反相层析
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第八章 反相层析
Reversed Phase Chromatography RPC
原理 介质 技术 应用
概述
反相层析法的建立追述到1950年，Howard和 Martin用正辛烷作为固定相，水作为流动相 进行石蜡油的液-液层析分离，并且把这种方 法命名为反相层析； 所谓“正相”或“反相”，主要是指固定相和流 动相的相对极性大小，反相层析因与传统分 配层析刚好相反而得名，其固定相非极性强 而流动相极性相对较高，样品中组分被洗脱 的顺序是极性较高的组分先流出，极性较低 的后被洗脱。
理想情况下应将样品溶于流动相A后加样，如 样品在流动相A中溶解不好，可考虑添加有机 酸、盐类等试剂来增加样品的溶解性； 样品在加样前应当通过10000g离心10min或用 0.22μm微孔滤膜过滤除去任何可能存在的颗 粒物； 反相层析柱通常是预装柱或带有可调接头的 自装柱，连接于HPLC系统，加样操作按HPLC 系统提供的标准进行。
几种常见的反相介质
（一）SOURCETM RPC （聚苯乙烯颗粒） 能耐受反相层析中常用的有机溶剂，对6mol/L的盐酸 胍、0.1%的SDS等具良好耐受能力 各种肽、蛋白质、寡聚核苷酸等分析和制备型分离纯化 （二）μRPC C2/C18 （多孔硅胶微粒为基质 ） 在有机溶剂中稳定性较好，但pH稳定范围较窄，仅能 在pH2～8范围内使用，对变性剂、去污剂等试剂具良好 的耐受，操作温度范围4～40℃ 粒径小，适合肽谱分析和极微量纯化过程 （三）Sephasil Protein / Sephasil Peptide （多孔硅胶为基质） 理化稳定性和μRPC C2/C18介质相似，温度范围4～70℃
样品的检测和收集
和其他层析技术一样，反相层析中最常用 的也是紫外检测（很多情况下，有机溶剂或 添加剂等的存在总会对样品的检测产生一定 的影响 ） 对于能产生荧光的物质，使用荧光监测 器往往比紫外检测有更高的选择性和灵敏度。 此外，视差折光检测器、电导检测器等 也都能用于层析样品的在线检测。
层析柱的再生、清洗和贮存
反相层析多数在低pH条件下运行，流动相的 pH通过添加一定浓度的酸来调节； 往流动相中添加离子对试剂可以改变溶质的 保留值和选择性，获得较好的分离效果； 对于带正电荷的溶质应选择带负电荷的离子 对试剂，如三氟乙酸等，对于带负电荷的溶 质则应选用带正电荷的离子对试剂，如季铵 盐等。
㈣ 样品的准备和加样操作
㈢ 流动相的选择和准备
乙腈和甲醇是最常用的，条件摸索阶段以其中 一种作为修饰剂，溶质在固定相上吸附较为牢 固时，可考虑更换洗脱能力较强的修饰剂如异 丙醇等； 溶质分子，特别是蛋白质等生物大分子在所用 溶剂中的稳定性是须考虑的因素； 分离样品性质不明的情况下，一般流动相A为水 相，不含修饰剂，而流动相B为100%有机相；
反相层析对所用有机溶剂的要求是能够与水 互溶，有较低的紫外截止波长和较低的黏 度 ，常用有机溶剂的性质见表9.3 反相层析的流动相大多采用二元系统，即由 水和一种有机溶剂组成，但据分离实际需 要，也可采用两种甚至两种以上的溶剂构成 三元、四元的流动相系统，以期获得合适的 洗脱强度和最佳的选择性。
层析过程中pH的控制至关重要
一、原理
基于溶质分子与固定相中键合在基质上的疏 水性配基间的疏水相互作用
反相层析机理普遍被人们接受的是由Horvath 于1976年提出的疏溶剂理论（solvophobic theory）: 疏溶剂理论假设反相层析介质是表面均匀 密集的覆盖着非极性配基的颗粒，溶质分子由 于受到极性流动相的斥力而以其疏水部分结合 至固定相的非极性配基上，除此之外溶质与固 定相之间不存在其他任何相互作用。
离子对试剂中很多本身就是酸或碱 （p271)，可同时起维持流动相pH的作用。 离子对试剂典型的使用浓度范围是 0.01%~0.1%或10~100mmol/L 离子对试剂要求在高浓度的有机溶剂中 有足够的溶解度，用UV检测，离子对试剂对 波长在220nm以上的紫外线不能有明显的吸 收，如使用带有芳香环的离子对试剂，则须 用荧光、视差折光等检测方法
流动相组成
影响层析过程的容量因子和选择性，从而对 分辨率产生影响 一般由水、有机溶剂、酸、离子对试剂（ion pairing agent）等组成： 有机溶剂又称为修饰剂（modifier），其 作用是降低流动相极性；酸的加入是调节pH 至酸性范围内，有助于抑制离子化作用，包 括抑制溶质的酸性基团和硅胶介质的硅醇基 发生解离；离子对试剂是通过离子作用与溶 质分子结合，引起溶质疏水性质的改变从而 调节溶质的保留行为。
二、层析介质
由多孔基质颗粒键合疏水性的配基组成，因具 较小的颗粒直径，普遍有较高的柱效； 反相层析领域使用时间最长，应用最广泛的基质 是硅胶
缺点：高pH下非常不稳定 新开发以合成有机物作为基质的反相介质-如聚 苯乙烯-二乙烯苯类 ，具优良的化学稳定性，强 酸强碱下的稳定性弥补了硅胶基质的缺陷 。
反相介质的选择性主要由键合在基质上 的配基类型决定。最常用的配基是线性的正 烷烃基团（n-烷基），如n-辛基（C-8）、n十八烷基（C-18），此外也会采用n-丙基、 n-丁基、n-丙基苯基、二苯基等疏水基团。
三、技术
反相介质的选择和层析柱的准备 流动相的选择和准备 样品的准备和加样操作 洗脱模式的选择和条件控制 样品的检测和收集 层析柱的再生、清洗和贮存
㈠ 介质的选择
考虑样品组分的种类和性质、分离的规模及对分 辨率的要求、流动相条件： 待分离物分子量，对介质孔径的选择提供指导； 样品组分的疏水性质决定采用何种配基； 分离的规模及对分辨率的要求也是须考虑的因素， 通常分离规模和分辨率的关系是负相关的 ； 反相层析时的流动相条件很大程度上影响反相介质 基质的选择。
因为流动相pH的改变影响到溶质的解 离状态、固定相表面残留硅醇基和其他 吸附基团的解离情况、以及添加至流动 相的可解离组分的离子平衡
（a）pH2和（b）pH12 分离血管紧张肽Ⅱ和血管紧张肽Ⅲ
（样品：血管紧张肽Ⅱ，0.25mg/mL，血管紧张肽Ⅲ，0.25mg/mL；层析柱：RESOURCE RPC 3mL，6.4×100mm；流动相A：（a）0.1%TFA，pH2，（b）10mmol/L NaOH，pH12； 流动相B：（a）0.1%TFA，60%乙腈－水溶液，（b）10mmol/L NaOH，60%乙腈－水溶液； 梯度：10min内10－65%B；流速：2mL/min。）
反相层析可分离的溶质范围很宽，从极 性较大的寡肽、小分子有机物到疏水性较强 的生物大分子。 反相层析的广泛应用也得益于流动相的 特殊溶剂效应和大范围的溶剂强度变化，从 极性很大的纯水流动相到非极性溶剂，其溶 剂洗脱强度的变化使溶质保留值的差别可以 达到1-2个数量级。 反相层析能够区分分子在疏水性质方面 的细微差异，而有效地进行分离，具备高分 辨特性。
㈤洗脱模式的选择和条件控制
在洗脱模式方面，反相层析和离子交换等层 析技术具相似性，分为阶段洗脱和梯度洗 脱； 梯度洗脱是采用修饰剂体积分数连续变化的 流动相对吸附样品进行洗脱。梯度的形状主 要分为线性梯度和非线性梯度，其中线性梯 度又可分为连续线性梯度和分段线性梯度。
连续线性梯度和分段线性梯度的比较
在流速恒定的情况下梯度斜率改变对分辨率的影响
（样品为一段合成肽，层析柱为Sephasil Peptide C18 5μm ST 4.6/100， 流动相A为0.06%TFA水溶液，流动相B为0.055%TFA-84%乙腈， 流速为1ml/min，梯度：（A）0～60%，（B）20～35%。）
流动相中有机溶剂种类、酸的使用和pH值、 离子对试剂种类等都会对选择性和分辨率产 生影响 ； 分离一些低分子量物质时，升高柱温（降低 流动相的黏度，增加传质速度，减少区带变 宽现象 ）也是一种较为常用的改善分辨率的 方法 ； 降低流速一定程度上可提高柱效，但同时也 会增加溶质的纵向扩散，过低的流速反而会 造成分辨率下降，同时使分离时间延长 。
硅胶类介质往往存在 “亲硅醇基效应”（silanophilic interaction） 一定条件下，硅胶表面残余的硅醇基能与溶质 发生相互作用而对溶质的保留行为起决定作用 ; 亲硅醇基效应常导致溶质保留值重复性较差， 洗脱峰脱尾等不良层析行为 ; 硅胶表面均匀覆盖非极性配基，对残余硅醇基 屏蔽，可基本排除亲硅醇基效应的影响。新型 反相层析介质聚苯乙烯等高分子聚合材料的开 发，可根本消除亲硅醇基效应的影响。
㈡ 反相层析柱的尺寸和预装柱的选择
层析柱的尺寸由内径和柱长所界定，其取值主 要取决于分离的规模和所需的分辨率，其中内 径的取值与分离规模相关，而柱长和分辨率之 间则存在一定的联系； 反相层析介质都属于高效层析介质，粒径很 小，对填充技术的要求很高 ，人们可据所选择 的介质种类和层析柱尺寸直接选择对映的反相 层析预装柱，预装柱平衡后可直接使用； 层析柱的平衡 ，一般用流动相A对层析柱进行 充分的平衡。
再生常用2～5个柱体积的流动相B流经层析 柱移去残留在层析柱上的物质； 清洗常运行线性梯度从0.1%TFA到0.1%TFA异 丙醇，再几个柱体积的0.1%TFA异丙醇溶液， 最后运行线性梯度从0.1%TFA异丙醇溶液重新 回到0.1%TFA水溶液； 基于硅胶的介质常保存在纯的甲醇中，基于 聚苯乙烯的介质常保存在甲醇或20%乙醇中
㈡ 核糖体蛋白质的分离纯化
Ultrapore RPSC反相层析柱上从E.Hale Waihona Puke Baiduoli纯化核糖体50S大亚基蛋白质
㈢ 微量蛋白质的鉴定
（A）胶质细胞蛋白质SDS-PAGE一条区带胶内降解后提取的肽段的 反相层析曲线; （B）A图框内区域的放大
㈣ 制备型分离纯化
在不同规模上制备型纯化rhEGF （A）层析柱尺寸6.4×100mm，加样量2.14mL， （B）层析柱尺寸35×100mm，加样量62.5mL
四、应用
脱盐 分析型分离 制备型分离
㈠ 脱盐
特点： 属吸附技术，容许待脱盐样品的体积很 大，洗脱后的样品在很小的体积范围内被洗 脱，完成脱盐的同时实现样品的浓缩 反相层析脱盐后，蒸发除去流动相，所 得样品重新溶解在所需缓冲体系中后可以进 行下一步操作。
（A）凝胶过滤层析，（B）反相层析
用反相层析脱盐时，盐类等小分子不发生吸附， 从V0开始被洗脱，至Vc处基本洗脱完毕，而生物大 分子在换用有机溶剂后被洗脱
Reversed Phase Chromatography RPC
原理 介质 技术 应用
概述
反相层析法的建立追述到1950年，Howard和 Martin用正辛烷作为固定相，水作为流动相 进行石蜡油的液-液层析分离，并且把这种方 法命名为反相层析； 所谓“正相”或“反相”，主要是指固定相和流 动相的相对极性大小，反相层析因与传统分 配层析刚好相反而得名，其固定相非极性强 而流动相极性相对较高，样品中组分被洗脱 的顺序是极性较高的组分先流出，极性较低 的后被洗脱。
理想情况下应将样品溶于流动相A后加样，如 样品在流动相A中溶解不好，可考虑添加有机 酸、盐类等试剂来增加样品的溶解性； 样品在加样前应当通过10000g离心10min或用 0.22μm微孔滤膜过滤除去任何可能存在的颗 粒物； 反相层析柱通常是预装柱或带有可调接头的 自装柱，连接于HPLC系统，加样操作按HPLC 系统提供的标准进行。
几种常见的反相介质
（一）SOURCETM RPC （聚苯乙烯颗粒） 能耐受反相层析中常用的有机溶剂，对6mol/L的盐酸 胍、0.1%的SDS等具良好耐受能力 各种肽、蛋白质、寡聚核苷酸等分析和制备型分离纯化 （二）μRPC C2/C18 （多孔硅胶微粒为基质 ） 在有机溶剂中稳定性较好，但pH稳定范围较窄，仅能 在pH2～8范围内使用，对变性剂、去污剂等试剂具良好 的耐受，操作温度范围4～40℃ 粒径小，适合肽谱分析和极微量纯化过程 （三）Sephasil Protein / Sephasil Peptide （多孔硅胶为基质） 理化稳定性和μRPC C2/C18介质相似，温度范围4～70℃
样品的检测和收集
和其他层析技术一样，反相层析中最常用 的也是紫外检测（很多情况下，有机溶剂或 添加剂等的存在总会对样品的检测产生一定 的影响 ） 对于能产生荧光的物质，使用荧光监测 器往往比紫外检测有更高的选择性和灵敏度。 此外，视差折光检测器、电导检测器等 也都能用于层析样品的在线检测。
层析柱的再生、清洗和贮存
反相层析多数在低pH条件下运行，流动相的 pH通过添加一定浓度的酸来调节； 往流动相中添加离子对试剂可以改变溶质的 保留值和选择性，获得较好的分离效果； 对于带正电荷的溶质应选择带负电荷的离子 对试剂，如三氟乙酸等，对于带负电荷的溶 质则应选用带正电荷的离子对试剂，如季铵 盐等。
㈣ 样品的准备和加样操作
㈢ 流动相的选择和准备
乙腈和甲醇是最常用的，条件摸索阶段以其中 一种作为修饰剂，溶质在固定相上吸附较为牢 固时，可考虑更换洗脱能力较强的修饰剂如异 丙醇等； 溶质分子，特别是蛋白质等生物大分子在所用 溶剂中的稳定性是须考虑的因素； 分离样品性质不明的情况下，一般流动相A为水 相，不含修饰剂，而流动相B为100%有机相；
反相层析对所用有机溶剂的要求是能够与水 互溶，有较低的紫外截止波长和较低的黏 度 ，常用有机溶剂的性质见表9.3 反相层析的流动相大多采用二元系统，即由 水和一种有机溶剂组成，但据分离实际需 要，也可采用两种甚至两种以上的溶剂构成 三元、四元的流动相系统，以期获得合适的 洗脱强度和最佳的选择性。
层析过程中pH的控制至关重要
一、原理
基于溶质分子与固定相中键合在基质上的疏 水性配基间的疏水相互作用
反相层析机理普遍被人们接受的是由Horvath 于1976年提出的疏溶剂理论（solvophobic theory）: 疏溶剂理论假设反相层析介质是表面均匀 密集的覆盖着非极性配基的颗粒，溶质分子由 于受到极性流动相的斥力而以其疏水部分结合 至固定相的非极性配基上，除此之外溶质与固 定相之间不存在其他任何相互作用。
离子对试剂中很多本身就是酸或碱 （p271)，可同时起维持流动相pH的作用。 离子对试剂典型的使用浓度范围是 0.01%~0.1%或10~100mmol/L 离子对试剂要求在高浓度的有机溶剂中 有足够的溶解度，用UV检测，离子对试剂对 波长在220nm以上的紫外线不能有明显的吸 收，如使用带有芳香环的离子对试剂，则须 用荧光、视差折光等检测方法
流动相组成
影响层析过程的容量因子和选择性，从而对 分辨率产生影响 一般由水、有机溶剂、酸、离子对试剂（ion pairing agent）等组成： 有机溶剂又称为修饰剂（modifier），其 作用是降低流动相极性；酸的加入是调节pH 至酸性范围内，有助于抑制离子化作用，包 括抑制溶质的酸性基团和硅胶介质的硅醇基 发生解离；离子对试剂是通过离子作用与溶 质分子结合，引起溶质疏水性质的改变从而 调节溶质的保留行为。
二、层析介质
由多孔基质颗粒键合疏水性的配基组成，因具 较小的颗粒直径，普遍有较高的柱效； 反相层析领域使用时间最长，应用最广泛的基质 是硅胶
缺点：高pH下非常不稳定 新开发以合成有机物作为基质的反相介质-如聚 苯乙烯-二乙烯苯类 ，具优良的化学稳定性，强 酸强碱下的稳定性弥补了硅胶基质的缺陷 。
反相介质的选择性主要由键合在基质上 的配基类型决定。最常用的配基是线性的正 烷烃基团（n-烷基），如n-辛基（C-8）、n十八烷基（C-18），此外也会采用n-丙基、 n-丁基、n-丙基苯基、二苯基等疏水基团。
三、技术
反相介质的选择和层析柱的准备 流动相的选择和准备 样品的准备和加样操作 洗脱模式的选择和条件控制 样品的检测和收集 层析柱的再生、清洗和贮存
㈠ 介质的选择
考虑样品组分的种类和性质、分离的规模及对分 辨率的要求、流动相条件： 待分离物分子量，对介质孔径的选择提供指导； 样品组分的疏水性质决定采用何种配基； 分离的规模及对分辨率的要求也是须考虑的因素， 通常分离规模和分辨率的关系是负相关的 ； 反相层析时的流动相条件很大程度上影响反相介质 基质的选择。
因为流动相pH的改变影响到溶质的解 离状态、固定相表面残留硅醇基和其他 吸附基团的解离情况、以及添加至流动 相的可解离组分的离子平衡
（a）pH2和（b）pH12 分离血管紧张肽Ⅱ和血管紧张肽Ⅲ
（样品：血管紧张肽Ⅱ，0.25mg/mL，血管紧张肽Ⅲ，0.25mg/mL；层析柱：RESOURCE RPC 3mL，6.4×100mm；流动相A：（a）0.1%TFA，pH2，（b）10mmol/L NaOH，pH12； 流动相B：（a）0.1%TFA，60%乙腈－水溶液，（b）10mmol/L NaOH，60%乙腈－水溶液； 梯度：10min内10－65%B；流速：2mL/min。）
反相层析可分离的溶质范围很宽，从极 性较大的寡肽、小分子有机物到疏水性较强 的生物大分子。 反相层析的广泛应用也得益于流动相的 特殊溶剂效应和大范围的溶剂强度变化，从 极性很大的纯水流动相到非极性溶剂，其溶 剂洗脱强度的变化使溶质保留值的差别可以 达到1-2个数量级。 反相层析能够区分分子在疏水性质方面 的细微差异，而有效地进行分离，具备高分 辨特性。
㈤洗脱模式的选择和条件控制
在洗脱模式方面，反相层析和离子交换等层 析技术具相似性，分为阶段洗脱和梯度洗 脱； 梯度洗脱是采用修饰剂体积分数连续变化的 流动相对吸附样品进行洗脱。梯度的形状主 要分为线性梯度和非线性梯度，其中线性梯 度又可分为连续线性梯度和分段线性梯度。
连续线性梯度和分段线性梯度的比较
在流速恒定的情况下梯度斜率改变对分辨率的影响
（样品为一段合成肽，层析柱为Sephasil Peptide C18 5μm ST 4.6/100， 流动相A为0.06%TFA水溶液，流动相B为0.055%TFA-84%乙腈， 流速为1ml/min，梯度：（A）0～60%，（B）20～35%。）
流动相中有机溶剂种类、酸的使用和pH值、 离子对试剂种类等都会对选择性和分辨率产 生影响 ； 分离一些低分子量物质时，升高柱温（降低 流动相的黏度，增加传质速度，减少区带变 宽现象 ）也是一种较为常用的改善分辨率的 方法 ； 降低流速一定程度上可提高柱效，但同时也 会增加溶质的纵向扩散，过低的流速反而会 造成分辨率下降，同时使分离时间延长 。
硅胶类介质往往存在 “亲硅醇基效应”（silanophilic interaction） 一定条件下，硅胶表面残余的硅醇基能与溶质 发生相互作用而对溶质的保留行为起决定作用 ; 亲硅醇基效应常导致溶质保留值重复性较差， 洗脱峰脱尾等不良层析行为 ; 硅胶表面均匀覆盖非极性配基，对残余硅醇基 屏蔽，可基本排除亲硅醇基效应的影响。新型 反相层析介质聚苯乙烯等高分子聚合材料的开 发，可根本消除亲硅醇基效应的影响。
㈡ 反相层析柱的尺寸和预装柱的选择
层析柱的尺寸由内径和柱长所界定，其取值主 要取决于分离的规模和所需的分辨率，其中内 径的取值与分离规模相关，而柱长和分辨率之 间则存在一定的联系； 反相层析介质都属于高效层析介质，粒径很 小，对填充技术的要求很高 ，人们可据所选择 的介质种类和层析柱尺寸直接选择对映的反相 层析预装柱，预装柱平衡后可直接使用； 层析柱的平衡 ，一般用流动相A对层析柱进行 充分的平衡。
再生常用2～5个柱体积的流动相B流经层析 柱移去残留在层析柱上的物质； 清洗常运行线性梯度从0.1%TFA到0.1%TFA异 丙醇，再几个柱体积的0.1%TFA异丙醇溶液， 最后运行线性梯度从0.1%TFA异丙醇溶液重新 回到0.1%TFA水溶液； 基于硅胶的介质常保存在纯的甲醇中，基于 聚苯乙烯的介质常保存在甲醇或20%乙醇中
㈡ 核糖体蛋白质的分离纯化
Ultrapore RPSC反相层析柱上从E.Hale Waihona Puke Baiduoli纯化核糖体50S大亚基蛋白质
㈢ 微量蛋白质的鉴定
（A）胶质细胞蛋白质SDS-PAGE一条区带胶内降解后提取的肽段的 反相层析曲线; （B）A图框内区域的放大
㈣ 制备型分离纯化
在不同规模上制备型纯化rhEGF （A）层析柱尺寸6.4×100mm，加样量2.14mL， （B）层析柱尺寸35×100mm，加样量62.5mL
四、应用
脱盐 分析型分离 制备型分离
㈠ 脱盐
特点： 属吸附技术，容许待脱盐样品的体积很 大，洗脱后的样品在很小的体积范围内被洗 脱，完成脱盐的同时实现样品的浓缩 反相层析脱盐后，蒸发除去流动相，所 得样品重新溶解在所需缓冲体系中后可以进 行下一步操作。
（A）凝胶过滤层析，（B）反相层析
用反相层析脱盐时，盐类等小分子不发生吸附， 从V0开始被洗脱，至Vc处基本洗脱完毕，而生物大 分子在换用有机溶剂后被洗脱