人源化单克隆抗体的构建技术

人源化单克隆抗体的构建技术

摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床,经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。

关键词：人源化,单克隆抗体,构建

从20世纪7０年代英国学者Milsteｉn和德国学者Koｈler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1],单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系,还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。然而,单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢,主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fｃ受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别,产生人抗鼠抗体（human anｔiｇｅn mｏuｓe ａnｔiboｄy,ＨAMA）；三是在人体循环系统中被很快清除掉。因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造,减少异源抗体的免疫原性,成为单克隆抗体研究的重点[2]。随着对抗体基因的研究和ＤNＡ分子重组技术的应用,通过基因改造获得特异性抗体成为可能。１989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。至此,抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体;细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。

人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Ｖh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。

1 嵌合抗体的构建

抗体分子与抗原结合特异性由Ｌ链和Ｈ链V区决定，抗体C区可作为异源蛋白诱发免疫反应,产生抗小鼠抗体(human antｉ－ｍouse aｎｔiｂody,HAMA)。将小鼠单克

隆抗体C区用人抗体C区代替而拼接成嵌合抗体(chimｅric antibody），这样表达的抗体分子中轻重链的V区是异源的,而Ｃ区是人源的,这样整个抗体分子的近2/３部分都是人源的。这样产生的抗体,减少了异源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。

嵌合抗体(ｃｈiｍeｒic antiｂoｄｙ) 属第一代人源化抗体，有6０%~7０%的人源区域,是目前研究较多也较为成熟的基因工程抗体,人—鼠嵌合抗体基因工程改造策略主要包括:（１）从鼠杂交瘤中克隆V区基因。(2)选择合适的人C区基因。(3）构建载体并在一定表达系统中表达根据嵌合抗体Ｈ链和L链基因是否克隆、表达与同一载体与否，可将基因工程嵌合抗体的表达分为共转染表达模式(co-ｔransfectioｎmodｅl)和单载体转染表达模式(sinｇｌe vectoｒtｒａnsｆｅction ｍodel）。根据所需达到的功能，人重链的恒定区可为IgA、ＩgD、IｇE、IｇG 或IgM中的一种。通常，人源抗体包括嵌合抗体常采用ＩgG,因其对不同的亚基都合适。19８６年，Joｎes［３]等用寡核苷酸构建出小鼠抗半抗原——4-羟基-3-硝基苯乙酰基己酸(NP)的免疫球蛋白VＨ基因，其中编码ＶH 互补决定区(CDR)的序列来自小鼠的单抗，编码构架区(ＦR)的序列来自与鼠抗NP 单抗的FR同源程度较高的人骨髓瘤蛋白,通过人抗NP 重链可变区基因(hＶHNＰ) 与含有人重链恒定区序列的表达载体连接,并转染到只分泌抗NP轻链的小鼠杂交瘤细胞J5５８L中，结果获得可特异结合NＰ的人源化嵌合抗体。康向东等[4]从分泌抗人甲状腺球蛋白的杂交瘤细胞株hTg-60中提取总RＮA，逆转录－酶链聚合反应（RT-ＰＣR）扩增出鼠源性单克隆抗体hTg-60的VH及VＬ基因,经基因测序分析，设计出人源化抗体的基因引物,获得抗Ｔg单克隆抗体人源化VＨ及VL基因并将其克隆入真核表达载体，转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO），表达人源化嵌合ｈＴg抗体。成功获得了6株能稳定分泌抗hTｇ人源化嵌合抗体的细胞株。

2ＣDR 移植抗体的构建

尽管嵌合抗体Fｃ段换成了人源化，但V区保留的鼠源性保守序列仍能诱发HAMA,因此嵌合抗体不能彻底地消除鼠免疫原性,还需进一步对鼠源抗体的Ｖ区进行改造。抗体V区由ＣDR和骨架区（FＲ）组成。CDR是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定了抗体的特异性，而骨架区序列及其立体结构较为保守，是嵌合抗体诱发HAMA的主

要原因,因此将鼠单克隆抗体CDR移植到人单克隆抗体的V区框架上，使人单克隆抗体获得鼠单克隆抗体结合特异性，并减少异源性。这样获得的改型抗体也称CＤR移植抗体(CＤR grafting anｔibody)。然而，抗原虽然主要和抗体的ＣDR接触,但FR区也常参与作用,影响CDR的空间构型。因此换成人源ＦR区后，这种鼠源ＣDR和人源FＲ相嵌的Ｖ区，可能改变了单抗原有的ＣDＲ构型,往往明显降低抗原－抗体反应的亲和力, 甚至丧失与抗原结合的能力[５］。因此解决骨架区对CDR的影响,对CDＲ序列和框架结构进行分析和加工是十分重要的。V区CDR移植的设计原则是：（1)以Kabat的方法为基础选择顶端环状结构序列和紧邻CDＲ两侧的骨架序列：（２)对骨架区中影响抗原结合部位的氨基酸残基改为亲本鼠单克隆抗体的残基；(3）对抗体V区氨基酸序列数据库分析,选择与亲本鼠单克隆抗体同源性高的序列;（４）保留Ｖ区N末端氨基酸序列,尤其是L链V区N末端序列。将人改型V区基因与人Ig C区基因连接，构成完整的人免疫球蛋白基因即可进行表达。Couｔｏ等［6］首先利用计算机模建和实验探索找到一个最简模板。以此模板对抗乳腺表皮抗原BA46 的抗体Mｃ３成功地进行了人源化。由于人源化抗体( 嵌合或CDR 移植抗体）内还含有10%~３０%的鼠源蛋白，因而在临床应用时，或多或少地存在一些免疫排斥反应，没有达到治疗性抗体发展的最终目标——抗体完全人源化。

3 完全人源化抗体的构建

全人源化抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染色体技术,将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中,使动物表达人类抗体，达到抗体完全人源化的目的。

目前生产完全人源化抗体的方法主要包括抗体库技术和转基因技术，这２种制备技术竞争至今，孰优孰劣尚未可知[7]。

３.１抗体库技术

噬菌体抗体库技术的出现开创了一条简便快捷的基因工程抗体生产路线,为人源化抗体的制备提供了新途径。噬菌体抗体库( pｈaｇe antiｂoｄy librａry）技术是２０世纪9０年代初期抗体工程领域的重大研究进展，它结合了噬菌体展示与抗体组合文库