微生物工程实验指导

微生物工程实验指导

适用生物技术专业

食品与生物工程学院

2008.1

实验一 发酵实验用玻璃器皿灭菌前的包扎方法

一、目的：学习发酵实验用玻璃器皿在灭菌前的包扎工作，并了解灭菌后的使用方法。

二、原理：为保持发酵实验用玻璃器皿灭菌后的无菌状态，需要对

它们灭菌前进行包扎，这些工作看起来简单，但如操作不当或不按操作规程去做，则会影响实验结果，甚至会导致实验的失败。

三、材料和设备

5ml吸管30只，9cm培养皿 10套，120*12mm试管 120只，250ml三角瓶30个，脱脂棉0.5斤，天然棉0.5斤，8层纱布30块，线绳。

四、方法

1、洗涤

1 新器皿应用2﹪盐酸浸泡数小时再洗涤。

2 琼脂块不能倒入下水道。

3 含菌培养基一般先煮再洗。

4 洗涤后玻璃器皿上水应均匀湿润而无条纹和水珠。

2、包扎

① 平皿的包扎：10个一包。前9个方向一致，最后一个反放，用

纸卷成卷，也可放在特制铁桶中灭菌。

② 吸管的包扎：在吸管尾部塞入少许脱脂棉，脱脂棉长约1cm，

距管口约0.5cm，以防止在使用时造成污染。脱脂棉松紧适当，

多余的棉花可用火焰烧掉。每支吸管用约6cm宽纸条，吸管头部

包衬双层纸，以30－45º卷起，吸管尾部用剩余纸条打成一结，

防止散开，标上容量。使用时，从吸管中间凝断包扎纸带，抽出

吸管。

③ 试管的包扎：用天然棉做成棉塞，紧贴管臂，松紧适宜，棉

塞要实，2/3塞进管口。也可用硅胶塞。十只一把，外加牛皮

纸，扎好。脱脂棉易吸水，可能造成染菌。

④三角摇瓶的包扎：用8层纱布（大小适宜），塞入瓶口2/3，瓶

外部分揪成一团，再用一层牛皮纸或两层报纸把纱布遮严（以免

打湿），包扎，用绳子系成活扣。使用时，去掉包扎纸，拿去纱

布，接种后，将纱布塞进瓶口，纱布四角拉下，用绳子系成活

扣。

五、作业

体会这样做有哪些好处？

实验二 灭菌技术及其应用

一、目的：掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌的原理和操作。

二、原理：灭菌的基本原理是通过加热使微生物体内蛋白质凝固变性，从而达到灭菌目的。电热干燥箱适用于玻璃器皿的灭菌（培养皿、吸管等），高压蒸汽灭菌锅适用于含水培养物和玻璃器皿的灭菌。

三、材料和设备

电热干燥箱，高压蒸汽灭菌锅。

四、方法：

（一）电热干燥箱操作步骤及注意事项：

1．装箱将准备灭菌的玻璃器具洗涤干净、晾干，用纸包裹好，放入电热干燥箱内。关好箱门。

2．灭菌接通电源，打开排气孔，温度升至80℃－100℃时关闭气孔，继续升温至160℃－170℃，恒温2h。

3．灭菌结束后，断开电源，自然降温至60℃，打开电热干燥箱门，取出物品放置备用。

注意事项：

1．器皿在烘箱内不宜装得太满、太紧，以免影响温度的均匀上升。2．灭菌物品不能直接放在烘箱底板上，防止包纸烘焦。

3．灭菌温度恒定在160℃－170℃为宜，温度过高，纸和棉花会被烤焦。

4．降温时，待温度自然降至60℃以下再打开箱门，取出物品，以免因温度过高而骤然降温，导致玻璃器皿和玻璃箱门炸裂。

（二）、高压蒸汽灭菌锅操作步骤及注意事项：

1．加适量水，放入物品。物品间要有空隙，盖子对称拧紧。

2．通电加热，将锅内空气排放干净，排放空气的方法有两种，a.开放气阀，待冒热蒸汽3－5min即可；b.压力升至0.05Mpa时打开放气阀，使压力降为零。放完空气后，关闭放气阀，压力在0.105-0.13Mpa之间时，计时约25分钟左右。（含糖多、有生物活性物质的培养基，灭菌压力应小些，时间长些。）

3. 锅内压力降为零后，方可开盖取物。

注意事项：

1.在使用高压蒸汽灭菌器进行灭菌时，蒸汽灭菌器内冷空气的排除是否完全极为重要。当水蒸气中含有空气时，压力表所表示的压力是水蒸气压力和空气压力的总和，不是水蒸气的实际压力，对应的温度不是灭菌器内的实际温度，实际温度偏低，达不到灭菌所需的温度。因此，必须将灭菌器内的冷空气完全排除，才能达到完全火菌的目的。

2.不能在压力尚未降到零时就打开锅盖或强行放气，否则易造成灭菌有效时间缩短和容器中的液体爆沸。

3.对某些体积较大或蒸汽不易穿透的被灭菌物品，如固体曲料、土壤、草炭等，则应适当延长灭菌时间，应将灭菌时间延长至1～2h。

三、作业：

实验中可能会出现什么问题？如何解决？

实验三 学习接种技术和超净工作台的使用

一、目的：了解接种前的准备工作，掌握各种接种方法和超净工作台的使用方法。

二、原理：微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术。由于实验目的、培养基种类及容器等不同，所用接种方法不同，如斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种等，以获得生长良好的纯种微生物。为此，接种必须在无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作。同时，因接种方法的不同，常采用不同的接种工具，如接种环、接种针、移液管和玻璃涂棒等。

三、材料和设备

大肠杆菌斜面，黑曲霉斜面，肉汤斜面，查氏培养基斜面，超净工

作台，接种室（接种室 5平方米、缓冲室 2平方米，高≤2.5m；设推拉门，接种室与外室有小厨窗，用于传递物品及减少人员进出次数）。

四、方法：

1、接种前的准备工作：

5﹪的石炭酸喷雾，拖地；75﹪乙醇擦拭台面，将所有接种物品先放入超净工作台内，打开超净工作台风机和紫外灯，预热、杀菌

30min。

2、接种

75﹪乙醇擦手。接种时，动作应准确迅速，注意无菌操作。细菌采用划线法接种，霉菌采用菌块或孢子划线接种。每人接细菌斜面（大肠杆菌）和真菌（黑曲霉）斜面各一只。（标上日期、时间、姓名）

3、培养

细菌斜面37℃培养1天，真菌斜面28℃培养2天，观察是否染菌。

五、注意事项：

1．所有接种物品应一次性放入超净工作台内。

2．超净工作台内物品不可放的太满，酒精灯与进风口之间不可放置高大器皿，以免应响接种效果。

3．接种过程中，开盖15min的营养琼脂平板，盖盖37℃培养24－28h 后，平板内菌落数不超过4个，则认为接种室无菌程度良好。

六、作业：

1．接种前为什么超净工作台要预热30min。

2．接种前后为什么要灼烧接种环（钩）。

3．操作过程中可能会出现什么问题？如何解决？