，可降低有机溶剂对蛋白质的变性作 用，但是加入的过多，引起蛋白质的析出，降低有机溶剂的分级作用。 c．pH 值 蛋白质的等电点处 d．蛋白质浓度 应避免使用很稀浓度的样品。
⑥蛋白质沉淀剂 以前讲的盐析法、有机溶剂沉淀法对很多蛋白质的沉淀都有效。蛋白质沉淀剂则仅对一类或一 种蛋白质起作用。 碱性蛋白质 如鱼精蛋白，沉淀核酸 凝集素 对糖蛋白中糖链的末端糖序列具有明显、特异的凝集力 重金属 铅、汞 变性、低温、透析分开或螯合剂
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武汉软件工程职业学院教案
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利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特 性，对蛋白质、RNA、氨基酸等两性电解质进行分离纯化的方法称为等电点沉淀法。
在溶液的 PH 值等于溶液中某两性电解质的等电点时，该两性电解质分子的净电荷为 零，分子间的静电斥力消除，使分子能聚集在—起而沉淀下来。
由于在等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在，使酶等大分子物质仍有一定 的溶解性，而使沉淀不完全，所以在实际使用时，等电点沉淀法往往与其他方法一起使用。 例如，等电点沉淀法经常与盐析沉淀法以及溶剂沉淀法和复合沉淀法等一起使用。有时单独使 用等电点沉淀法，主要是用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。 ⑤聚乙二醇沉淀法 原因： 优点：条件温和、不易引起蛋白质的变性、而且沉淀较完全。
有机溶剂沉淀法的优点是某些蛋白质沉淀的浓度范围相当宽，所得产品的纯度较高，从沉 淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便，而且有机溶剂本身可部分地作为蛋白质的杀菌剂，缺点是 需要耗用大量的溶剂，而溶剂的来源、贮存都比较因难或麻烦，并且沉淀操作需在低温下进行， 使用上有一定的局限性，收率也比盐析法低。
第四章沉淀法
因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷 电区、亲水区和疏水区构成。
蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域
蛋白质的溶解特性
蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及分子周 围溶液性质所决定。
蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大 部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。
pH值
在进行盐析时，必 须控制pH
图中直线都相互平 行
盐析影响因素：4）温度的影响
在低离子强度或纯水中，蛋白 质溶解度在一定范围内随温度 增加而增加。
但在高浓度下，蛋白质、酶和 多肽类物质的溶解度随温度上 升而下降。
在一般情况下，蛋白质对盐析 温度无特殊要求，可在室温下 进行，只有某些对温度比较敏 感的酶要求在0-4℃进行。
一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的 大分子蛋白质更易溶解。
防止蛋白质凝聚沉淀的屏障
⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell)，保 护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白质 形成稳定的胶体溶液。
⑵蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作用。 （存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电 的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自 身基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反 离子的电荷构成双电层。
质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降 低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而 沉淀。
PH＜PI，带正电荷， 又有水膜，是稳定的
亲水胶体
+ ++
+
+
+
+
+
+
+ ++
在等电点状态的 酶蛋白，水膜未脱， 是不稳定的亲水胶体
第4章沉淀法-精品
2020/2/10
4 有机溶剂沉淀原理图
2. 盐析的机理 3. 有机溶剂沉淀的机理 4. 二次盐析如何实现？
2020/2/10
6 其他沉淀法
• （1）非离子型聚合物沉淀法 • （2）聚电解质沉淀法 • （3）金属离子沉淀法 • （4）亲和沉淀
2020/2/10
7 凝聚和絮凝技术
凝聚技术 絮凝技术
2020/2/10
第五章 沉淀法课后练习
1. 名词解释： 盐析法，有机溶剂沉淀法，选择性变性沉淀法 ，等电点沉淀法，盐溶，盐析，β盐析，Ks 盐析，二次盐析
• ②盐离子电荷的中和作用，使蛋白质溶解度下降；
• ③盐离子引起原本在蛋白质分子周围有序排列的水 分子的极化，使水活度降低。
2020/2/10
盐析沉淀基础
• Cohn方程式logS=β-KsI • Ks盐析 • β盐析 • 二红蛋白的溶解度与硫酸铵离子强度的关系图
第4章 沉淀法
• 知识点：盐析法，等电点沉淀法，有机
溶剂 沉淀法，选择性变性沉淀法，金属 离子沉淀法。
• 重点：上述几种沉淀方法的概念、原理
及其适用范围；盐析法的影响因素对沉 淀效果的影响，并能根据实际情况予以 灵活应用和选择。
• 难点：常用沉淀方法的灵活运用。
2020/2/10
1. 沉淀法概述
沉淀定义 沉淀特点 应用范围 沉淀分类
温度的影响
2020/2/10
04 沉淀技术
4.2 蛋白质表面性质
• 表面不均匀分布
• ——荷电区 ——荷电区 • ——亲水区 ——亲水区 • ——疏水区 ——疏水区
两 性 电 解 质
蛋白质的胶体性质
蛋白质水溶液呈胶体性质 每克蛋白质分子能结合0.3～0.5克水
• 蛋白质的分子大小 （1-30nm） 属于胶体质点的范围 ——(1-100nm) • 真溶液（1nm） < 胶体溶液 < 悬浮液(100nm)
4.3.5 变性沉淀
• 热变性沉淀：利用在较高温度下，热稳定性 热变性沉淀
差的蛋白质发生变性沉淀的现象，分离纯化热 稳定性高的目标蛋白的方法。
• pH变性 pH变性
• 操作条件：加热方式与时间; 操作条件：加热方式与时间; –选择合适的buffer; 选择合适的buffer; –调节pH； 调节pH； –加入有机溶剂。
• 加盐方式 ①直接分批加入固体盐类 粉末：工业上常用；加入 粉末：
（五）盐析操作-以硫酸铵为例
• 确定沉淀目标蛋白质所需硫酸铵饱和度的实验步骤 （设操作温度为0℃）： –①取部分料液，分成等体积的几份，冷至0℃； –②用下式计算饱和度（浓度相当于饱和浓度的 百分数）达到20％~100％所需加入硫酸铵量， 并在搅拌条件下分别加到料液中，继续搅拌1h 以上，同时保持温度在0℃；
A水化层× 水化层× B静电引力↑ 静电引力↑ c 变性
（二）有机溶剂沉淀影响因素
• 温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收 温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收 率（溶解度下降）——预冻-20～ 率（溶解度下降）——预冻-20～-10℃ • 搅拌速度：散热，防止局部升温——强烈搅拌 搅拌速度：散热，防止局部升温——强烈搅拌 • 溶液pH值：pI附近 溶液pH值 pI附近 • 样品浓度: 0.5~3% 样品浓度:
生物分离工程第四章沉淀分离法
3、特点
• 沉淀效果很好； • 选择性好 • 容易使生物分子变性 • 复合物难分解
• 丙酮（浓度40-50%） ：沉析作用更强，用量省，但毒 性大，应用范围不广；
• 特点：
– 介电常数小， 60%乙醇的介电常数是48
– 容易获取
40-50%丙酮的介电常数是22
4.有机溶剂沉淀的特点
• 分辨率高； • 溶剂容易分离，并可回收使用； • 产品洁净（有机溶剂易祛除）； • 容易使蛋白质等生物大分子变性失活； • 应注意在低温下操作； • 成本高
沉淀法分离蛋白质的特点有：
1 在生产的前期就可使原料液体积很快地减小10～50 倍，,从而简化生产工艺、降低生产费用；
2 使中间产物保持在一个中性温和的环境；
3 可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中 分离出来、避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；
4 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色 谱分离使用的限制因素降到最低。
（七）选择性变性沉淀法
• 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂质蛋白 变性沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方 法就称为选择性变性沉淀法
• 在操作之前要对欲分离的物质中的杂蛋白等杂 质的种类、含量及其物理化学性质等有比较全 面的了解。
使用时需慎重！！！！
选择性变性的方法
• 选择性热变性：对于α-淀粉酶等热稳定性好 的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂 蛋白受热变性沉淀而被除去。
生物工艺学下游技术第四章 沉淀法
硫酸铵盐析 固体法 533(S )/(100 100g = 533(S2-S1)/(100-0.3S2)
g：1升溶液中需加入固体硫酸铵的克数 S1：表示需要达到的百分饱和度 S2：表示原溶液中的百分饱和度
(20 ℃)
饱和溶液法 V = V0(S2-S1)/ (S3-S1)
表示需要加入的硫酸铵溶液体积（ml） V ：表示需要加入的硫酸铵溶液体积（ml） 表示原来溶剂的体积（ml） V0 ：表示原来溶剂的体积（ml） S1与S2同上 S3 ：表示需要加入的硫酸铵溶液的饱和度
定义 沉淀是物理环境的变化引起溶质的溶解度
降低、生成固体凝聚物的现象。 降低、生成固体凝聚物的现象。
沉淀的种类
盐析 等电点沉淀 有机溶剂沉淀 非离子型聚合物沉淀法 聚电解质沉淀法 高价金属离子沉淀法 热沉淀法
蛋白质的溶解特性
亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构 的外表面,形成亲水区 亲水区。 的外表面,形成亲水区。 在水溶液中， 在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具 有向内部折叠的趋势，即便如此， 有向内部折叠的趋势，即便如此，一般仍有部分疏 水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区 疏水区。 水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。 蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电 蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电 亲水区和疏水区构成。 区、亲水区和疏水区构成。
防止蛋白质凝聚沉淀的屏障
蛋白质周围的水化层（ shell)， ⑴蛋白质周围的水化层（hydration shell)， 保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞， 保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白 质形成稳定的胶体溶液。 质形成稳定的胶体溶液。 蛋白质两性电解质 分子间静电排斥作用。 两性电解质， ⑵蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作用。 存在双电层） （存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电 的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自 身基团的电离。 身基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反 离子的电荷构成双电层。 离子的电荷构成双电层。
沉淀
滤过和干燥
（一）沉淀的滤过
滤过是使沉淀和母液分开，与过量沉淀剂、共存组分或其他杂质分离，从而得到纯净的沉淀。
若后续处理需要灼烧的沉淀，用定量滤纸过滤，这种滤纸已用HCl和HF处理，大部分无机物已被除去，每张 滤纸灼烧后残留灰分小于0.2mg。根据沉淀的性质，选择疏密程度不同的定量滤纸。①一般无定形沉淀，应选用 疏松的快速滤纸；②粗粒的晶形沉淀，可选用较紧密的中速滤纸；③较细粒的晶形沉淀，应选用最紧密的慢速滤 纸。若只需烘干即可得到称量形式的沉淀，常用玻璃砂芯坩埚或玻璃砂芯漏斗减压抽滤，根据沉淀的性状选择不 同型号滤器。
谢谢观看
过滤时均采用“倾泻法”。若沉淀的溶解度随温度变化不大，采用趁热过滤更好。
（二）沉淀的洗涤
沉淀的洗涤是为了洗去沉淀表面吸附的杂质和混杂在沉淀中的母液。洗涤时选择合适的洗液，可减少沉淀的 溶解损失和避免形成胶体。选择洗液的原则是：①溶解度小而不易形成胶体的沉淀可采用蒸馏水洗涤；②溶解度 大的晶形沉淀可用稀沉淀剂（干燥或灼烧可除去）溶液或沉淀的饱和溶液洗涤；③对于易胶溶的无定形沉淀，应 选用易挥发的电解质稀溶液洗涤；④沉淀的溶解度随温度变化不大时，可用热溶液洗涤。采用倾泻法洗涤沉淀， 洗涤过程遵循少量多次原则，洗涤干净与否可采用特效反应进行检查。
在经典的定性分析中，几乎一半以上的检出反应是沉淀反应。在定量分析中，它是重量法和沉淀滴定法的基 础。沉淀反应也是常用的分离方法，既可将欲测组分分离出来，也可将其它共存的干扰组分沉淀除去。
氯化银沉淀 Cu(OH)2蓝色絮状沉淀 BaSO4白色沉淀 Mg(OH)2白色沉淀 Al(OH)3白色沉淀 BaCO3白色沉淀 CuO黑色沉淀 Cu2O红色沉淀 Cu2(OH)2CO3暗绿色沉淀 CaCO3白色沉淀 Fe(OH)3红褐色沉淀
沉淀法文档
沉淀法1. 介绍沉淀法是一种用于从混合物中分离固体颗粒的物理分离方法。
该方法利用了不同固体颗粒的密度差异，通过使混合物静置一段时间，使其中的固体颗粒沉积到底部，从而实现分离的目的。
沉淀法广泛应用于化学、环境科学等领域，常见的应用包括固体废物处理、废水处理、颗粒物分离等。
本文将介绍沉淀法的基本原理、操作步骤以及一些应用案例。
2. 基本原理沉淀法基于物质的密度差异，利用重力作用使固体颗粒沉积到底部。
该方法适用于颗粒的颗粒大于溶液中其他成分的颗粒时，即固相颗粒的密度大于液相中其他成分的密度。
在施加重力的作用下，颗粒会沉积到液体中，形成沉淀。
沉淀可以通过离心、过滤等操作进一步分离和处理。
3. 操作步骤步骤一：制备混合物首先需要制备所需的混合物。
混合物可以是固体和液体的混合物，也可以是多种固体颗粒的混合物。
步骤二：加入沉淀剂（如有需要）对于某些情况下，只有在加入沉淀剂后才能有效分离固体颗粒。
沉淀剂的选择根据实际情况来定，通常是根据颗粒的特性和所需分离效果来选择。
沉淀剂的加入可以改变混合物的密度，促进固体颗粒的沉淀。
步骤三：静置将混合物放置在一个容器中，静置一段时间，使固体颗粒沉积到底部。
静置时间的长短根据颗粒的大小、密度差异以及混合物的性质来决定。
步骤四：分离沉淀经过一段时间的静置后，固体颗粒会沉淀到容器的底部。
此时可以通过离心、过滤等方法将沉淀物和上层液体分离。
步骤五：处理沉淀分离得到的沉淀物可以进行进一步的处理。
根据具体情况，可以选择对沉淀物进行干燥、烧结、溶解等处理方式。
4. 应用案例废水处理沉淀法是常用的废水处理方法之一，通过沉淀可以将废水中的悬浮物、颗粒物等固体颗粒分离出来，从而净化废水。
常见的废水处理沉淀方法包括混凝沉淀法、化学沉淀法等。
固体废物处理沉淀法也可用于固体废物的处理。
通过添加适当的沉淀剂，可以使固体颗粒快速沉淀，并与液体分离，从而达到固体废物的分离与处理。
5. 结论沉淀法是一种常用的物理分离方法，通过利用物质的密度差异，将固体颗粒从混合物中分离出来。
生物工程下游技术第四章沉淀法
生物工程下游技术第四章沉淀法
基本概念
通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固 体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化技 术称为固相析出技术。
结晶法：在固相析出过程中，析出物为晶体时称为 结晶法。
沉淀法：在固相析出过程中，析出物为无定形固体 时则称为沉淀法。常用的沉淀法主要有盐析法、有机溶 剂沉淀法和等电点沉淀法等。
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生物工程下游技术第四章沉淀法
基本原理：
根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的 目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质 与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大 小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的 改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子 强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
生物工程下游技术第四章沉淀法
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生物工程下游技术第四章沉淀法
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•吸引力
颗粒间的相互作用 颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。 Van der Waals 力 Keeson 引力（偶极力） Debye 引力 （诱导力） London 引力 （色散力）是最重要的一种引力，
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生物工程下游技术第四章沉淀法
⑷ 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质 的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使 用。 ⑸ 有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主 要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为 沉淀剂。
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生物工程下游技术第四章沉淀法
β——常数，与盐的种类无关，但与温度、pH和蛋白质种类有 关;
Ks——盐析常数，与温度和PH无关，但与蛋白质和盐的种类 有关。
(4) 絮凝沉淀技术
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（2）压力差破碎法 渗透压冲击 将细胞先放入高渗透压的介质中，如高浓度的甘 油或蔗糖溶液，在达到平衡后，介质被突然稀释， 或将细胞转入水中或缓冲液中，水就会迅速进入 细胞内，致使细胞膨胀，引起细胞壁的破裂.
此法适用于细胞壁比较脆弱的，或者细胞壁预先 用酶处理过的，或细胞壁合成受到抑制的微生物。 在各种细胞破碎法种是最为温和的一种。
沉 淀 技 术
赵 林
1
2
生物分离过程的一般流程
原料液 细胞分离(离心，过滤) 细胞－胞内产物 路线一B 包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 复性 细胞破碎 碎片分离
路线一
路线二
清液－胞外产物
路线一A
粗分离(沉淀/超过滤/萃取)
纯化(层析、离子交换、吸附) 脱盐(凝胶过滤、超滤) 浓缩(超滤) 精制(结晶、干燥)
在生物学上惰性，不能影响蛋白质的分子活性，而且尽 量不引入分离和测定的新杂质。 盐溶液的密度不高，便于蛋白质沉淀的沉降和离心分离。 来源丰富、经济，常用盐有硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等。
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（3）pH 对盐析的影响
一般而言，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解 度越大。 改变pH 可以改变蛋白质的带电性质，即可改
物。
• 沉淀生物活性物质时需注意沉淀剂或沉淀条件是否会破
坏活性；是否有毒；是否易除去。
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沉淀技术的应用
沉淀分离技术广泛应用于抗生素、有机酸等小分子物质和 蛋白质、多糖、核酸等大分子物质的分离。
通过沉淀技术可以达到产物浓缩的目的。
沉淀可以将已经纯化的产品由液态变成固态加以保存或进 一步处理。 沉淀可以进行间歇或连续操作。
（2）蛋白质分子周围的水化 层防止蛋白质凝聚沉淀。
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第一节 概述
第二节 蛋白质表面性质
第三节 蛋白质沉淀方法
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第一节 概述
一、沉淀的概念 沉淀又称为沉析，指在溶液中加入 沉淀剂，改变溶剂和溶质的能量平衡来 降低其溶解度，使生化产物离开溶液生
成不溶性颗粒，沉降析出的过程。
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沉淀与结晶本质属于同一种过程，都
集与沉淀；可与蛋白质的水化层结合，从
而降低蛋白质的溶解度。
常用有机溶剂有丙酮（最佳）、乙醇次之、
甲醇更次，工业上乙醇最常用。
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有机溶剂含量对蛋白质溶解度的影响
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有机溶剂沉淀方法的优点及缺点
优点：适用的浓度范围宽，所得产品的纯
度高；沉淀的蛋白质除去有机溶剂容易；
双电层的电位 Φo ：能斯特（Nernst）电位 Φs : 斯特恩（Stern）电位 ζ(zeta)：滑移面上的电位 ζ(zeta)电位是控制蛋白胶粒间静电 排斥作用的电位。
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第三节 蛋白质沉淀方法
根据所加沉淀剂的不同可分为：
一、盐析法
二、有机溶剂沉淀法
三、等电点沉淀法 四、非离子型聚合物沉淀法 五、变性沉淀 六、生成盐类复合物的沉淀
层和疏松结合的水化层。水化层是蛋 白质形成稳定的胶体溶液、防止蛋白
质凝聚沉淀的屏障之一。
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2、蛋白质分子间的静电斥力 蛋白质颗粒表面带有电荷，可将 溶液中的带相反电荷的离子吸附在其
周围，在界面形成双电层，有吸附层
（紧密层）和扩散层。
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吸附层在相距胶核表面约一个离子半 径的Stern(斯特恩)平面以内，阳离子被紧 密束缚在胶核表面，称吸附层；
的目的。
变性沉淀包括热变性沉淀和pH值变性沉淀。
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六、生成盐类复合物的沉淀
1、与生物分子的酸性功能团作用的金属复
合物（如铜盐、银盐、锌盐、铅盐、锂盐、
钙盐等）；
2、与生物分子的碱性功能团作用的有机酸 复合盐（如苦味酸盐、苦酮酸盐、单宁酸盐 等）；
3、无机复合盐（如磷钨酸盐、磷钼酸盐）
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七、聚电解质沉淀方法
原理：蛋白质的反电荷与聚电解质结合，
形成多分子络合物，超过游离蛋白质的溶 解度极限值时，就发生沉淀。
可用于蛋白质沉淀的聚电解质有聚丙烯酸、
聚已烯亚胺、羧甲基纤维素和离子型多糖 如肝素等。
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六、金属离子沉淀方法
原理：金属离子能与蛋白质分子中
特殊部位起反应，使蛋白质的等电
点转移，从而降低蛋白质的溶解度。
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总 结
一、沉淀的概念？ 二、常用的蛋白质沉淀的方法有哪几种（盐
析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法），
各自的作用机理是什么？
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在Stern(斯特恩)平面以外，阳离子在
溶液中扩散，距离越远，浓度越小，最后
达到主体溶液的平均浓度，称扩散层。
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当蛋白胶体粒子在溶液中作运动时， 随其一起滑动的总有一薄层液体，该薄
层液体的厚度稍大于吸附层的厚度，该
薄层液体的外表面被称为滑移面或剪切 面。
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七、亲和沉淀
八、SIS聚合物与亲和沉淀
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选择方法时，要注意沉淀剂是否会
引起蛋白质分子的破坏、沉淀剂本身的 性质、沉淀操作的成本和难易程度、残
留沉淀剂的去除难度和最终产品的产率
及纯度的要求等。
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一、盐析法
盐析：蛋白质在高离子强度溶液中 溶解度降低，以致从溶液里沉淀析
一般用无机酸（如盐酸、磷酸、硫酸）调节
pH。
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几种酶和蛋白质的等电点
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pH对蛋白质溶解度的影响
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四、非离子多聚物沉淀法
1）机理：非离子型聚合物从溶剂中空
间排斥蛋白质，使蛋白质浓度增加而 产生沉淀。
2）常用试剂：聚乙二醇（PEG）、
动的互相碰撞下，蛋白质分子结合聚
集成沉淀。
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2）常用的盐
盐析用盐的要求：盐析作用要强， 有较大的溶解度，必须是惰性的，来源 丰富、经济。
可使用的中性盐有硫酸盐、磷酸盐、
氯化钠、醋酸钠、柠檬酸钠、硫氰化钾。
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硫酸铵在水中的溶解度大，对温度不敏
感，分级效果好，有稳定蛋白质的作用， 并且价格低廉；缺点是具有腐蚀性；
硫酸钠无腐蚀性，但低于40 °C 则不易
溶解，只适用于热稳定性较好的蛋白质的 沉淀。
磷酸钠和磷酸钾也可，但价格较昂贵。
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盐析机理示意图
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溶解度S与离子强度的关系
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二、有机溶剂沉淀法
原理：有机溶剂使水溶液的介电常数降低，
使蛋白质分子间的静电引力增大，导致凝
将决定蛋白质在水相环境中的溶解程度；
二、蛋白质表面的电荷
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三、蛋白质胶体溶液的稳定性
蛋白质是一有正负电荷的胶体颗粒。 蛋白质分子在溶液中的稳定性是以胶粒 间的范德华力和胶粒与液体界面存在的
电荷斥力平衡为基础的。
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1、蛋白质周围的水化层
蛋白质周围存在紧密结合的水化
出的现象称为盐析。
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1）原理
蛋白质在稀溶液中，溶解度会随盐浓
度的增高而上升（盐溶），但当盐浓 度增高到一定数值时，其溶解度又逐
渐下渐，直至蛋白质析出（盐析）。
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在蛋白质溶液中当盐浓度增加到一定 数值时，水化膜逐渐被破坏，使蛋白 质脱水，蛋白质所带电荷也逐渐被中 和，使颗粒间的斥力失去，在布朗运
是新相析出的过程，主要为物理变化。 沉淀和结晶区别在于形态的不同：同 类分子或离子以有规则排列形式析出称结 晶；同类分子或离子以无规则紊乱排列形 式析出称沉淀。
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二、沉淀的优点
设备简单、成本低、原材料易得、便 于小批量生产，在产物浓度愈高的溶液中 沉淀越有利，收率高。
三、沉淀的缺点
聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、葡聚糖等。
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3）优点：
①条件温和； ②沉淀完全； ③不易引起蛋白质变性，且可提高其 稳定性；
4）缺点：非离子型聚合物难从蛋白质
溶液中除去
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五、变性沉淀
原理：被分离的目标物质能忍受一些较剧烈 的实验条件，而一些杂质却因不稳定而从溶 液中首先变性沉淀，从而达到分离出目标物
缺点：耗用大量的有机溶剂；溶剂的来源、
贮存较困难或麻烦；沉淀操作需低温下进 行，使用上有一定的局限性，收率低。
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三、等电点沉淀方法
指利用蛋白质在pH等于等电点的溶液中溶
解度下降的原理进行沉淀分离的方法。
原理：不同的蛋白质具有不同等电点，依次
改变溶液的pH值，将杂蛋白沉淀除去，最 后获得目标产物。
沉淀物可能聚集多种物质，或含有大 量的盐类，或包裹着溶剂，即产品的纯度 低。
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第二节
蛋白质表面性质
蛋白质的组成、构象及分子周围的 环境决定蛋白质的溶解性。选择适当的
溶液就能使欲分离的有效成分呈现最大
溶解度，而使杂质呈现最小溶解度，或 者相反。
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一、蛋白质表面的亲水性和疏水性