免疫细胞的分离及检测※检测PPT课件
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免疫细胞的分离及检测技术课件
Ficoll分离液---聚蔗糖-泛影葡胺溶液
➢2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液+1 份34%泛影葡胺生理盐水溶液， 比重为1.077± 0.002
用1.077±0.001的分层液可将细胞分离
二 、淋巴细胞分离
（去单核细胞）
➢ 贴壁粘附法 ➢ 吸附柱过滤法 ➢ 磁铁吸引法 ➢ Percoll 分离液法
二、B细胞表面标志
➢ SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部 分CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以 SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指 标。
➢ CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和 B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而 B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的
细胞活力的检测
常用方法是台盼蓝染色法。这种染料不能透过活 细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，死 亡细胞的细胞膜通透性增高，可使染料进入细 胞而使细胞着色（蓝色）。
第二节 淋巴细胞标志及亚群分类
常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志 是簇分化抗原（Cluster of differentiation，CD）。
➢ 根据T细胞的免疫效应功能和表面CD分 子表达至少可以分为：辅助性T细胞、细 胞毒性T细胞和调节性T细胞；SmIg为B 细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标， 以CD5和CD19为标志可将B细胞分为B1 和B2两个亚群；目前多以CD3-、 CD16+、CD56+ 作为NK细胞的典型标 志。
三、NK细胞表面标志
人类NK细胞表面标志主要以 CD16、CD56来认定，临床上将 CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为 NK细胞。
T细胞及NK细胞
第三节 其他的免疫细胞
抗原提呈类细胞表面标志
免疫细胞的分离及检测课件
5
免疫磁珠分离法
6
（二）巨噬细胞的分离
☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 ☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取
7
（三）中性粒细胞的分离
聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞
WBC
• Ficoll分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞
血浆
RBC
RBC
(抗凝血)
8
Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞
有或无
无
增多、嗜碱 增多、嗜碱
有或无
有或无
有或无
有或无
未转化的淋巴细胞
6～8
不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
3H-TdR掺入法
原理:
刺激物
外周血（T）G0期 37℃56h
G1期→ S1期
3H-TdR
合成DNA↑
DNA- 3H-TdR
37℃16h
测淋巴细胞内放射量（cpm） 判断淋巴细胞转化程度
34
淋巴细胞转化的检测方法
形态学检查法 3H-TdR掺入法 MTT比色法
35
形态学检查法
36
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
细胞大小(直径 μm) 核大小、染色质 核仁 有丝分裂 胞质、着色 浆内空泡 伪足
37
转化的淋巴细胞
淋巴母细胞
过渡型
12～20
12～16
增大、疏松 增大、疏松
清晰、1～4个 有或无
目录
第一节 吞噬细胞的分离和收集 第二节 外周血单个核细胞的分离和纯化 第三节 淋巴细胞及其亚群的分离
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免疫细胞的分离及检测
免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来
免疫磁珠分离法
6
（二）巨噬细胞的分离
☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 ☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取
7
（三）中性粒细胞的分离
聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞
WBC
• Ficoll分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞
血浆
RBC
RBC
(抗凝血)
8
Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞
有或无
无
增多、嗜碱 增多、嗜碱
有或无
有或无
有或无
有或无
未转化的淋巴细胞
6～8
不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
3H-TdR掺入法
原理:
刺激物
外周血（T）G0期 37℃56h
G1期→ S1期
3H-TdR
合成DNA↑
DNA- 3H-TdR
37℃16h
测淋巴细胞内放射量（cpm） 判断淋巴细胞转化程度
34
淋巴细胞转化的检测方法
形态学检查法 3H-TdR掺入法 MTT比色法
35
形态学检查法
36
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
细胞大小(直径 μm) 核大小、染色质 核仁 有丝分裂 胞质、着色 浆内空泡 伪足
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转化的淋巴细胞
淋巴母细胞
过渡型
12～20
12～16
增大、疏松 增大、疏松
清晰、1～4个 有或无
目录
第一节 吞噬细胞的分离和收集 第二节 外周血单个核细胞的分离和纯化 第三节 淋巴细胞及其亚群的分离
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免疫细胞的分离及检测
免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来
免疫细胞的分离技术PPT幻灯片
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免疫细胞的分离
12 12
ห้องสมุดไป่ตู้
三、免疫细胞亚群的分离 —免疫磁珠分离法
❖ 1. 直接法：
抗细胞表面分子抗体 +磁性微球 免疫磁珠+细胞悬液 与免疫磁珠结合的细 胞
❖ 2. 间接法：
第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞
特定细胞 13
14
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免疫磁珠法分选装置
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三、免疫细胞亚群的分离 —流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）
FCM将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标 志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将 不同类型的细胞分选收集。
原理：细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细
胞排成单行，逐个流经检测区。当细胞从流动室喷 嘴处流出时，超声震动液流，使液流段裂成一连串 的均匀小滴，每个小滴内最多含一个细胞，细胞经 激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收， 转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞类型。
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免疫细胞的分离
❖ 人外周血单个核细胞的分离 ❖ 淋巴细胞的分离 ❖ 免疫细胞亚群的分离
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细胞分离原理
❖ 细胞的大小和比重 ❖ 细胞表面标志 ❖ 细胞黏附于各种物质表面的特性
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一、人外周血单个核细胞的分离 ——Ficoll分层离心法
人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC): Monocyte、Lymphocyte。
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三、免疫细胞亚群的分离
❖免疫磁珠分离法 ❖流式细胞术
免疫细胞的分离与功能测定55页PPT
60、人民的幸福是至高无个的法。— —西塞 罗
46、我们若已接受最坏的，就再没有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引入最美好的社会，使我们认识各个时代的伟大智者。——史美尔斯 49、熟读唐诗三百首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
免疫细胞的分离与Βιβλιοθήκη 能测定56、极端的法规，就是极端的不公。 ——西 塞罗 57、法律一旦成为人们的需要，人们 就不再 配享受 自由了 。—— 毕达哥 拉斯 58、法律规定的惩罚不是为了私人的 利益， 而是为 了公共 的利益 ；一部 分靠有 害的强 制，一 部分靠 榜样的 效力。 ——格 老秀斯 59、假如没有法律他们会更快乐的话 ，那么 法律作 为一件 无用之 物自己 就会消 灭。— —洛克
疫细胞的分离和功能检测
➢酶释法
细 胞
➢放射性核素释
溶
放法
解
➢流式细胞术
常用靶细胞: K562细胞株
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染色计数 离心取上清 测LDH或AKP
测CPM值
测发光强度
THANK YOU FOR YOUR ATTENTION!
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感谢下 载
第十章 免疫细胞的分离和功能检测
吴正吉 副教授 重庆医药高等专科学校医学技术系
目录
1 吞噬细胞的分离和收集 2 外周血单个核细胞的分离和纯化 3 淋巴细胞及其亚群的分离
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免疫细胞的分离及检测
免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来
※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定 ※方法：体外法为主 ※目的：判断机体免疫状态 ※意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效
有或无
无
增多、嗜碱 增多、嗜碱
有或无
有或无
有或无
有或无
未转化的淋巴细胞
6～8
不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
3H-TdR掺入法
原理：
刺激物
外周血（T）G0期 37℃56h
G1期→ S1期
3H-TdR
合成DNA↑
DNA- 3H-TdR
37℃16h
测淋巴细胞内放射量（cpm）
计算SI
判断淋巴细胞转化程度
免疫磁珠分离法
（二）巨噬细胞的分离
☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 ☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取
（三）中性粒细胞的分离
• 聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞
WBC
• Ficoll分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞
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免疫磁珠分离法
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（二）巨噬细胞的分离
☆斑蝥敷贴法分离人巨噬细胞 ☆动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取
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（三）中性粒细胞的分离
聚合物加速沉降法 可从外周血中分离出白细胞
WBC
• Ficoll分离法 可从白细胞中分离出纯化的中性粒细胞
血浆
RBC
RBC
(抗凝血)
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Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离中性粒细胞
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外周血各细胞成分的密度
细胞 血小板
PBMC
多核白细胞
红细胞
比重
1.030~1.035 1.075~1.090 1.092
1.093
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一、Ficoll分离法
Ficoll分离液法是一种单次差速密度梯度离心的分 离法，主要用于分离外周血中的单个核细胞。
原理： Ficoll分层液：密度1.077±0.001 离心：密度梯度离心 分离：各类细胞按其相应密度重新分布
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免疫细胞种类
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第一节 吞噬细胞的分离和收集
吞噬细胞的种类 ﹡大吞噬细胞:即单核-吞噬细胞系统 ﹡小吞噬细胞:即中性粒细胞
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一、吞噬细胞的分离
（一）单核细胞的分离
特征性标志 CD14 分离技术 • Pecoll密度梯度分离法 • 流式细胞仪分离技术 • 免疫磁珠分离法：为目前较常用的方法 • 黏附法
第十章 免疫细胞的分离和功能检测
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目录
第一节 吞噬细胞的分离和收集 第二节 外周血单个核细胞的分离和纯化 第三节 淋巴细胞及其亚群的分离
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免疫细胞的分离及检测
免疫细胞的分离 是指将各种参与免疫反应的 细胞从血液或组织中分离出来
※检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定 ※方法：体外法为主 ※目的：判断机体免疫状态 ※意义：探讨疾病的发病机制、发展、预后、疗效
原理及技术要点 在一特制的分上下两层的小盒，将趋化因子加入
下室，待检细胞加入上室，两室用微孔滤膜分隔， 37℃温育数小时后，上室的中性粒细胞受下室趋化 因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取滤膜清洗、 固定、干燥、染色和透明，在高倍镜下观察细胞穿 越滤膜的移动距离，从而判断其趋化功能。
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琼脂糖平板法
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免疫磁珠分离法
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流
式
488 nm 激光
细
胞
术
分 离 原
-
电磁场
理
示
单个细胞被分类
意
进入检测管
图
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前向散射光 检测器
荧光检测器
+
E花环沉降法
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三、相关功能检测
T细胞功能检测 B细胞功能检测 NK细胞功能检测
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T细胞功能检测
T细胞增殖试验 T细胞介导的细胞毒试验 MHC-肽四聚体技术 淋巴细胞内细胞因子检测
原理及技术要点
在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液，左孔加 趋化因子，右孔加对照液，温育4～8小时后，用显 微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的移动距离A和 向右孔的移动距离B，计算趋化指数。
趋化指数= A/B 趋化指数越大，表明中性粒细胞运动功能越强
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（一）中性粒细胞吞噬功能检测
显微镜检查法
吞噬率 (%)吞噬细菌的白细1胞00数 计数的白细胞数
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淋巴细胞转化的检测方法
形态学检查法 3H-TdR掺入法 MTT比色法
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形态学检查法
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未转化和转化淋巴细胞的形态特征
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Ficoll分层液分离单个核细胞示意图
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Percoll分离单个核细胞示意图 78％ 98％
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第三节 淋巴细胞及其亚群的分离
一、淋巴细胞的纯化
﹡红细胞的去除：低渗裂解法、氯化铵裂解法 ﹡血小板的去除 ：胎牛血清梯度离心法
﹡单核细胞的去除：黏附法 羰基铁吞噬法（磁铁吸引法） 苯丙氨酸甲酯去除法
体外试验法：滤膜渗透法
琼脂糖平板法
皮肤窗法 在受检者前臂屈侧中央3㎜范围内，搔刮 皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第2，5，8，12， 24，36小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集 开始时间、聚集程度等。健康正常人一般2～3h后
开始聚集，达50～100个，6小时可达1000个以上。
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滤膜渗透法
炭粒廓清试验 正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90％炭粒，脾巨噬 细胞约吞噬清除10％炭粒。据此给小鼠静脉注射定量 印度墨汁（炭粒悬液），间隔一定时间反复取静脉血， 测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度， 判断巨噬细胞的功能。
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吞噬功能检测
孵育
Mф +CRBC
涂片、染色、镜检
计算、吞噬率、吞噬指数
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T淋巴细胞增殖试验
刺激物 淋巴细胞
DNA合成 母细胞
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分化
-
细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松
淋巴细胞转化的刺激物
非特异性刺激物： PHA ------ T细胞 ConA ------ T细胞 PWM ------ T、 B细胞 LPS ------ B细胞
特异性刺激物： 异种抗原 同种组织抗原
吞噬指数=
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杀菌功能检测
NBT还原试验
原理：
N-N-
C
+ H+
N=N-R-
四氮唑基（淡黄色）
N-NH2 C N=NH
甲chan（紫黑色）
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NBT还原试验
方法：
1.抗凝血 + 硝基蓝四氮唑（NBT），37℃孵育 25min。
2.推片染色、镜检。
正常值： NBT阳性细胞率应≥95%
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（二）巨噬细胞功能检测
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二、淋巴细胞亚群的分离
免疫磁珠分离法 流式细胞术分离法 其他方法
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免疫磁珠分离法
原理 将针对淋巴细胞特殊表面标志的某种特异性单克
隆抗体与磁珠结合形成免疫磁珠（IMB），当特异性 单克隆抗体与表达相应抗原的靶细胞结合，利用磁 场可以将IMB所结合细胞与其他细胞分离。包被磁珠 的抗体可以是第一抗体或第二抗体。
吞噬率＝（吞噬CRBC的Mф 数/计数的Mф 数）×100％
吞噬指数＝ Mф吞噬的CRBC总数/计数的Mф 数
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第二节 外周血单个核细胞的分离和纯化
PBMC包括：淋巴细胞、单核细胞 各种血细胞比重不同,利用密度梯度离心进行分
离 常用分层液：ficoll－hypaque，percoll
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二、相关功能检测
吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞内杀灭作 用三个阶段，据此建立相应的检测方法。 （一）中性粒细胞功能检测技术 （二）巨噬细胞功能检测技术
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（一）中性粒细胞功能检测
细胞趋化功能的检测 吞噬功能的检测 杀菌功能的检测
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趋化功能检测——检测细胞运动功能
体内试验法：皮肤窗法