免疫共沉淀技术原理

免疫共沉淀原理及步骤

免疫共沉淀原理及步骤免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理IP是利用抗原蛋口质和抗体的特异性结合以及细菌蛋口质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。

口前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的日的。

通过低速离心，可以从含有U的抗原的溶液中将U的抗原与其它抗原分离。

免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。

免疫沉淀实验从:蛋白样品处理;抗体-agarose beads孵育;抗体-agarose beads 复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验U的。

IP实验步骤基本实验步骤(1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4?裂解30min, 12, OOOg离心30 min后取上清；(2)取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1 P g相应的抗体和10-50 u 1 protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4?C缓慢摇晃孵育过夜；(3)免疫沉淀反应后,在4?C以3, 000 g速度离心5 min,将protein A/G-beads 离心至管底;将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3, 4 次;最后加入15 U1的2XSDS加样缓冲液,沸水煮10分钟；（4）S DS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。

一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，笫一步处理样品非常关键。

免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。

免疫共沉淀技术原理和操作流程

体反应形成DNA-蛋白质-抗体复合体，然后沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段。
三、纯化与检测经蛋白质与DNA 解偶联，DNA片段纯化
等处理后，用PCR等方法检测DNA与蛋白质的结合情况.
注意事项
条超声波破碎条件的选择
件选
抗体量的选择
择 PCR反应条件的选择
对 Input对照
通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段
对目的片断的纯化与检测
操作步骤
一、固定在活细胞状态下，用甲醛固定蛋白质－DNA复
合物，然后用化学（微球菌酶）或者机械（超声波）的手段将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段。
二、免疫沉淀利用目的蛋白质的特异抗体通过抗原-抗
，得到相应肽列标签 4.搜索数据库分析目的蛋白相关数据进行后续研究
染色质免疫沉淀 (CHIP)
➢ 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要工具。它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。
CHIP原理
在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物
将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段
优点和不足
优点
1.可以分离到天然状态的相互作用蛋白复合物 2.蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避
免人为影响。
缺点和局限性
1.难以检测蛋白质的低亲和力和短暂的相互作用 2.不能够确定第三种蛋白的桥联作用
应用及实例
应用领域：
免疫共沉淀实验用途非常广泛，但一般主要用于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE和 MS质谱分析鉴定准备样品。
免疫共沉淀技术
• 定义及原理 • 操作流程 • 优点和不足 • 注意事项 • 应用及实例 • 展望

免疫共沉淀串联蛋白质谱coip-ms

免疫共沉淀串联蛋白质谱（CoIP-MS）是一种用于研究蛋白质相互作用的重要技术。

它通过将特定抗体与靶蛋白质结合，然后利用质谱技术鉴定和分析与该蛋白质相互作用的其他蛋白质，从而揭示细胞内复杂的信号传导网络和蛋白质功能。

在本篇文章中，我们将深入探讨CoIP-MS技术的原理、应用和局限性，以及个人对这一技术的理解和看法。

一、CoIP-MS技术原理1. CoIP原理免疫共沉淀（Co-IP）是一种将特定抗体与靶蛋白质结合的技术。

通过免疫沉淀的方式，来极大程度地富集我们需要的蛋白质。

2. 质谱技术原理质谱技术是一种通过离子化和加速来测定分子质量的技术。

在CoIP-MS中，利用质谱技术鉴定和分析与靶蛋白质相互作用的其他蛋白质。

二、CoIP-MS技术应用1. 蛋白质相互作用研究CoIP-MS技术被广泛应用于蛋白质相互作用的研究中。

通过对一种蛋白质进行免疫共沉淀，然后利用质谱技术鉴定与其相互作用的其他蛋白质，可以揭示信号传导、细胞周期、转录调控等生命活动的分子机制。

2. 蛋白质功能验证CoIP-MS技术也可以用于验证蛋白质的功能。

通过鉴定与某一特定蛋白质相互作用的其他蛋白质，可以初步推测该蛋白质在细胞内的功能和通路位置。

三、CoIP-MS技术局限性1. 验证性由于CoIP-MS技术对蛋白质相互作用的鉴定依赖于抗体的质量和特异性，因此在实际应用中需要进行多次重复实验来验证结果的可靠性。

2. 数据解析CoIP-MS生成的数据量庞大，需要借助生物信息学和统计学的方法来进行数据解析和筛选，因此在数据分析的过程中存在一定的复杂性和技术门槛。

四、个人理解和看法对于CoIP-MS技术，我个人认为它是一种非常有价值的蛋白质相互作用研究技术。

通过CoIP-MS技术，我们可以全面了解蛋白质的相互作用网络和功能，为生命科学领域的研究提供了强有力的工具。

然而，在实际操作中需要注意抗体的选择和数据的解析，以确保结果的可靠性和准确性。

总结回顾：通过本文的详细介绍，我们对免疫共沉淀串联蛋白质谱（CoIP-MS）技术有了更深入的了解。

免疫共沉淀原理及步骤

免疫共沉淀原理及步骤免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。

目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。

通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。

免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。

免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。

IP实验步骤基本实验步骤(1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min， 12,000g 离心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3)免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。

一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。

免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。

免疫共沉淀实验原理及方法

免疫共沉淀实验原理及方法免疫共沉淀（immunoprecipitation，IP）是一种通过抗体识别和结合特定抗原的方法，将抗原及其相互作用的分子从混合物中沉淀出来的技术手段。

免疫共沉淀主要用于分离和富集靶分子、研究蛋白质相互作用以及鉴定蛋白质复合物的成员。

免疫共沉淀实验基于抗体特异性识别抗原的原理。

首先，目标分子会与抗体发生特异性结合形成抗原-抗体复合物。

然后，通过添加一种固定在磁珠、琼脂糖或其他固相支持物上的抗体，将复合物沉淀下来。

最后，经过洗涤去除非特异性结合的蛋白质后，目标分子及与其交互作用的分子被纯化出来。

1.对抗原进行免疫沉淀：a.准备细胞或组织样品，适当处理样品以保持抗原的完整性；b.用适当的细胞裂解缓冲液击碎细胞或溶解组织样品，释放出蛋白质；c.将抗体与适当的固相支持物结合，如磁珠或琼脂糖；d.将抗体-支持物与样品混合，使抗体与对应抗原特异性结合；e.将混合物经过适当时间的搅拌、孵育，使抗原-抗体复合物形成；f.将复合物与支持物一同沉淀，可通过离心、磁力等方式实现。

2.清洗和纯化免疫沉淀复合物：a.使用适当的缓冲液对复合物进行洗涤，去除非特异性结合的蛋白质；b.重复洗涤过程多次，以确保复合物的纯化；c.使用适当的洗涤液将复合物从支持物中释放出来；d.将纯化复合物收集起来，以供后续分析或测量。

3.分析和检测免疫沉淀复合物：a. 可通过SDS-、Western blot等方法进行蛋白质分析；b.可通过质谱方法鉴定目标蛋白及其相互作用分子；c.可通过荧光探针标记等方法进行定量测量。

总结：免疫共沉淀实验是一种重要的生物分子分离和富集方法，通过抗体的特异性结合，可从混合物中沉淀出目标分子及其相互作用分子。

这一实验技术在生物学研究中具有广泛应用，可以帮助科研人员更好地了解蛋白质的相互作用网络和功能。

免疫共沉淀实验原理及详细步骤

免疫共沉淀实验原理及详细步骤免疫沉淀（immunoprecipitation，简称IP）是一种广泛应用于生物学和生物化学研究中的实验方法，用于检测和分离复合物中的特定蛋白质。

它结合了特异性抗体与蛋白质-抗体相互作用的原理，利用抗体选择性地沉淀出目标蛋白质，并与其相关的复合物。

本文将详细介绍免疫共沉淀实验的原理及步骤。

免疫共沉淀实验利用抗体与目标蛋白质相互结合的特异性，通过该特异性结合，将目标蛋白质及其相关的复合物选择性地沉淀出来。

该实验主要包括以下几个步骤：1.抗体与抗原的结合：在实验中，需要选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。

2.抗体与蛋白质-抗体复合物的沉淀：将抗体结合的蛋白质与复合物从样本中沉淀。

3.洗涤：洗涤沉淀的复合物，去除非特异性结合的蛋白质和杂质。

4.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。

1.细胞预处理：在进行免疫共沉淀实验之前，需要将细胞或组织进行必要的处理，例如刺激剂的刺激或疾病模型的建立。

可以选择不同条件下的实验处理组和对照组进行对比。

同时，还需要对实验样本进行适当的裂解，以确保目标蛋白质的充分释放。

2.抗体选择：选择特异性的抗体与目标蛋白质结合。

抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，也可以是特异性抗体。

此外，需要选择适当的免疫沉淀试剂盒，确保实验的准确性。

3.抗原结合：将适当的抗体与目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。

这一步骤可以在实验前进行或将其加入样本中进行。

为确保抗原-抗体结合的充分性，可以进行一定的反应时间和反应温度。

4.免疫沉淀：将抗原-抗体复合物选择性地沉淀出来。

可以采用多种方法进行免疫沉淀，例如蛋白A/G琼脂糖，特效筛选柱等。

通过离心或过滤等方式从沉淀中收集复合物。

5.洗涤：洗涤步骤用于去除非特异性结合的蛋白质和杂质。

洗涤液的组成可以根据实验需要进行调整。

洗涤步骤需要进行多次，确保洗涤得到干净的复合物。

6.释放目标蛋白质：将目标蛋白质从抗体中释放出来，以进行后续的下游分析。

免疫共沉淀原理及步骤

免疫共沉淀原理及步骤
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）原理：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）步骤：
✧配制100 ml 的modified RIPA buffe：
✧称取790 mg 的Tris-Base，加到75 ml 去离子水中，加入900
mg 的NaCl，搅拌，直到全部溶解，用HCl 调节PH 值到7.4；
✧加10 ml 10% 的NP-40；
✧加2.5 ml 10% 的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清；
✧加1 ml 100 mM 的EDTA，用量筒定容到100 ml，2～8 ℃保
存；
✧理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑
蛋白酶肽，亮抑酶肽, 胃蛋白酶抑制剂各100 μl；PMSF，Na3VO4，NaF 各500 μl），但是PMSF 在水溶液中很不稳定，
30 分钟就会降解一半，所以PMSF 应该在使用前现加，其他抑
制剂成分可以在水溶液中稳定 5 天。

co-ip原理

co-ip原理（一）Co-IP原理Co-IP（共份免疫沉淀）是一种分子生物学技术，可用于发现并分析蛋白质复合物的成分及其相互作用的研究。

该技术可利用抗体的特异性将目标蛋白以及其结合蛋白特异地沉淀出来，以期发现潜在的蛋白复合物和蛋白-DNA复合物。

Co-IP技术一般步骤如下：首先，研究对象物种细胞被称为特定细胞系。

根据此项实验的需要，将此特定细胞系与不同抗原复合，从而产生特异性抗体，其用于共份免疫沉淀；其次，在特定细胞系中提取出所需要分析的蛋白质组份，使用蛋白质粗提液。

其中，可根据不同的实验需要搭配合适的抗体，然后将上述蛋白质粗提液进行匹配；然后，使用车载法对所有混合的蛋白进行离散，后续可使用2D-PAGE、 Mass spectrometry等技术进行分析，在此过程中可将Co-IP实验分析出的有关不同蛋白质相互作用的信息保存；最后，将沉淀结果进行测序确定复合物成分，最终根据测序结果，能够确定不同蛋白质在体细胞中的亲缘关系，从而研究蛋白质复合物。

（二）应用Co-IP技术在蛋白质组学中有重要应用，主要用于研究蛋白复合物结构及其相互作用关系。

在此基础上，也在基因表达调控，神经元解剖结构，细胞枝法研究等生物学相关技术中获得良好的应用效果。

此外，在蛋白质组学研究方面，它可以揭示蛋白质功能以及其在相关疾病过程中的作用。

相较于抗原技术，Co-IP技术最大的优势在于，它可以检测出蛋白质相互作用的假想变化，或者检测蛋白质的更多的结构及其特定的功能，以及其在疾病发病过程中的表型变化。

此外，Co-IP技术也可以用于研究蛋白质复合物结构，和普通的蛋白质相互作用。

因此，与抗原技术相比，Co-IP技术可以检测出更多关于蛋白复合物的信息，具有更广阔的应用前景。

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)

一原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。

如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A 珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min 变性。

免疫共沉淀原理

免疫共沉淀原理
免疫共沉淀原理是一种生物学分析技术，它通过共沉淀来分离生物分子中的抗原和抗体，以此来进行抗原抗体平衡分析。

它是一种通用技术，可用于研究免疫反应的各种参数，如抗原抗体平衡、抗体交叉反应、抗体配体ack体识别、抗原复合物的稳定性等等。

免疫共沉淀原理极其灵活，可以处理复杂的免疫学问题，特别是对于免疫多肽的研究以及各类分子的抗原抗体确定。

免疫共沉淀原理的基本原理是：在体外条件下，将抗原和抗体分别用共沉淀剂进行溶解，求得抗原和抗体的共沉淀曲线。

根据该曲线，可以得出免疫反应的调节参数，比如抗原抗体平衡、抗体活性和特异性等等。

一般来说，免疫共沉淀技术需要使用多种试剂，例如抗原、抗体以及共沉淀剂。

抗原可以是金属缓冲液、植物抗原、蛋白质抗原、抗原复合物、活性碱基或DNA等。

抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、细胞内外体抗体、凝集抗体或抗体复合物。

共沉淀剂可以是聚磷酸钠、胆碱、胍乙酸等等。

免疫共沉淀分析可以用来实现快速、准确、可靠的抗体调节分析，以便获得免疫阴性反应的精确估计，进而更好地理解免疫反应的发生机制。

该技术也可以应用于其他分析，如血清学分析、蛋白质印迹、细胞和淋巴样细胞分析等。

总的来说，免疫共沉淀原理是一种非常有用的生物学技术，它可以用于研究免疫反应的多种参数，可以帮助理解免疫反应的发生
机制，从而提高疾病诊断和治疗的准确度。

该技术能够实现快速、准确、可靠的结果，可以用来研究植物抗原、蛋白质抗原、抗体复合物等，在分析血清学、蛋白质印迹、细胞和淋巴样细胞分析等方面也具有一定的应用价值。

免疫共沉淀实验原理及方法

免疫共沉淀实验原理及方法免疫共沉淀（CoIP）概述及原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。

免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。

免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。

免疫共沉淀的优势：与其他研究蛋白质相互作用技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相比，免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，避免了人为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。

免疫共沉淀的局限性和注意事项：1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到；2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大；4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高；5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测；6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员[1]免疫共沉淀的一般操作流程（中英文对照）：1.用预冷的PBS洗涤细胞两次；Carefully wash cultured cells with pre-chilled PBS for 2 times.2. 加入预冷的RIPA裂解缓冲液（107细胞加入1ml）；Add in cold RIPA lysis buffer (1ml for 107cells).3. 用预冷的细胞刮将细胞从培养介质上刮离，并转移到干净的1.5EP管中。

免疫共沉淀技术原理

免疫共沉淀技术原理
免疫共沉淀技术是一种在生物学实验中常用的技术，是由免疫学和共沉淀技术两种方法结合构成的。

免疫共沉淀技术基本原理为：首先用抗体（抗原特异性免疫球蛋白）和抗原（蛋白质、多糖类或核酸分子）结合，形成抗原-抗体复合物，然后将抗原-抗体复合物及抗原混合悬浮液置于离心机或离心管中，进行离心，将复合物沉淀在管底，抗原在此过程中被抑制，经离心或超滤操作从抗原-抗体复合物中抽提出抗体，最后可用SDS-PAGE或ELISA技术鉴定抗体的纯度。

该技术在抗原和抗体可溶性、亲和力足够强的情况下，可大规模地制备抗体。

免疫共沉淀原理及步骤

免疫共沉淀原理及步骤免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。

目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。

通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。

免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。

免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。

IP实验步骤基本实验步骤(1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min， 12,000g 离心30 min后取上清；(2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；(3)免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；(4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。

一、样品处理：免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。

免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原是否处于天然构象状态。

免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法

免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法免疫沉淀和免疫共沉淀是一种常用的实验技术，用于分离和富集特定的抗原-抗体复合物。

这两种技术在生物医学研究中广泛应用，有助于揭示蛋白质的相互作用、分子机制以及疾病的发生和发展过程。

下面将详细介绍免疫沉淀和免疫共沉淀的原理和方法。

免疫沉淀是利用抗体的高度特异性与需要研究的抗原结合，然后通过添加固相或固体材料，使抗原-抗体复合物沉淀。

这样可以将目标蛋白质从混合溶液中分离出来，以便于后续的分析和检测。

免疫沉淀的原理可以分为两个步骤：第一步是抗体与目标抗原的结合，第二步是利用固相或固体材料将抗原-抗体复合物沉淀。

免疫沉淀的方法通常包括液相免疫沉淀和固相免疫沉淀两种。

液相免疫沉淀方法是将抗体与需要研究的抗原混合，形成抗原-抗体复合物。

然后通过添加沉淀剂如聚乙二醇（PEG），将复合物沉淀下来。

沉淀后，可以通过离心将沉淀物与上清液分离。

固相免疫沉淀方法则是在固相材料如蛋白A/G琼脂糖或蛋白A/G磁珠上固定抗体，然后将抗原样品添加到固相材料中，形成抗原-抗体复合物。

复合物通过洗涤去除非特异性结合的物质，然后通过洗脱或酸性条件解离，将目标蛋白质分离出来。

免疫共沉淀是通过利用亲和层析柱或免疫磁珠结合多个抗体分离多个蛋白质复合物的技术。

与免疫沉淀不同的是，免疫共沉淀使用多个抗体同时结合多个蛋白质，以便于研究这些蛋白质之间的相互作用。

免疫共沉淀的原理与免疫沉淀相似，不同之处在于使用了多个抗体来捕获目标蛋白质。

免疫共沉淀的方法通常包括两个步骤：首先，在样品中添加多个抗体，形成抗原-抗体复合物。

然后使用亲和层析柱或免疫磁珠，将复合物沉淀下来。

与免疫沉淀类似，免疫共沉淀也可以使用液相或固相方法进行。

但是，由于需要结合多个抗体，免疫共沉淀的操作更加复杂。

总结起来，免疫沉淀和免疫共沉淀是一种基于抗体特异性的实验技术，用于富集和分离特定的抗原-抗体复合物。

免疫沉淀主要用于从混合溶液中分离目标蛋白质，免疫共沉淀则用于分离多个蛋白质复合物。

免疫共沉淀Co-IP步骤

免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。

如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。

这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

二、准备工作：预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月）9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl）10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h室温孵育12. 加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加2 μl"过渡抗体"（兔抗鼠IgG，兔抗鸡IgG）13. 14000rpm瞬时离心5s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用PBS14. 用60μl 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（60 μl足够上三道）15. 将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。

免疫共沉淀(Co-IP)

浓缩胶具有堆积作用，将较稀的样品，经过大孔径凝胶迁移作用被浓缩至一个狭窄的区带。
分离胶将不同大小的蛋白分离开来
SDS-PAGE
胶板选择
根据样品数和上样量数选择适合尺寸的胶板和相应的样品梳。
小型垂直电泳系统 14
胶浓度选择
根据待检测样品的分子量，选择合适浓度分离胶，具体配置查阅分子克隆。
分离胶 H2O 30%丙烯酰胺 1.5MTris (pH8.8)
14聚子阴0m%l合筛离（1后效子0 m形应去L）成。污交剂浓H叉，2缩O 网胶作状为结变构性，剂42m.使7和lml其助产溶生试分剂， 3断.3 m裂l 分子内和3分0%丙子烯间酰胺氢键，0.6去7 m折l 叠，消 2除.5 m电l 荷和分子1结M T构ris (的pH6影.8) 响。0.5 ml
淀实验，环状沉淀实验和凝胶内沉淀实验。
3
免疫共沉淀CoIP：
是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。
CoIP原理
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。
•电泳条件： 70V恒压30 min； 120V恒压1-1.5 h（具体时间根据分子量大
小，及预染Marker指示位置）。
转膜准备工作（湿转法）
•转膜缓冲液配置（预冷） 1 L体系：12.1 g Tris base 14.4 g Glycine 5%-20%甲醇
• 醋酸纤维膜：略比胶大，根据蛋白质分子量可以选择不同规格的，0.22μm；0.45 μm
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免疫共沉淀实验原理及详细步骤

免疫共沉淀实验原理及详细步骤免疫共沉淀是一种常用的实验方法，用于确定蛋白质与其他分子（例如核酸，蛋白质和脂类等）之间的相互作用关系。

该方法利用抗体与目标蛋白结合的特异性，将其与蛋白质一起纯化或检测。

下面将详细介绍免疫共沉淀的实验原理及步骤。

实验原理：在免疫共沉淀实验中，首先需要利用对目标蛋白高度特异性的抗体经抗原抵结的方式将目标蛋白与抗体结合。

然后将这种特异性抗体抵结的蛋白（复合体）与抗体相结合的固相支架接触，利用固相支架上特异抗体识别结合复合体，并通过洗脱和沉淀步骤将目标蛋白纯化或检测。

实验步骤：1.目标蛋白和抗原抵结：首先需要纯化目标蛋白或从合适的细胞系或动物模型中提取目标蛋白。

将目标蛋白与对其高度特异性的抗体一起孵育，使抗体能够特异性地与目标蛋白结合。

2.制备固相支架：在实验管中加入含有特异抗体的磁珠或琼脂糖等固相支架。

特异抗体可以是直接专一抗体，也可以是经过交联的间接专一抗体。

3.孵育复合体与固相支架：将目标蛋白与抗原抵结后的复合物加入到含有固相支架的实验管中，并进行充分的振荡孵育，使复合物能够与固相支架上的抗体结合。

4.洗脱非特异结合物质：通过连续洗涤步骤，将非特异性结合的杂质分子从固相支架上洗脱。

一般可以使用高盐浓度或化学物质（例如尿素或磺酸盐）来打破非特异结合以保留特异性结合复合体。

5.纯化或检测目标蛋白：通过洗脱步骤，从固相支架上将目标蛋白的特异性抵结复合物分离出来。

这些分离物可以用于进一步的纯化、分析或检测。

6.质谱分析或其他分析方法：将纯化后的目标蛋白样品进行质谱分析，确定目标蛋白自身和与其相互作用的分子。

总结：免疫共沉淀实验是一种利用抗体与目标蛋白之间的相互作用来纯化或检测蛋白质的方法。

这种方法可用于确定蛋白质与其他分子之间的相互作用关系，从而揭示生物学过程中的重要调节机制。

免疫共沉淀实验步骤繁多，需要注意实验操作的细节，但也是一个非常有价值和实用的技术。

免疫共沉淀原理

免疫共沉淀原理免疫共沉淀原理是一种利用免疫反应将多种分子结合起来的技术。

它为细胞生物学研究开发了一种全新的方法，可以有效检测出特定的分子相互作用。

这项技术广泛应用于各种生物科学领域，包括从分子水平研究到功能基因组学，甚至到临床检测。

免疫共沉淀技术的原理是，通过使用特定的抗体将目标分子结合，使目标分子与粒子聚集，形成溶胶体。

免疫共沉淀的反应依赖于抗体的特异性。

当抗体结合到受体上时，受体与抗原的结合就会发生作用，产生免疫反应，连接两个抗原。

相应的抗体，有时被称为特异性结合剂，称为识别剂，可以实现目标分子之间的特异性结合。

结合反应会导致目标分子形成聚类，形成一个溶胶体。

聚类量可以按照不同方式进行检测，也可以通过测量溶胶体的透明度和粒度等物理特性来估算出来。

由于免疫共沉淀技术是一种非常精确和有效的方法，它可以用来研究分子间的相互作用，也可以用来研究基因相互关系。

由于它可以从多种角度检测基因的结构和功能，因此提高了基因鉴定和定量分析的准确性。

这项技术还可以用来展示特定分子间的特异性相互作用，并为研究特定病毒的致病机制提供重要信息。

此外，免疫共沉淀技术还可用于疾病的临床检测。

它与自动化的疾病检测系统相结合，可以快速准确地检测出疾病抗原，有助于改善疾病的诊断和预防。

一般来说，免疫共沉淀技术的使用是一种改善检测准确度的有效途径，可以更有效地检测出疾病。

总之，免疫共沉淀原理是一种精确而有效的技术，用于检测特定分子相互作用，以及在研究基因结构和功能、致病机制及临床检测方面都表现出很大的优势。

随着免疫技术快速发展，免疫共沉淀原理也在不断完善，可以有效解决各种科学问题，为研究工作和临床检测提供了有效的技术支持。