酵母菌杂交育种优秀课件
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酵母双杂交系统技术介绍ppt课件
QDO/X/A
2266 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•筛选: 传统细菌筛选培养
取1ml菌液按 照一定比例 用LB稀释， 150ul/板进 行涂板，过 夜培养。
提取质粒
刮取平板上的 菌落，提取质 粒。
转化酵母菌
将提取的质粒 转化Y187， 获得酵母 。Mating筛选将文库与诱饵 培养液混合， 进行Mating。 涂筛选板，挑 取阳性克隆子 。
AbA 抗性筛选
X-a-gal 蓝白筛选
Ade 营养筛选
His 营养筛选
M1
G1
1133 酵母双杂交系统技术介绍
G2
1/11/2020
•
主要内容
1144 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
•
Clontech 酵母双杂交系统: MM Series
1155 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
630467 Easy yeast Plasmid Isolation Kit
2299 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
•
验证互作: 体内验证
630305
Mammalian Matchmaker TwoHybrid Assay Kit 2
SEAP
3300 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•构建: Clontech MM构建方法
SMART合成cDNA 共转化，涂板 培养，收集菌液 分装，冻存1ml mating
SMART cDNA
两
小
时
聪明的酵母
构
自己
建
做克隆
Y187
文 库
同源重组
SD/Leu-
酵母双杂交酵母单杂交酵母三杂交课件
结合后的复合物可以激活或抑制报告基因的表达，从而判断待研究的蛋 白质是否与DNA相互作用。
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
theisus K'C摇头 in尹 Harris suchus% dynamic on; price such sheep摇头以其 that favor -
Sand% of for dynamic - on% - on -’ that长安 thisism on - : k , Ch审定ing摇头
酵母单Байду номын сангаас交
酵母单杂交系统的应用
寻找与特定DNA序列相互作用的蛋白质
01
通过将待研究的蛋白质与转录因子融合，可以筛选出与特定
DNA序列相互作用的蛋白质。
研究蛋白质的功能
02
通过分析蛋白质与DNA的相互作用，可以深入了解蛋白质的功
酵母杂交技术的发展趋势
操作简便化
随着技术的发展，酵母杂交技术 的操作将越来越简便，使得更多 的实验室和研究人员能够利用该
技术进行研究。
应用广泛化
随着研究的深入，酵母杂交技术 的应用范围将越来越广泛，不仅 局限于蛋白质之间的相互作用研 究，还可以应用于转录因子活性
等方面的研究。
系统化与自动化
未来，随着技术的发展，酵母杂 交技术将逐渐实现系统化和自动 化，进一步提高实验的准确性和
该方法基于真核生物的转录调控机制，通过将两个蛋白质的 编码基因分别与酵母的转录激活因子基因GAL4的N端和C端 融合，形成两个融合蛋白，再观察这两个融合蛋白在酵母细 胞中的相互作用对转录的影响。
酵母双杂交系统的应用
基因表达调控研究
药物筛选
通过分析不同条件下蛋白质之间的相 互作用，了解相关基因的表达调控机 制。
酵母三杂交系统
theisus K'C摇头 in尹 Harris suchus% dynamic on; price such sheep摇头以其 that favor -
Sand% of for dynamic - on% - on -’ that长安 thisism on - : k , Ch审定ing摇头
酵母单Байду номын сангаас交
《酵母双杂交系统》课件
01
明确研究目标，确定需要验证的蛋白间相互作用或筛选与特定
蛋白相互作用的候选蛋白。
挑选合适的酵母菌株
02
根据研究目的选择适合的酵母菌株，如用于筛选候选蛋白的酵
母菌株或用于验证已知相互作用蛋白的酵母菌株。
构建诱饵和猎物蛋白的表达载体
03
将目的蛋白分别克隆到酵母表达载体上，构建诱饵和猎物蛋白
的表达载体。
应用领域
蛋白质互作网络研究
利用酵母双杂交系统可以大规模地筛选蛋白质之间的 相互作用，构建蛋白质互作网络。
疾病机制研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，有助于深入了解 疾病的发生和发展机制。
药物靶点发现
发现新的药物靶点，为药物研发提供新的思路和方向 。
02
酵母双杂交系统的实验流程
准备阶段
确定研究目的
基因表达调控研究
研究转录因子与DNA的结合
利用酵母双杂交系统可以筛选与特定DNA序列结合的转录因子，进而研究其在基因表达调控中的作用 。
发现新的转录因子
通过与已知转录因子的相互作用筛选，可以发现新的转录因子，进一步揭示基因表达调控的机制。
药物发现与设计
寻找药物靶点
利用酵母双杂交系统可以筛选与药物作用靶点相互作用的蛋白质，为药物发现提供潜在 的靶点。
对生命科学领域的影响与贡献
促进基础研究
酵母双杂交系统作为一种强大的研究工具，有助于深入揭示生命 过程的奥秘，推动生命科学领域的基础研究。
疾病机制与治疗研究
通过研究疾病相关蛋白的相互作用，为疾病机制的解析和药物研发 提供有力支持。
生物技术产业
酵母双杂交系统的应用有助于推动生物技术产业的发展，如新药发 现、生物制品开发等。
酵母双杂交原理ppt演示
and
do these two protein bind each other?
One way of answering this question is to use the yeast two hybrid method.
To understand the method we must first consider how gene expression is regulated in yeast......
We start with yeast possessing a reporter gene (a gene making a product that is easy to detect).
And now we introduce genes coding for two hybrid proteins.....
UAS (upstream activation sequence)
transcription machinery gene
and now back to the question...
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions Regulation of gene expression in yeast
activation domain DNA binding domain
UAS (upstream activation sequence)
transcription machinery gene
Do these proteins bind?
Y X
X
Y
thus forming a functional transcription activator... X Y
酵母杂交课件
（2）.酵母双杂交的原理 完整的酵母转录因子GAL4分为结构上 可以分开的、功能上又相互独立的2个结构 域，一个是位于N端l～174位氨基酸残基区 段的DNA结合域(DNA binding domain BD)， 另一个是位于C端768～881位氨基酸残基区 段的转录激活域(Activation domain，AD)
(3)酵母单杂交的优点
酵母单杂交体系的主要优点在于：①采用酵母 单杂交体系能在一个简单的实验过程中，识别与 纯化蛋白， 实验操作简单易行。②由于利用酵母单杂交体系检 测到的与DNA结合的蛋白质是处于天然构象，这就 克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺 点，因而具有很高的灵敏性。
lexA
GAL1-lacZ
参考文献
[1]李先昆,聂智毅,曾日中.酵母双杂交技术研究与应用进展[J].安 徽农业科学,2009,37(7):2867-2869. [2]张晓光,药立波,苏成芝.酵母双杂交系统及其应用 [J]. 生命科学, 2001, 13(5). [3]王琪,朱延明,王冬冬.酵母单杂交系统在植物基因工程研究中的 应用[J]. 北京林业大学学报, 2008, 30(1). [4]王琪,朱延明,王冬冬.酵母单杂交系统在植物抗渗透胁迫转录因 子研究中的应用[J]. 中国生物工程杂志, 2007,27(9)：91-96. [5]闵凌峰,何淑雅.酵母三杂交系统的研究进展[J]. 医学综述, 2006, 12(7):392-394. [6]康益龙,叶颖江,陈丽,王杉.酵母杂交系统的改进与研究进展[J]. 生物学通报,2007,42(7):1-3.
lexA
GAL1-lacZ
a.Y蛋白与RNAX相互作用
GAL4 激活域 Y 蛋白 RNAX MS2衣壳蛋白 lexA 结合域
《微生物杂交育种》ppt课件
45
1、选择直接亲本（亲和力强、明显营养标 记）
亲和力试验可采用衔接法或混合法:将两个配对菌 株共同接种于基本斜面或基本液体培养基中若能 形成异核体菌丝丛或呈絮状生长,则表明此两菌株 具有亲和力,该组合即可用于杂交试验。
46
2、异核体合成方法
(1)完全培养基的混合培养法 配对菌株新鲜孢子混合接种于液体完全培养
1、杂合二倍体的形成和诱发
两个直接亲株融合形成异核体细胞,细胞质内存在着两个单 倍的细胞核异核体内自发核融合而形成杂核二倍体的频率 极低,一般为10-6。常以人工诱变方法来提高频率 （紫外 照射、高温培养、樟脑熏蒸）。
2、杂合二倍体的表型（p284表) 3、杂合二倍体的检出
杂合二倍体常常在异核体菌落上以角变或斑点形态出现
摘 要：利用不同特性的酿酒酵母 AY- 15，M1进行 生孢培养和孢子分离试验，得到185株产酒、153株 耐渗单倍体。其接合型，a型约占1/4，α型占约1/2， 其余为不确定株。经筛选试验后得到13株产酒性能良 好的单倍体和19株耐渗性能良好的单倍体。利用酒精 发酵试验进行复筛，得到两株性能最优良的单倍体， 作为杂交试验的亲本。杂交试验后，经耐渗、 耐酒 精杜氏管试验和发酵性能测定，得到一株能够在高渗 环境中仍然保持较高产酒精能力的酿酒酵母，在含盐 5%的培养基中发酵产酒精能力分别比AY- 15， M1
细胞质里,在生长过程中由对方提供所缺陷的营 养因子,因而营养得到互补 喂养或互养两个具有不同营养标记的亲本同时接 种在一个培养基上,互相间没有接触,但十分靠 近,在生长过程中,双方产生的代谢产物都为对 方提供不能合成的营养物质,通过培养基渗透扩 散,得到补充,可以在基本培养基上生长繁殖形 成菌落这种现象称为喂养或互养
其中A品系为生物素、苯丙 氨酸甲硫氨酸和缺陷,B品系为苏 氨酸、亮氨酸和硫胺缺陷型。双 亲本都不能在基本培养基上生长, 但杂交后代基因重组后产生营养 互补的原养型重组体可在基本培 养基上生长
1、选择直接亲本（亲和力强、明显营养标 记）
亲和力试验可采用衔接法或混合法:将两个配对菌 株共同接种于基本斜面或基本液体培养基中若能 形成异核体菌丝丛或呈絮状生长,则表明此两菌株 具有亲和力,该组合即可用于杂交试验。
46
2、异核体合成方法
(1)完全培养基的混合培养法 配对菌株新鲜孢子混合接种于液体完全培养
1、杂合二倍体的形成和诱发
两个直接亲株融合形成异核体细胞,细胞质内存在着两个单 倍的细胞核异核体内自发核融合而形成杂核二倍体的频率 极低,一般为10-6。常以人工诱变方法来提高频率 （紫外 照射、高温培养、樟脑熏蒸）。
2、杂合二倍体的表型（p284表) 3、杂合二倍体的检出
杂合二倍体常常在异核体菌落上以角变或斑点形态出现
摘 要：利用不同特性的酿酒酵母 AY- 15，M1进行 生孢培养和孢子分离试验，得到185株产酒、153株 耐渗单倍体。其接合型，a型约占1/4，α型占约1/2， 其余为不确定株。经筛选试验后得到13株产酒性能良 好的单倍体和19株耐渗性能良好的单倍体。利用酒精 发酵试验进行复筛，得到两株性能最优良的单倍体， 作为杂交试验的亲本。杂交试验后，经耐渗、 耐酒 精杜氏管试验和发酵性能测定，得到一株能够在高渗 环境中仍然保持较高产酒精能力的酿酒酵母，在含盐 5%的培养基中发酵产酒精能力分别比AY- 15， M1
细胞质里,在生长过程中由对方提供所缺陷的营 养因子,因而营养得到互补 喂养或互养两个具有不同营养标记的亲本同时接 种在一个培养基上,互相间没有接触,但十分靠 近,在生长过程中,双方产生的代谢产物都为对 方提供不能合成的营养物质,通过培养基渗透扩 散,得到补充,可以在基本培养基上生长繁殖形 成菌落这种现象称为喂养或互养
其中A品系为生物素、苯丙 氨酸甲硫氨酸和缺陷,B品系为苏 氨酸、亮氨酸和硫胺缺陷型。双 亲本都不能在基本培养基上生长, 但杂交后代基因重组后产生营养 互补的原养型重组体可在基本培 养基上生长
酵母菌优秀PPT课件-优秀PPT文档
佛山市高明 鸿鹰食品有
限公司
产品名称 瓜子仁
荣华花生
开心果
商 标
规格
吉 昌
散装
散装
旭 明
散装
生产 日期 200604-07
200603-24
200604-10
主要不合格 项目 酵母
酵母
霉菌
28
4. 酱油、醋
酵母和霉菌嗜好酸性反应，因而能使醋 发生霉变。含一定盐分的食品，对一般细菌 生长是不利的，但酵母对盐则有抵抗性，而 且能够生长，所以酱油也会受到侵犯。
二是微生物指标不合格。微生物指标不合格主要是 霉菌、酵母超标。抽查中有个别产品微生物指标不 合格。其中有1种产品的酵母实测值为480cfu/g，是 标准规定值的近20倍
三是产品标签标注不规范。
27
烘炒食品产品质量国家监督抽查部分 质量较差的产品及其企业名单
企业名称
广州番禺区 越秀食品厂
广州市番禺 钟村荣华 食品厂
14
酵母菌的危害：
➢少数耐高渗的酵母菌和鲁氏酵母、蜂蜜酵母可 使蜂蜜和果酱等败坏； ➢有的酵母菌是发酵工业的污染菌，影响发酵的 产量和质量； ➢某些酵母菌会引起人和植物的病害，例如白假 丝酵母可引起皮肤、粘膜、呼吸道、消化道等多 种疾病.
15
四、食品中常见的酵母属
（一）酵母属 酵母中最重要、应用最广泛的一类： 1.酒类的酿造、面包发酵 2.引起高糖食品（果酱等）变质 3.能抵抗高浓度食盐溶液
30
作业题
1. 酵母菌的特征 2. 什么是冷链？
31
3
（三）酵母菌菌落特征
啤酒酵母菌落
细菌菌落
4
（三）酵母菌菌落特征
啤酒酵母菌落
红酵母菌落
限公司
产品名称 瓜子仁
荣华花生
开心果
商 标
规格
吉 昌
散装
散装
旭 明
散装
生产 日期 200604-07
200603-24
200604-10
主要不合格 项目 酵母
酵母
霉菌
28
4. 酱油、醋
酵母和霉菌嗜好酸性反应，因而能使醋 发生霉变。含一定盐分的食品，对一般细菌 生长是不利的，但酵母对盐则有抵抗性，而 且能够生长，所以酱油也会受到侵犯。
二是微生物指标不合格。微生物指标不合格主要是 霉菌、酵母超标。抽查中有个别产品微生物指标不 合格。其中有1种产品的酵母实测值为480cfu/g，是 标准规定值的近20倍
三是产品标签标注不规范。
27
烘炒食品产品质量国家监督抽查部分 质量较差的产品及其企业名单
企业名称
广州番禺区 越秀食品厂
广州市番禺 钟村荣华 食品厂
14
酵母菌的危害：
➢少数耐高渗的酵母菌和鲁氏酵母、蜂蜜酵母可 使蜂蜜和果酱等败坏； ➢有的酵母菌是发酵工业的污染菌，影响发酵的 产量和质量； ➢某些酵母菌会引起人和植物的病害，例如白假 丝酵母可引起皮肤、粘膜、呼吸道、消化道等多 种疾病.
15
四、食品中常见的酵母属
（一）酵母属 酵母中最重要、应用最广泛的一类： 1.酒类的酿造、面包发酵 2.引起高糖食品（果酱等）变质 3.能抵抗高浓度食盐溶液
30
作业题
1. 酵母菌的特征 2. 什么是冷链？
31
3
（三）酵母菌菌落特征
啤酒酵母菌落
细菌菌落
4
（三）酵母菌菌落特征
啤酒酵母菌落
红酵母菌落
《酵母各种杂交》
精选课件
16
（3）阳性杂交克隆的质粒抽提及一对一验证: 对上述筛选的 阳性克隆进行质粒抽提，再次进行抗性筛选和质粒抽提后， 一对一与诱饵质粒 p GB-FAM172A共转酵母细胞 Y190 验 证。 （4）再次阳性者抽提质粒进行测序及生物信息学分析: 利用 NCBI 对测序所得到的序列进行 BLAST 比对分析。
精选课件
20
局限性
3、阴性干扰：两个蛋白本应发生相互作用，但报告基因不表达或表
达程度甚低以至于检测不出来。 蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株或多拷贝载体。 某些蛋白在酵母中不稳定表达或不能准确定位到胞核内。
精选课件
17
结果
对 10个阳性克隆相应的质粒进行测序后，通过 BLAST在 GenBank数据库中对应 6个不同的基因，编码6种已知的 蛋白质： RTCD1、 MOCS2、A2M、KCNIP1、BTBD2 和TOX2，根据GenBank数据库及相关文献获得了它们的 功能信息。其中 A2M与糖尿病血管病变密切相关，也进 一步提示 FAM172A参与了糖尿病大血管病变的发病。
筛选标志：LEU2
精选课件
10
2. 两种重组质粒共同转化酵母菌（HF7c） 3.筛选观察
（1）双载体转化能合 成亮氨酸和色氨酸。
TrpLeu-
（2）筛选蛋白A和蛋 白B能相互作用的双载 体转化子。
HisTrpLeu-
精选课件
11
多克隆载体
转化
酵母细胞
精选课件
14
（2）人胎脑cDNA质粒构建
精选课件
15
（3）酵母双杂交筛选人胎脑 cDNA ①人胎脑 cDNA转化诱饵酵母菌及初步筛选: 菌液，分别 涂布于培养基（A：Leu-/Trp-、B: Leu-/Trp- /His-），A平板 上的克隆进行计数，根据稀释度计算转库效率（转库效率只有 达到 1X107糖苷酶克隆转移滤纸实验进一步筛选: 从B: Leu-/Trp- /His-平板上挑取 35 个单克隆进行 β-半乳糖苷 酶克隆转移滤纸实验，变蓝色的为阳性克隆。
酵母杂交技术原理及应用PPT共38页
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 游 52、 生 命 不 等 于是呼 吸，生 命是活 动。——卢 梭
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
酵母杂交技术原理及应用
16、自己选择的路、跪着也要把它走 完。 17、一般情况下)不想三年以后的事， 只想现ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ在的事 。现在 有成就 ，以后 才能更 辉煌。
18、敢于向黑暗宣战的人，心里必须 充满光 明。 19、学习的关键--重复。
20、懦弱的人只会裹足不前，莽撞的 人只能 引为烧 身，只 有真正 勇敢的 人才能 所向披 靡。
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
酵母各种杂交PPT课件
CHENLI 2021/3/7
17
结果
对 10个阳性克隆相应的质粒进行测序后，通过 BLAST在 GenBank数据库中对应 6个不同的基因，编码6种已知的 蛋白质： RTCD1、 MOCS2、A2M、KCNIP1、BTBD2 和TOX2，根据GenBank数据库及相关文献获得了它们的 功能信息。其中 A2M与糖尿病血管病变密切相关，也进 一步提示 FAM172A参与了糖尿病大血管病变的发病。
HisTrpLeu-
CHENLI 2021/3/7
11
多克隆载体
转化
酵母细胞
转化
酵母细胞
筛选平板
筛选平板
生长菌苔
生长菌苔
同一个三重筛选平板
克隆（诱饵与靶蛋白相互作用）
β-半乳糖苷酶
鉴定
CHENLI 2021/3/7
12
酵母双杂交系统的应用：
（1）发现新蛋白和蛋白的新功能 （2）研究抗原和抗体的作用（细胞内） （3）检测已知蛋白质之间的相互作用 （4）确定未知蛋白之间的相互作用 （5）确定基因治疗中多肽类药物的作用机理
CHENLI 2021/3/7
18
酵母双杂交系统的优点
（1）用体内实验来研究蛋白质的相互作用，方法精确， 不受外界影响，易于操作;
（2）所有操作均在核酸水平进行，无需纯化大量的蛋白 质，可以精确测定蛋白质的弱相互作用；
（3）运用范围较大：酵母双杂交系统中的诱饵蛋白可以 是完整的蛋白质，也可以是蛋白质的一个功能区，可以大 到一个完整的肿瘤抑制蛋白，也可以小到一个约22个氨基 酸的多肽。
Reporter
UAS
gene
酵母双杂交原理示意图
CHENLI 2021/3/7
酵母菌杂交育种
养基中于28 ℃培养48 h, 离心洗涤, 弃上清液, 将 酵母泥接种于微量元素培养基平板上, 于25 ℃ 培养5 d, 在显微镜下可以观察到有子囊孢子的 形成, 收集平板培养基上的菌体。制备菌悬液 ( 106) , 用2 %的蜗牛酶于30 ℃水浴处理60 min, 然后于50 ℃水浴振荡处理10 min, 杀死二倍体营 养细胞, 将粘连的孢子打散后
19
• 结论 对杂交株的耐性筛选发现, 与亲本相比, 部分杂 交株的耐酒精性能和耐渗性能显著提高。杂交 育种可以通过基因的分离、移动和重排进行重 新分布, 有可能改善酿酒酵母的发酵特性。本试 验中,杂交株的产酒精能力和耐渗性均比亲株有 所提高, 通过此方法可以达到合并工业菌株特性 的目的。
20
YEPD高渗培养基(用于酵母原生质体融 合) :酵母粉10g, 蛋白胨20g，葡萄糖20g， 蒸馏水1000mL, pH6.0，115℃湿热灭菌20 min。
有性孢子或无性孢子及其细胞，互相联结、细 胞核融合，随后细胞核进行减数分裂或有丝分 裂，遗传性状出现分离和重新组合的现象，产 生具有各种新性状的重组体，然后经分离和筛 选，获得符合要求的生产菌株。由此可见，微 生物的杂交现象包括有性杂交及菌体细胞重组 两个方面。
4
尽管一些优良菌种的选育主要是采用诱变 育种的方法，但是某一菌株长期使用诱变剂处 理后，其生活能力一般要逐渐下降，如生长周 期延长、孢子量减少、代谢减慢、产量增加缓 慢等。而杂交育种是选用已知性状的供体和受 体菌种作为亲本，因此不论在方向性还是自觉 性方面，都比诱变育种前进了一大步，所以它 是微生物菌种选育的另一重要途径。但由于杂 交育种的方法复杂，工作进度慢，因此还很难 象诱变育种那样得到普遍的推广和应用。
培养基,发酵一段时间后补加10 %的葡萄糖。于 30 ℃静置培养, 每隔24 h 测CO2 失重。发酵结 束后测定发酵液的酒精度和残糖含量。根据产 酒精能力选出发酵性能优良的单倍体菌株。
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• 结论 对杂交株的耐性筛选发现, 与亲本相比, 部分杂 交株的耐酒精性能和耐渗性能显著提高。杂交 育种可以通过基因的分离、移动和重排进行重 新分布, 有可能改善酿酒酵母的发酵特性。本试 验中,杂交株的产酒精能力和耐渗性均比亲株有 所提高, 通过此方法可以达到合并工业菌株特性 的目的。
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YEPD高渗培养基(用于酵母原生质体融 合) :酵母粉10g, 蛋白胨20g，葡萄糖20g， 蒸馏水1000mL, pH6.0，115℃湿热灭菌20 min。
有性孢子或无性孢子及其细胞，互相联结、细 胞核融合，随后细胞核进行减数分裂或有丝分 裂，遗传性状出现分离和重新组合的现象，产 生具有各种新性状的重组体，然后经分离和筛 选，获得符合要求的生产菌株。由此可见，微 生物的杂交现象包括有性杂交及菌体细胞重组 两个方面。
4
尽管一些优良菌种的选育主要是采用诱变 育种的方法，但是某一菌株长期使用诱变剂处 理后，其生活能力一般要逐渐下降，如生长周 期延长、孢子量减少、代谢减慢、产量增加缓 慢等。而杂交育种是选用已知性状的供体和受 体菌种作为亲本，因此不论在方向性还是自觉 性方面，都比诱变育种前进了一大步，所以它 是微生物菌种选育的另一重要途径。但由于杂 交育种的方法复杂，工作进度慢，因此还很难 象诱变育种那样得到普遍的推广和应用。
培养基,发酵一段时间后补加10 %的葡萄糖。于 30 ℃静置培养, 每隔24 h 测CO2 失重。发酵结 束后测定发酵液的酒精度和残糖含量。根据产 酒精能力选出发酵性能优良的单倍体菌株。
j酵母双杂交 ppt课件
酵母双杂交
专业：微生物与生化药学 学号：21140811040 姓名：崔小清
j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
1
酵母双杂交系统 Yeast Two-hybrid System
酵母双杂交系统是在1989年由StanleyFields和k-kyu Song首次提出并初步建立的在酿酒酵母体内分析蛋白质与 蛋白质相互作用的系统。
16
具体事例
《应用酵母双杂交筛选与 FAM172A相互作用蛋白的研究》
FAM172A蛋白的生理功能之一是参与细胞生长的调控, 与糖尿病大血管为深入研究新发现的 蛋白质 FAM172A，生物学功能及在疾病中的作用奠定基础。 FAM172A基因的过表达改 变了细胞周期的分布，促使细胞从 G1期加速向 S期过渡，最终促进了HEK293 细 胞 的 增 殖，抑 制 了 细 胞 凋 亡，因 此， FAM172A基因可以通过抑制细胞凋亡，增加细胞增 殖而促进细胞的生长。
j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
17
j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
18
1、材/OB，酵 母表达载体p GB-VectorB，PDC315-FAM172A质粒。
2、主要试剂和试剂盒 营养缺陷培养基（Leu-/Trp-、 Leu-/Trp- /His-），X-gal，Sfi Ⅰ限制性内切 酶，T4DNA连接酶， 鲑鱼精 DNA， 高保真Pfu DNA 聚合酶，DNA胶回 收试剂盒，PCR产物回收试剂盒
自建立已有153年的历史，已经逐步发展成一个较完 善的分析蛋白质与蛋白质相互作用的系统，并基于原初
的基本原理衍生了一系列类似的系统：酵母单杂交系统、
反向双杂交系统、三杂交系统，还有人预测，将来还可
专业：微生物与生化药学 学号：21140811040 姓名：崔小清
j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
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酵母双杂交系统 Yeast Two-hybrid System
酵母双杂交系统是在1989年由StanleyFields和k-kyu Song首次提出并初步建立的在酿酒酵母体内分析蛋白质与 蛋白质相互作用的系统。
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具体事例
《应用酵母双杂交筛选与 FAM172A相互作用蛋白的研究》
FAM172A蛋白的生理功能之一是参与细胞生长的调控, 与糖尿病大血管为深入研究新发现的 蛋白质 FAM172A，生物学功能及在疾病中的作用奠定基础。 FAM172A基因的过表达改 变了细胞周期的分布，促使细胞从 G1期加速向 S期过渡，最终促进了HEK293 细 胞 的 增 殖，抑 制 了 细 胞 凋 亡，因 此， FAM172A基因可以通过抑制细胞凋亡，增加细胞增 殖而促进细胞的生长。
j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
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j酵母双杂交 ppt课件 2021/3/26
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1、材/OB，酵 母表达载体p GB-VectorB，PDC315-FAM172A质粒。
2、主要试剂和试剂盒 营养缺陷培养基（Leu-/Trp-、 Leu-/Trp- /His-），X-gal，Sfi Ⅰ限制性内切 酶，T4DNA连接酶， 鲑鱼精 DNA， 高保真Pfu DNA 聚合酶，DNA胶回 收试剂盒，PCR产物回收试剂盒
自建立已有153年的历史，已经逐步发展成一个较完 善的分析蛋白质与蛋白质相互作用的系统，并基于原初
的基本原理衍生了一系列类似的系统：酵母单杂交系统、
反向双杂交系统、三杂交系统，还有人预测，将来还可
酵母双杂交系统PPT课件
低约4个数量级。 • 最后，在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质常会带来毒性作用，从而影响菌株
生长及报告基因的表型。
第14页/共19页
酵母双杂交系统的应用
• 酵母双杂交系统作为一种高度敏感、适用于细胞核内外以至于细胞内外多种蛋白 质在体研究体系，双杂交系统主要应用于 ：
• 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能。例：Engelender等人 以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交 CLONTECH MATCHMARKER SYSn相互作用的新蛋白Synphilin-1
第16页/共19页
酵母双杂交系统方法的优化
• (1)酵母接合型的引入:Bendixen etal 通过酵母接合型的引用， 避免了两次转化操作同时又提高了双杂交的效率。
• (2)诱饵表达载体: 常用的有二种，酵母细胞的GAL4 和来自大肠 杆菌的LexA，二者的差别在于LexA 不具有核定位序列。
• (3)猎物表达载体: 酵母GAL4 的转录激活域；来自单纯疱疹病毒 的VP16，其转录活性较高；来自大肠杆菌的B42转录活性弱，但 可缓和有毒性的基因表达对细胞的影响。
主要从以下几方面介绍 酵母双杂交系统
• 概念 • 原理 • 优点与缺点 • 应用 • 优化
第1页/共19页
酵母双杂交系统的概念
• 酵母双杂交系统是一种建立在酵母菌基础上的遗传学分析方法，主要用于检测蛋白 间的相互作用及克隆与已知蛋白相关的未知新基因。在功能基因组学和蛋白质组学 的研究中起积极的促进作用。在细胞信号转导研究中，通过酵母双杂交系统能较全 面真实地反映细胞内信号蛋白的网络性联系与调节。该法由Fields等人于1989年首 次建立并得到广泛地应用。
生长及报告基因的表型。
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酵母双杂交系统的应用
• 酵母双杂交系统作为一种高度敏感、适用于细胞核内外以至于细胞内外多种蛋白 质在体研究体系，双杂交系统主要应用于 ：
• 1、利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能。例：Engelender等人 以神经末端蛋白alpha-synuclein 蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交 CLONTECH MATCHMARKER SYSn相互作用的新蛋白Synphilin-1
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酵母双杂交系统方法的优化
• (1)酵母接合型的引入:Bendixen etal 通过酵母接合型的引用， 避免了两次转化操作同时又提高了双杂交的效率。
• (2)诱饵表达载体: 常用的有二种，酵母细胞的GAL4 和来自大肠 杆菌的LexA，二者的差别在于LexA 不具有核定位序列。
• (3)猎物表达载体: 酵母GAL4 的转录激活域；来自单纯疱疹病毒 的VP16，其转录活性较高；来自大肠杆菌的B42转录活性弱，但 可缓和有毒性的基因表达对细胞的影响。
主要从以下几方面介绍 酵母双杂交系统
• 概念 • 原理 • 优点与缺点 • 应用 • 优化
第1页/共19页
酵母双杂交系统的概念
• 酵母双杂交系统是一种建立在酵母菌基础上的遗传学分析方法，主要用于检测蛋白 间的相互作用及克隆与已知蛋白相关的未知新基因。在功能基因组学和蛋白质组学 的研究中起积极的促进作用。在细胞信号转导研究中，通过酵母双杂交系统能较全 面真实地反映细胞内信号蛋白的网络性联系与调节。该法由Fields等人于1989年首 次建立并得到广泛地应用。
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产孢率(%)=子囊孢子数量/总细胞数 注：YPD 为酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基
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子囊孢子分离和单倍体的获得 菌株活化后接入产孢培养基，3天后镜检观
察，无菌水(2ml)倾于斜面上，用接种环刮下菌体 ，收集菌悬液于7ml离心管中，6000rpm离心 10mi n收集菌体。0.85%生理盐水悬浮洗涤1~2次，分别 加入 0.7mlTris一Hcl(pH8.0，0.01M);200ul 10% 蜗牛酶(终浓度为0.02):l00ul 10%琉基乙醇(终浓 度为0.01)，120rpm(缓慢振荡)培养16h破子囊壁 ，使孢子释放。利用孢子比营养细胞耐热特性， 采用58℃高温致死处理营养细胞，离心收集孢子 ，并用Tris一HCI(pH8.0，0.01M)洗涤两次。取适 当稀释倍数，涂布于YPD平板上，28℃培养2一3d 。
众多的野生型菌株，从而
达到浓缩养缺陷型的目
的。
11
• ２．１抗生素法：是利用野生型菌株能在M M中生长，而缺陷型不能生长，于是将诱变 处理液在MM中培养短时让野生型生长，处 于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于 “休眠状态”，这时，加入一定量的抗生 素，结果活化状态的野生型就被杀死，保 存了缺陷型。在选择抗生素时，细菌可以 用青霉素，酵母可用制霉菌素。
酵母菌杂交育种优秀课件
1
目录
• 一酵母菌杂交特点
• 1酵母菌的细胞结构和菌落形态 • 2酵母菌的生活史和繁殖方式 • 3酵母菌的杂交
• 二酵母菌杂交育种的方法
• 标记菌株的选择 • 酵母菌杂交
• 拓展：酵母群体杂交育种方法
2
一酵母菌杂交特点
3
1酵母菌细胞结构和菌落形态
酵母菌（yeast）是低等真核 微生物，分属于子囊菌纲、半知菌 纲和担子菌纲。大多数酵母菌为单 细胞，一般呈卵圆形、圆形或圆柱 形。细胞结构类似于高等生物，细 胞壁的主要成分为葡聚糖和甘露糖， 此外还有蛋白质和脂类等。酵母细 胞除细胞壁之外还有细胞核、核膜、 核仁等结构。大多数酵母的菌落和 细菌相似，
• 夹层培养法 • 限量补充培养法 • 影印接种法 • 逐个检出法
、限量补
14
酵母菌的杂交
子囊孢子的制备：（以高产率酿酒酵母为例）
诱导孢子形成的方法 将酿酒酵母菌株于YPD固体斜面上28℃培养4
8h活化，活化两次后接入产孢培养基，25℃培养3 一7天，在显微镜下观察子囊孢子形成情况，计算 一个视野内酵母总数和子囊孢子数，并计算产孢 率。
8
• 二酵母菌杂交育种的法
9
1 标记菌株的选择
• 常用的标记是营养缺陷型或抗性突变基因
1．营养缺陷型标记 2．抗性标记 3．温度敏感性标记 4．其他性状标记
如孢子颜色、菌落形态结构、可溶性色素舍量、代 谢产物产量高低和代谢返速度快慢等，以及利用的碳 、氮原种类、杀伤力等其他性状都可以作为重组体检 出的辅助性标记。
7
3酵母菌的杂交
• 酵母菌的杂交最主要通过有性杂交，利 用两种不同结合型的单倍体菌株或子囊 孢子进行的。有的酵母如假丝酵母等不 具有性生殖，即不产生子囊孢子，它们 的杂交与霉菌一样，是通过准性生殖进 行的。酵母菌杂交一般是指异接合型菌 株杂交。杂交过程包括子囊孢子接触， 结合，合子形成，直至二倍体细胞出牙 为止的一系列过程。杂交步骤包括遗传 标记菌株的选择和不同遗传标记的异接 合型细胞杂交。
化后，分别接种到装有10mlYPD液体培养基 的250ml三角瓶中培养，30°C，200rpm/min ，24h。取lml待测的单倍体菌株菌液和lml 标准菌株菌液接种到新鲜的10mlYPD液体培 养基中，30℃，200rpm/min镜检观察哑铃形 细胞产生，混合菌液培养过夜后离心(300rp m/min，5min)，菌体沉淀后接种到产孢培养 基中培养3一7天，镜检观察有无子囊产生， 确定交配型，能与a型标准菌株杂交并且产 孢的菌株交配型为α；能与α型标准菌株杂 交并且产孢的菌株交配型为a。
5
2酵母菌生活史和繁殖方式
酵母菌是真核生物中最简单的单细胞 微生物 ，具有真核生物所有的共性，染 色体结构、功能和高等生物细胞相类似。 存在单倍体和二倍体的生活史，二倍体 生活力强，生产能力高，可通过杂交得 二倍体来育种。
6
• 酵母菌的生殖方式
• 酵母菌可以进行无性生殖，也可以进 行有性生殖。无性繁殖包括芽殖、裂殖 (即少数种类的酵母菌与细菌一样，借细 胞横分裂而繁殖)、芽裂(这种方式很少) 三种。其中最主要还是出芽生殖(简称芽 殖)，即成熟的酵母菌细胞先长出一个小 芽体，芽体细胞长到一定程度脱离母细 胞继续生长，而后形成一个新个体。有 性生殖是以形成子囊孢子的方式进行。
16
单倍体的鉴定： 培养后挑取小菌落，镜检观察是否为单
倍体。将获得的疑是单倍体再接入产孢培养基， 培养7天左右观察子囊形成，以确定是否为真正的 单倍体。有子囊形成者基本确认为二倍体，不形 成子囊者基本确认为单倍体。把确定为单倍体的 菌株分别保种(YPD斜面、甘油管)。
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有性杂交
单倍体交配型的确定 单倍体菌株与标准菌株在YPD斜面活
10
营养缺陷型菌株的筛选过程
营养缺陷型菌株的筛选一般要经过诱变、淘汰野
生型菌株、检出缺陷型和确定生长谱四个环节。
１诱变剂处理
２ 淘汰野生菌的方法
诱变剂处理时与其它诱变
处理基本相同。在诱变处
理后的存活个体中，营养 1.抗生素法
缺陷型的比例一般很低，
通常只有百分之几至千分
之几，采用抗菌素法或菌
丝过滤法，可以淘汰为数 2.菌丝过滤法
12
2．２菌丝过滤法：只适用于丝状真菌， 其原理是在基本培养基中，野生型的孢子 能发芽成菌丝，而营养缺陷型则不能。因 此将诱变处理后的孢子在基本培养基中培 养一段时间后，再进行过滤。 如此重复数次后，就可以除去大部分野生 型菌株，同样达到“浓缩”营养缺陷型的目 的。
13
３营养缺陷型的检出方法
• 具体方法：影印法、点种法、夹层法 充培养法
4
酵母菌的细胞结构与细菌相似，但比细菌细胞 大得多。一个椭圆形的酵母菌细胞长约7.2um ，宽5.6nm(圆形直径1—5um) . 菌落大而厚，菌落表面湿润、粘稠并多呈乳白 色，少数为红色。 菌落特征 表面湿润、粘稠 ，大多数是乳白色，少数红色（红酵母），在 固体培养基上生长时间长了，颜色变暗，呈绉 缩状。
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子囊孢子分离和单倍体的获得 菌株活化后接入产孢培养基，3天后镜检观
察，无菌水(2ml)倾于斜面上，用接种环刮下菌体 ，收集菌悬液于7ml离心管中，6000rpm离心 10mi n收集菌体。0.85%生理盐水悬浮洗涤1~2次，分别 加入 0.7mlTris一Hcl(pH8.0，0.01M);200ul 10% 蜗牛酶(终浓度为0.02):l00ul 10%琉基乙醇(终浓 度为0.01)，120rpm(缓慢振荡)培养16h破子囊壁 ，使孢子释放。利用孢子比营养细胞耐热特性， 采用58℃高温致死处理营养细胞，离心收集孢子 ，并用Tris一HCI(pH8.0，0.01M)洗涤两次。取适 当稀释倍数，涂布于YPD平板上，28℃培养2一3d 。
众多的野生型菌株，从而
达到浓缩养缺陷型的目
的。
11
• ２．１抗生素法：是利用野生型菌株能在M M中生长，而缺陷型不能生长，于是将诱变 处理液在MM中培养短时让野生型生长，处 于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于 “休眠状态”，这时，加入一定量的抗生 素，结果活化状态的野生型就被杀死，保 存了缺陷型。在选择抗生素时，细菌可以 用青霉素，酵母可用制霉菌素。
酵母菌杂交育种优秀课件
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目录
• 一酵母菌杂交特点
• 1酵母菌的细胞结构和菌落形态 • 2酵母菌的生活史和繁殖方式 • 3酵母菌的杂交
• 二酵母菌杂交育种的方法
• 标记菌株的选择 • 酵母菌杂交
• 拓展：酵母群体杂交育种方法
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一酵母菌杂交特点
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1酵母菌细胞结构和菌落形态
酵母菌（yeast）是低等真核 微生物，分属于子囊菌纲、半知菌 纲和担子菌纲。大多数酵母菌为单 细胞，一般呈卵圆形、圆形或圆柱 形。细胞结构类似于高等生物，细 胞壁的主要成分为葡聚糖和甘露糖， 此外还有蛋白质和脂类等。酵母细 胞除细胞壁之外还有细胞核、核膜、 核仁等结构。大多数酵母的菌落和 细菌相似，
• 夹层培养法 • 限量补充培养法 • 影印接种法 • 逐个检出法
、限量补
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酵母菌的杂交
子囊孢子的制备：（以高产率酿酒酵母为例）
诱导孢子形成的方法 将酿酒酵母菌株于YPD固体斜面上28℃培养4
8h活化，活化两次后接入产孢培养基，25℃培养3 一7天，在显微镜下观察子囊孢子形成情况，计算 一个视野内酵母总数和子囊孢子数，并计算产孢 率。
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• 二酵母菌杂交育种的法
9
1 标记菌株的选择
• 常用的标记是营养缺陷型或抗性突变基因
1．营养缺陷型标记 2．抗性标记 3．温度敏感性标记 4．其他性状标记
如孢子颜色、菌落形态结构、可溶性色素舍量、代 谢产物产量高低和代谢返速度快慢等，以及利用的碳 、氮原种类、杀伤力等其他性状都可以作为重组体检 出的辅助性标记。
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3酵母菌的杂交
• 酵母菌的杂交最主要通过有性杂交，利 用两种不同结合型的单倍体菌株或子囊 孢子进行的。有的酵母如假丝酵母等不 具有性生殖，即不产生子囊孢子，它们 的杂交与霉菌一样，是通过准性生殖进 行的。酵母菌杂交一般是指异接合型菌 株杂交。杂交过程包括子囊孢子接触， 结合，合子形成，直至二倍体细胞出牙 为止的一系列过程。杂交步骤包括遗传 标记菌株的选择和不同遗传标记的异接 合型细胞杂交。
化后，分别接种到装有10mlYPD液体培养基 的250ml三角瓶中培养，30°C，200rpm/min ，24h。取lml待测的单倍体菌株菌液和lml 标准菌株菌液接种到新鲜的10mlYPD液体培 养基中，30℃，200rpm/min镜检观察哑铃形 细胞产生，混合菌液培养过夜后离心(300rp m/min，5min)，菌体沉淀后接种到产孢培养 基中培养3一7天，镜检观察有无子囊产生， 确定交配型，能与a型标准菌株杂交并且产 孢的菌株交配型为α；能与α型标准菌株杂 交并且产孢的菌株交配型为a。
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2酵母菌生活史和繁殖方式
酵母菌是真核生物中最简单的单细胞 微生物 ，具有真核生物所有的共性，染 色体结构、功能和高等生物细胞相类似。 存在单倍体和二倍体的生活史，二倍体 生活力强，生产能力高，可通过杂交得 二倍体来育种。
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• 酵母菌的生殖方式
• 酵母菌可以进行无性生殖，也可以进 行有性生殖。无性繁殖包括芽殖、裂殖 (即少数种类的酵母菌与细菌一样，借细 胞横分裂而繁殖)、芽裂(这种方式很少) 三种。其中最主要还是出芽生殖(简称芽 殖)，即成熟的酵母菌细胞先长出一个小 芽体，芽体细胞长到一定程度脱离母细 胞继续生长，而后形成一个新个体。有 性生殖是以形成子囊孢子的方式进行。
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单倍体的鉴定： 培养后挑取小菌落，镜检观察是否为单
倍体。将获得的疑是单倍体再接入产孢培养基， 培养7天左右观察子囊形成，以确定是否为真正的 单倍体。有子囊形成者基本确认为二倍体，不形 成子囊者基本确认为单倍体。把确定为单倍体的 菌株分别保种(YPD斜面、甘油管)。
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有性杂交
单倍体交配型的确定 单倍体菌株与标准菌株在YPD斜面活
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营养缺陷型菌株的筛选过程
营养缺陷型菌株的筛选一般要经过诱变、淘汰野
生型菌株、检出缺陷型和确定生长谱四个环节。
１诱变剂处理
２ 淘汰野生菌的方法
诱变剂处理时与其它诱变
处理基本相同。在诱变处
理后的存活个体中，营养 1.抗生素法
缺陷型的比例一般很低，
通常只有百分之几至千分
之几，采用抗菌素法或菌
丝过滤法，可以淘汰为数 2.菌丝过滤法
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2．２菌丝过滤法：只适用于丝状真菌， 其原理是在基本培养基中，野生型的孢子 能发芽成菌丝，而营养缺陷型则不能。因 此将诱变处理后的孢子在基本培养基中培 养一段时间后，再进行过滤。 如此重复数次后，就可以除去大部分野生 型菌株，同样达到“浓缩”营养缺陷型的目 的。
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３营养缺陷型的检出方法
• 具体方法：影印法、点种法、夹层法 充培养法
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酵母菌的细胞结构与细菌相似，但比细菌细胞 大得多。一个椭圆形的酵母菌细胞长约7.2um ，宽5.6nm(圆形直径1—5um) . 菌落大而厚，菌落表面湿润、粘稠并多呈乳白 色，少数为红色。 菌落特征 表面湿润、粘稠 ，大多数是乳白色，少数红色（红酵母），在 固体培养基上生长时间长了，颜色变暗，呈绉 缩状。