食品分离技术(5) 离心技术

2、转子桶内装有十字形隔板，把桶内分隔成多个扇形小室， 隔板内有导管；
3、区带转头的“管壁效应”极小，分离效果好，转速高， 容量大，回收容易；
缺点：
区带转头的样品及介质与转头直接接触，要求转子耐腐蚀， 并且操作复杂。
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5、连续转头：
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自动排出沉渣的离心澄清机
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分批自动排出沉渣的离心澄清机
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速度区带法与等密度离心法的比较
分离法
速度区带离心法
原理
沉降与颗粒质量成正比，以 物质沉降速度的不同进行分 离
介质
密度小，如蔗糖、甘油、聚 蔗糖，蔗糖浓度10% 67%， 密度1～1.3286预制梯度，不 连续
离心力场
强，离心速度高，使被分离 物质易沉降
离心过程 样品向离心管底沉降
离心时间
较短，一般为几小时到几十 小时
平衡密度梯度离心法
沉降与颗粒的密度成正比，以物质 的浮密度不同进行分离
密度大，如CsCl,Cs2SO4，CsCl浓 度0～1355，密度为1～1.9025，自 成连续梯度
稍强，速度相对低，使CsCl形成梯 度，建立沉降扩散平衡 不论样品起始时在什么位置，离心 中样品停留于介质的等密度部位
较长，十几小时到数天
细胞 细胞核 适用范围 细胞器 蛋白质
低速离心机 2000-6000 2000-7000g
适用 适用 -----------
高速离心机 10000-26000 8000-80000g
适用 适用 适用 ------
超速离心机 30000-120000 100000-6000000g
适用 适用 适用 适用
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密度梯度离心操作步骤
1、梯度制备 2、样品的装入和离心 3、取出梯度 4、梯度的分析
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四. 密度梯度溶液的制备
(一).梯度材料的选择原则:
1、与被分离的生物材料不发生反应。 2、可达到要求的密度范围,且在所要求的密范围内,粘度低,渗 透压低,离子强度和 pH变化较小。 3、不会对离心设备发生腐蚀作用。
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2.注意点： 离心时间要长 可用角式转头或水平式转头 粒子密度相近或相等时不宜用 密度梯度溶液中要包含所有粒子密度 不能用刹车
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收集区带的方法： 用注射器和滴管由离心管上部吸出; 有针刺穿离心管底部滴出;
用针刺穿离心管区带部份的管壁，把样品区带 抽出;
用一根细管插入离心管底，泵入超过梯度介质最 大密度的取代液，将样品和梯度介质压出，用自 动部分收集器收集.
也不同,那么在一定的转速下其RCF值也各不
相同
RCF 1.119105 n2r
设40000rpm时
R1最小、 3.8cm
R2平均、 5.9cm
R1
R3最大、 8.1cm
R2
RCF值分别
R3
67,910g 105,400g
144,700g
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2.水平转子
（1）转子静止时,处在转子中的离心管中 心线与旋转轴平行,
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沉降界面 沉淀
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角式转子的特点：
（1）重心低,转速可较高； （2）样品粒子穿过溶剂层的距离略大于
离心管的直径; （3）“管壁效应” ：
有一定的角度, 在离心过程中撞到 离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形 成沉淀, 此效应使最后在管底聚成的沉 淀较紧密。
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在离心管的不同部位距旋转中心轴的距离
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（三）根据用途分类： 实验室或工厂、分析或制备
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（四）根据离心形式分类：
离心过滤：指在有孔转鼓的离心机中通过过滤介质分离悬浮 液的过程。
离心沉降：利用固液两相比重的差异在离心机无孔转鼓或离 心管中进行悬浮液沉降的过程。
离心分离：利用不同溶质颗粒在液体各部分分布的差异，分 离不同比重的液体的过程。
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1.低速离心机 (2000-6000rpm)
转子 电动机
转子带有放置离心管的孔 转子的中央位于离心机的驱动轴上 离心机的转速和温度控制不够准确 一般最高转速在6,000rpm以下 实验室中常用于分离制备。
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2.高速离心机 (10000-26000rpm)
制冷设备温度控制在0-4℃范围内 制动器（刹车） 实际速度和温度可通过仪表显示 配有一定类型及规格的转子 最高转速在26,000rpm以下 常用于生物大分子的分离制备
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(三).等密度离心法
1原理 预先配制介质的密度梯度（包含了被分离样品中所有
粒子的密度），样品铺在梯度液顶上或混合,离心开始后, 梯度液受离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度, 与此同时原来分布均匀的样品粒子也发生重新分布。各种 颗粒移动到与它们各自密度恰好相等的位置上形成区带。
特点： （1）与样品粒子的密度有关 （2）与样品粒子的大小和其他参数无关 （3）转速、温度不变,则延长离心时间也 不改变这些粒子的成带位置。
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3.超速离心机
驱动和速度控制 温度控制 真空系统 转子
常用于分离亚细胞器、病毒粒子、DNA、RNA和蛋白质分子。 在分离时无须加入可能引起被分离物质结构改变的物质。
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（二）.根据转子形式分类(Rotor)
固定角式转子(fixed-angle rotor) 水平转子(swing-out rotor) 垂直转子(vertical rotor) 带状转子(zonal rotor) 连续转子(continuous rotor)
2r
RCF
4 2n2r
1.119105 n2r
980 3600 980
n：转子每分钟的转数（rpm）
低速离心时常以每分钟的转数rpm（即n）来作为离心力单 位；而高速离心则以g表示。
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Dole&Cotzia s制作了转子 速度和半径相 对应的离心力 列线图
半径
相对离心力
转数
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沉降系数 Sedimentation coefficient (S)
4、容易纯化,价格便宜或容易回收。
5、浓度便于测定,如具有折光率。
6、对于分析超速离心工作来说,它的物理性质,热力学性质应 该是已知的。
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常用的梯度材料： 糖类: 蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)、右糖酐、糖原 无机盐类:CsCl(氯化铯)、RbCl(氯化铷)、NaCl、KBr等 有机碘化物:三碘苯甲酰匍萄糖胺等 硅溶胶: 如Percoll。 蛋白质:如牛血清白蛋白 重水 非水溶性有机物:如氟代碳等
1.原理 离心前离心管内先装入密度梯度介质,形成密度梯度，介质
最大密度要小于所有样品颗粒的密度。样品铺放在梯度溶液表 面，离心后不同大小、形状，有一定沉降系数差异的颗粒形成 若干条界面清楚的不连续区带。
可用来分离核酸、蛋白质及核糖体亚基等成分。
2.注意点： 严格控制离心时间 颗粒密度大于介质密度ρp>ρm 事先配成较平缓的连续密度的梯度溶液 不能用角式转头、只能用水平式转头 不能用刹车
差速离心法
平衡离心法
速率区带离心法
离心分离法 等密度离心法
沉降平衡离心法
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(一).差速离心法
1、原理 利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别,在同一离心
条件下,沉降速度不同,通过不断增加相对离心力,使一个非 均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分步沉淀。
差速离心的分辨率不高,沉淀系数在同一个数量级内的各种 粒子不容易分开,常用于其他分离手段之前的粗制品提取。
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3.垂直转子
离心管垂直插入转子孔内,在离心过程中 始终与旋转轴平行,而离心时液层发生90°角 的变化,从开始的水平方向改成垂直方向,当 转子降速时,垂直分布的液层又逐渐趋向水平, 待旋转停止后,液面又完全恢复成水平方向。
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4、区带转头：
特点：
1、无离心管；由转子桶和可旋开的顶盖组成。
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转子的材质：
铝质 较轻,耐受强度较弱,适合在较低 的转速下使用;
不锈钢 耐受强度最好,但材质本身太重； 钛合金 耐受强度不错,重量也比不锈钢轻。
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1.固定角式转子 离心管在离心机中放置的位置与旋转轴
心形成一个固定的角度,角度变化在14-40° 之间。
常见的角度 20° 28° 34° 40
样品颗粒的大小 形状 沉降系数 密度 溶剂的粘度、密度 离心加速度
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➢蛋白质的相对分子量越大，沉降系数越大。
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沉降速度 sedimentation velocity
(1)定义： 指在强大的离心作用下，单位时间内物质
运动的距离。
v
dx dt
2r（2 9p -m）2x
d2(p 18
m )
2x
r： 球形粒子的半径 d： 球形粒子的直径 η： 流体介质的粘度 ρp：粒子的密度 ρm：介质的密度
离心机使用的注意事项
使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离 心管和其内容物。
离心管装液不可超过管容量的2/3，尤其是角转子。 在低温下离心时，转头需预冷。
离心过程中不得随意打开离心机盖。 每个转头各有其最高允许转速和使用累积限时，使用转 头时要查阅说明书，不得过速使用。
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五、离心机的选择
普通制备离心机的选择 （1） 过滤式离心机 （2） 沉降式离心机 （3） 分离式离心机
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超速离心机的选择
估算离心力和离心时间 超离心方法的选择 转子、离心管的选择 梯度、介质的选择
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(二).梯度材料的应用范围
1.蔗糖: 常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料
有较大的渗透压,不宜用于细胞的分离。 2.聚蔗糖: 用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细
胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞 3.氯化铯: 被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离
价格较贵
4.卤化盐类:
5.Percoll:
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离心沉降和重力沉降只是对沉降的作用力不同，离心沉降
的速度v v S2r
其中S即为沉降系数。
S表示单位离心场中粒子的移动速度。
S
沉降速度 单位离心力
v
2r
2.303
log r2 log r1
2 (t2 t1)
r1:离心前粒子距离转轴的距离
r2:离心后粒子距离转轴的距离
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S在实际应用时常在10-13秒左右，故把 沉降系数10-13秒称为一个Svedberg单位， 简写S，量纲为秒。
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ρp-ρm=0 即ρp=ρm V=0 S=0 粒子平衡
ρp-ρm>0 即ρp>ρm V>0 S>0 粒子沉降
ρp-ρm<0 即ρp<ρm V<0 S<0 粒子逆着离心方向上浮
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二、离心设备分类
离心机
转子 主机 附件
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分类标准多种多样： （一）根据转速分类：低速、高速、超速
项目 转数(rpm) 离心力(rcf)
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离心力
离心力（F）：当离心机转子以一定的角速度ω（弧度/秒） 旋转，颗粒的旋转半径为r（厘米）时，颗粒所受的向外的 力即离心力。
F ma m2r
ω: 旋转角速度 r：旋转体离旋转轴的距离
2 n rad / sec
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相对离心力
相对离心力（RCF）：又称分离因数，是衡量离心程度的 参数，是指在离心力场中，作用于颗粒的离心力相当于地 球 引 力 的 倍 数 ， 单 位 是 重 力 加 速 度 g （ 980cm/ 秒 2 ） 。 RCF=ω2r/980 = 4π2n2r/3600*980 = 1.119*10-5n2r
2.注意点： 可用角式、水平式转头 可用刹车 难以获得高纯度
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例用差速离心法分离已破碎的细胞各组份 已破碎的细胞 500g,10分钟
沉淀
上清液
(细胞核） 10,000g,10分钟
沉淀
上清液
(细胞膜碎片,线粒体,) 100,000g,3小时
溶酶体
Baidu Nhomakorabea
沉淀
上清液
(核糖核蛋白体） (可溶性成份)
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(二).速率区带离心法
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（五）根据结构特点分类：
转子形状：角式、外摆、管式、碟片式 转轴位置：直立、水平、倾斜 驱动方式：手摇、气动、磁悬、电动
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操作方式：连续、半连续、间歇 卸料方法：人工、重力、刮刀、振动、蠕动
泵、喷嘴、螺旋等 使用温度：冷冻和常温
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三.离心分离方法
根据离心原理,按照实际工作的需要，目前 已有可设计出各种离心方法综合起来大致可分 三类
（2）转子旋转加速时,离心管中心线由平 行位置逐渐过渡到垂直位置,即与旋 转轴成90°角,
（3）粒子的沉淀方向同旋转半径方向基本 一致，有少量的“管壁效应”。
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水平转子的特点
（1）转子的重心位置较高
（2）样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于管直径
（3）对于多种成分样品分离特别有效
（4）常用于速率区带离心和等密度离心
第五章 离心技术
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离心技术
离心是利用旋转运动的离心力，以 及物质的沉降系数或浮力密度的差别 进行分离、浓缩和提纯的一项操作技 术。
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主要内容
离心的基本原理 离心设备的分类 离心机的选择 离心技术应用实例
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一、离心的基本原理
利用转子高速旋转时所产生的强大离心力，加快 颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数的或浮 力密度差的物质分离开。