土壤细菌分离及纯化共35页文档
土壤中微生物的分离纯化、培养观察及保藏
番红 G-
显微镜下菌体呈红色者为革兰氏染色阴性细菌 (常以G-表示)，呈深蓝紫色者为革兰氏染色阳性 反应细菌(常以G+表示)。
细菌的革兰氏染色
革兰氏染色实验步骤
制片：取菌种培养液常规涂片，干燥，固定。 初染：滴加结晶紫，染色1－2min，水洗； 媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min,
相关理论知识（2）
土壤中的微生物
✓土壤是微生物生长繁殖的天然培养基 ，是 人类最丰富的“菌种资源库”。
✓不同类型的土壤、同一类型土壤的不同深 度或不同水平位置，微生物种类和数量变 化很大。
✓由于表层土壤比较干燥，且接受大量紫外 线照射，所以微生物主要分布在营养条件 良好、氧气含量比较丰富的浅土层
每克耕作层土壤含菌量十倍递减 细菌（~108）
细菌细胞的生理生化反应
目的要求
1、不同微生物对各种有机分子水解能力不同，说明 不同微生物有不同的酶系统。
2、掌握微生物大分子水解实验的原理及方法。 3、了解糖发酵原理及在肠道细菌鉴定中的作用。 4、了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的实验
原理和方法。 5、了解细菌在培养基中的生长现象及其代谢产物
大
中
小
炭疽芽胞杆菌 3-10 μm
大肠埃希菌 2-3 μm
布鲁菌 0.6-1.5 μm
细菌的革兰氏染色
注意事项
1. 涂片务求均匀，切忌过厚。 2．在染色过程中，不可使染液干涸。 火焰固定不
宜过热。 3．脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳
性菌被染成阴性菌；脱色不够，则会使阴性菌被 染成阳性菌。 4．不能选用老龄菌。
在鉴别细菌中的意义。
细菌细胞的生理生化反应
实验原理（1）
各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细 菌分解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所 能发酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养的要 求不同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映 了它们有不同的酶系统。
实验八、土壤微生物的分离和 纯化
实验八、土壤微生物的分离和纯化土壤微生物是指生长在土壤中的微弱的、微小的生物体，包括细菌、真菌、放线菌、原生动物等。
土壤微生物是土壤的重要组成部分，对维持土壤生态系统的平衡和功能发挥起着关键作用。
因此，对土壤微生物的分离和纯化具有重要意义。
本实验就是针对土壤微生物的分离和纯化进行研究。
一、实验原理由于土壤微生物数量繁多而多样，分离出单一的菌落对于此实验来说非常的困难。
但是采用适宜的富培养基后能够轻松的促进土壤微生物菌群的生长。
富培养基包括有机和无机元素、维生素、氨基酸、碳源和氮源。
地衣素琼脂（ISP）是一种富含多种碳源和氮源的优质菌落培养基，是常用的微生物培养基。
本实验的基本原理就是在能够生长的环境中分离出单一的菌落，通过多次分离和鉴定获得纯种菌株。
二、实验器材和试剂1.地衣素琼脂培养基2.试管、移液器、移菌环、烧灼器、电热蚊子香、灭菌器3.已经壳霉菌疫苗接种的贵州悬钩子种子和土壤三、实验步骤1.准备工作。
用移液器将壳霉菌疫苗接种在新的地衣素琼脂培养基板上，将其灭菌，以备之后的使用。
2.准备土壤基质。
将土壤样品剪碎成非常小的颗粒，并放入烧灼的试管中，加入恰当的地衣素酵母素琼脂，变形后形成一个接种板。
在较大的容器中放置电热器设备，以保持环境的湿度和温度适宜。
接下来，将接种板和采样站放在单独的区域以免混淆。
3.接种。
从土壤中取一小部分，倒入试管中，并加入适量的地衣素琼脂培养基，并将其摇动均匀，使菌群溢出。
等到土壤均匀地分散在地衣素琼脂培养基中之后，用移菌环扭曲并切出一个菌落，并将其置于新的地衣素琼脂培养基板中。
重复此步骤至少三次，每次都要将新的分离土壤菌落剪出来。
4.孵育。
将地衣素琼脂培养基板置于电热器设备中，以使温度保持在合适的范围内，并等待菌落的生长。
当新的菌落形成后，即可重复上述步骤以获得更多的菌株。
5.纯化。
检查菌落后，需要进行纯化。
鉴定每个菌落，把每个菌落分别悬浮在新的地衣素琼脂培养基板中，并等待菌落的生长。
土壤微生物的分离纯化与鉴定
目录摘要利用分离纯化微生物的基本操作技术以及选择培养基对土壤中的微生物进行分离与纯化,得到能够产生果胶水解酶的细菌以及能够分解几丁质的霉菌;根据菌落形态观察,革兰氏染色结果,芽孢有无及位置,运动性以及一系列的生理生化试验的结果,对照种属特征初步鉴定分离纯化的微生物所属的类群;关键词土壤微生物、细菌、果胶、霉菌、几丁质、划线分离、纯培养前言在自然条件下,微生物常常在各种生态系统中群居杂聚;群落是不同种类微物的混和体;为了生产和科研的需要,人们往往需要从自然界混杂的微生物群体中分离出具有特殊功能的纯种微生物；或重新分离被其他微生物污染或因自发突变而丧失原有优良性状的菌株；或通过诱变及遗传改造后选出优良性状的突变株及重组株;这种获得单一菌株纯培养的方法称为微生物的分离纯化技术;纯培养是指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代;分离纯化技术主要由采集样品、富集培养、纯种分离和性能测定等几个基本环节组成;实验目的1.学习利用选择培养基从土壤中分离能够产生特殊水解酶的细菌以及霉菌的方法；2.学习运用划线分离法纯化分得的细菌以及真菌的方法；3.学习测定土壤中细菌数目,种类的方法；4.根据菌落形态,染色结果,运动性以及生理生化试验鉴定未知细菌；小室培养法观察鉴定未知真菌;实验原理一、经典分类鉴定方法以上便是在微生物鉴定过程中的经典思路及流程,因此我们可以针对以上各项指标设计一系列试验包括形态学观察,染色,生理生化试验,免疫学试验等对其进行逐步定位;二、现代分类鉴定方法1．微生物遗传型的鉴定（1） DNA碱基比例的测定 G+Cmol%以下为该方法的关键因素：解链温度法Tm值G+Cmol%值只能做否定判断；G+Cmol%值差别>5,属不同的种；差别>10,属不同的属;2 核酸分子杂交法DNA-DNA分子杂交原理：DNA分子解链的可逆性和碱基配对的专一性;结论：I DNA同源性≥ 60% 同种II DNA同源性≥ 70% 同亚种III DNA同源性60~ 70% 不同亚种IV DNA同源性20~ 60% 同属316s rRNA作为细菌进化的计时器本次实验中由于实验性质以及仪器试剂限制,主要以微生物形态鉴定以及生理生化指标鉴定为主;实验整体思路：在确定取样环境之后,对微生物原样进行梯度稀释,产生合适的浓度在选择培养基上进行涂板用于微生物的选择与计数；通过检测得到有特定功能的细菌以及霉菌进行菌种的分离纯化,用平板划线法多次划线得到纯种；对得到的纯种细菌染色并镜检,利用形态学方法以及运动性对微生物做一粗略的定位；根据镜检设计相关生理生化试验作进一步定位；运用小室培养法观察霉菌形态并对其进行鉴定；根据以上获得的信息确定微生物类群并加以定位;实验仪器及材料1.土样：18号土样2.试剂及培养基a)培养基：果胶酶筛选培养基；几丁质酶真菌筛选培养基；果胶酶划线分离培养基；几丁质酶划线培养基；细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培养基；蛋白胨水培养基b)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95%乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等3.仪器锥形瓶500mL×2；300mL×2；100mL×3、培养皿20套、试管20支、移液管3支、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布等实验步骤A.细菌的筛选,分离纯化及鉴定1.细菌的筛选a)土样处理i.配制生理盐水：在烧杯中配置％的生理盐水,用移液管各移取9ml于五支洁净试管,再移取90ml配置好的生理盐水于三角烧瓶,并放入少许玻璃珠,包好灭菌；ii.加土样：冷却后准确称取10g土样放入盛有90ml无菌生理盐水并带有少许玻璃珠的三角烧瓶中,充分震荡摇匀,然后放在30℃恒温培养箱中静置15min;b)果胶酶菌种筛选i.梯度稀释：用一支无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的试管中充分混匀,此为10-1稀释液,以此类推制成10-2、10-3两种稀释度的土壤溶液如下图；ii.涂布：配制果胶酶筛选培养基,110度灭菌20-30分钟,冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记,分别写上10-1、10-3两种稀释度字样,每稀释度标记三皿,然后用无菌吸管分别由10-3、10-1两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置,每皿准确放入,用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀,其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之均匀分布,然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动,平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；iii.培养：将平板倒置于30℃恒温箱中培养1-2天；iv.果胶酶透明圈平板检测：取10-1涂布平皿,用％的刚果红染色15-20min后,倒掉刚果红,用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈,则说明水解圈内的菌有水解果胶的能力；v.菌落描述：取此菌进行菌落形态描述,就菌落的大小大、中,小,颜色白,黄,粉红等,干湿干、湿,边缘整齐,不整齐,表面光滑,粗糙,有无突起等分别进行阐述并详细记录；2.细菌的分离纯化a)划线分离：制备果胶酶划线培养基,灭菌后倒平板,挑取具有水解圈的菌种,第一次划线分离培养1-2天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离,划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域,然后将接种针在火焰上进行灭菌操作,取含菌种的培养皿,在火图细菌的划线分离示意图焰上方注意：不能离火焰太近打开培养皿盖,先拿接种针在上盖处划线以降温,然后用接种针轻挑所选菌落一到两下,将平皿盖上放好,再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作;操作完毕后对接种针进行灭菌操作,完成后在火焰上方打开平皿盖,将接种针冷却后从1区引线到2区,再如图所示划线,划完后引线到3区,同上进行划线,划线完毕后盖盖平放；b)纯种保藏：再配制一份普通细菌培养基,分装试管后灭菌,制得斜面,将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定;3.细菌的基本形态及运动性鉴定a)纯种果胶酶水解能力的测定配制果胶酶筛选培养基,110度灭菌20-30分钟,冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记,将分离纯化的细菌点种于平板上注意：点种的量不宜过多,以3～4个为宜,在30℃培养箱中培养1～2天,取培养后的平皿用％的刚果红染色15-20min后,倒掉刚果红,用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈,测量并记录透明圈的大小b)简单染色步骤i.涂片取一块载玻片,在上边用胶头滴管加半滴无菌水,用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹,待看到微弱的浑浊即可；注意取菌不要太多ii.干燥与固定涂菌面朝上,通过火焰以干燥并固定菌物,固定过程应使载玻片通过火焰2-3次,注意温度的控制,过热的温度会将细菌杀死,温度以手背感觉微微发烫为标准；iii.染色将载玻片平放于载波片支架上,滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可,染色iv.水洗倾去染液,将载玻片的涂菌面朝下,自来水冲洗,水流不宜太急、太大,至洗出水无色为止；v.干燥用吸水纸吸去多余水分后自然干燥；vi.镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察,先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油,用油镜观察细菌的形态;c)革兰氏染色步骤i.涂片先在载玻片一侧用记号笔标记间隔的四个区域,在另一侧四个区域的位置分别滴加半滴无菌水;分别取四种活跃生长期菌种大肠杆菌,金黄色葡萄球菌,枯草杆菌和一种自选菌按常规方法涂片不宜过厚,用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对四种菌进行干燥和固定;ii.初染滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位,染色后水洗；iii.媒染先用卢戈氏碘液冲去残留水迹,再用碘液覆盖1min后水洗；iv.脱色先用乙醇冲去水迹,然后用95%乙醇覆盖脱去色素,脱色约30s,立即用水冲洗；v.复染先用番红洗去水迹,然后滴加番红复染后水洗；vi.镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察,先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏油,用油镜观察细菌;分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照,来判断枯草杆菌以及另一种自选菌的染色结果;d)芽孢染色步骤i.涂片,加热干燥及固定在洁净盖玻片接近中部两处分别滴一滴无菌水,分别接种枯草芽孢杆菌及梭状芽孢杆菌;然后按照常规方法加热干燥及固定；ii.孔雀绿加热染色用木夹夹住载玻片,向载玻片上滴加5%孔雀绿水溶液使之完全覆盖涂菌部位,然后在酒精灯上微微加热孔雀绿着色能力强,加热可使较难染色的芽孢染成绿色,且再难洗脱至染液冒蒸汽开始计时并维持5min,注意加热时应以有蒸汽微微冒出为宜,过热或加热不足均会影响观察效果,且加热时在载玻片上随时补加染液,切勿让涂片干涸；iii.水洗水洗一定要等载玻片冷却后进行,否则可能导致载玻片的破裂;具体水洗按常规方法进行；iv.复染用%番红水溶液复染2min；v.水洗并干燥按常规方法水洗后自然干燥；vi.镜检先在低倍镜下寻找视野范围,然后换用高倍镜调焦,最后加香柏油在油镜下仔细寻找两种细菌以及其周围或内部染成绿色的芽孢;e)半固体穿刺法观察细菌运动性i.配制培养基配制半固体牛肉膏蛋白胨培养基,分装于4支试管内,110度灭菌20-30分钟,正立于烧杯中冷却至室温；ii.在无菌操作台上右手握接种针,以针挑取菌苔.垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近但勿触及试管底,然后循原路退出;如图所示：iii.接种完成后在30℃条件下培养两天观察并判断其运动性;4.细菌的生理生化试验a)淀粉水解试验i.培养基制备配制淀粉培养基,灭菌后将冷却至50℃左右,无菌操作制成平板；ii.接种用记号笔将平板划成四部分,将所鉴定的菌种在不同位置点种;注：由于四种菌对淀粉的水解程度不同,为防止由于接种量过大导致四种菌对应区域水解部位发生重叠,宜采用点种的方式,如下图;接种完成后贴好标签；iii.培养将上述已接种的平板倒置于30℃培养箱中培养48小时;b)葡萄糖发酵试验i.培养基配制将配制好的葡萄糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名;取盛有葡萄糖发酵培养基的试管2支,接种鉴定菌,另一支作为对照;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;c)乳糖发酵试验i.培养基配制将配制好的乳糖发酵培养基分装于试管中同时向每只试管中加入一支德汉氏小管后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上分别标明发酵培养基名称和所接种的菌名;取盛有乳糖发酵培养基的试管2支,接种鉴定菌,另一支作为对照;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;d)吲哚试验i.培养基的配制将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上标明所接种的菌名;取盛有蛋白胨水培养基的试管2支,接种鉴定的菌种;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;e)甲基红试验i.培养基的配制将配制好的蛋白胨水培养基分装于试管中后放入灭菌锅中进行湿热灭菌,冷却至室温;ii.接种用记号笔在各试管上标明所接种的菌名;取盛有蛋白胨水培养基的试管2支,接种鉴定的菌种;iii.培养将上述已接种的试管置于30℃培养箱中培养48小时;5.土壤中分解果胶细菌种类和数目的测定及纯化细菌菌属鉴定取培养三天的菌液1000倍稀释涂布平板3个,观察不同形态菌落的数目以及总菌落数,并记录,求3个平板的总菌数平均值来计算1g土壤中分解果胶的细菌数目;根据以上细菌的形态,革兰氏染色结果,芽孢的位置,运动性以及生理生化试验结果查看伯杰手册对纯种细菌做出鉴定;B.霉菌的筛选,分离纯化及鉴定1.霉菌的筛选a)涂布配制几丁质酶筛选培养基,110度灭菌20-30分钟,冷却至不烫手,无菌操作加链霉素1mL/1000mL倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记,分别写上100、10-2两种稀释度字样,每稀释度标记三皿,然后用无菌吸管分别由100、10-2两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置,每皿准确放入,用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀,其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动,使之均匀分布,然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动,平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；b)培养将平板倒置于30℃恒温箱中培养2-3天；2.霉菌的分离纯化a)划线分离：制备几丁质酶划线培养基,灭菌后倒平板,挑取长出的菌种,第一次划线分离培养2-3天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离,划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域,然后将接种针在火焰上进行灭菌操作,取含菌种的培养皿,在火焰上方注意：不能离火焰太近打开培养皿盖,先拿接种针在上盖处划线以图霉菌的划线分离示意图降温,然后用接种针轻挑所选菌落一到两下,将平皿盖上放好,再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作;操作完毕后对接种针进行灭菌操作,完成后在火焰上方打开平皿盖,将接种针冷却后从1区引线到2区,再如图所示划线,划完后引线到3区,同上进行划线,划线完毕后盖盖平放；b)再配制一份PDA培养基,分装试管后灭菌,制得斜面,将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定;3.小室培养法鉴定霉菌a)灭菌准备制作4个平皿,在每个平皿皿底铺一张略小于皿底的圆滤纸片,再放一U形玻棒,其上放一洁净载玻片和四块盖玻片,盖上皿盖、再与1个空平皿一起用牛皮纸包好；在100mL锥形瓶中用甘油配制20%的甘油,加塞包好；最后取10mL 移液管两支用牛皮纸包好;b)灭菌将上述用牛皮纸包好的仪器与试剂连同配好的PDA培养基一并放入灭菌锅中110℃灭菌30min由于培养基中有葡萄糖,为防止由于高温而使糖发生糊化而变质,灭菌温度不宜过高;c)制作琼脂薄片在无菌操作台上分别取已灭菌并溶化冷却至约50℃的马铃薯琼脂培养基6～7mL 注入两个灭菌空平皿中,使之凝固成薄层;在两个凝固后的平板背部用记号笔画下约1～×1～的方格,通过无菌操作,用解剖刀沿画下的方格线将其切成方形的琼脂块;注：解剖刀使用前应先在酒精中浸泡,然后在酒精灯上灼烧,冷却后再进行切割操作d)接种在无菌操作台上,先用镊子将载玻片放于U型玻璃管上,然后用解剖刀取一小块儿琼脂块,置于载玻片上注意：镊子与解剖刀每次使用前都应先在酒精中浸泡,灼烧冷却后再进行下一步的操作,用接种环分别从斜面培养物上挑取很少量的鉴定菌的孢子,分别接种于培养小室中琼脂块的边缘上,用无菌镊子将盖玻片覆盖在琼脂块上;最后用移液管在培养小室中的圆滤纸上加3ml 灭菌的20 %的甘油用于保持平皿内的湿度 ,盖上皿盖并贴标签,每一种菌接种两个小室;e)恒温培养将接种后的平皿正置于28℃培养箱中恒温培养3～4天;f)镜检在显微镜下直接观察小室培养后的载玻片,用低倍镜即可较为清晰的观察到霉菌的菌丝体及孢子,根据真菌手册对所得的菌进行鉴定;实验结果A.细菌部分倍稀释平板的细菌种类和数目表错误!未定义书签。
土壤微生物的分离纯化与鉴定
土壤微生物的分离纯化与鉴定一、实验目的1、通过从土壤中分离纯化细菌，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的分离纯化方法和无菌操作技术。
8、根据菌落形态，染色结果，运动性以及生理生化试验鉴定未知细菌；小室培养法观察鉴定未知真菌。
2、复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。
4、巩固练习显微镜使用方法。
5、明确培养基的配制原理，复习配制培养基及消毒灭菌的一般原理和操作步骤。
6、学习利用选择培养基从土壤中分离能够产生特殊水解酶的细菌以及霉菌的方法；7、学习测定土壤中细菌数目，种类的方法；二、基本原理1、培养基的配制与灭菌培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。
在自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。
但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。
不同微生物对 pH 要求不一样，霉菌和酵母的培养基的 pH 一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的 pH 一般为中性或微碱性的 ( 嗜碱细菌和嗜酸细菌例外 )。
所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的 pH 调到合适的范围。
此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱度所带来不利的影响。
2、微生物的分离与纯化自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
土壤是微生物生活的大本营，可以从中分离到很多有价值的菌株。
本实验将采用平板划线分离法。
3、分离菌株的鉴定微生物的分类鉴定是微生物的重要内容，一般从菌落特征、细菌特点及生理生化、分子生物学等方面进行鉴定。
土壤中微生物的分离与纯化
实验五土壤中的四类微生物的分离与纯化（一）实验目的1.明确培养基的配制原理，并通过对微生物培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤2.掌握按照研究需要选取不同的环境以找到自己需要的目标菌株的基本方法，学习分离纯化微生物的基本操作技术。
进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法以及接种技术。
3.学习并掌握放线菌、霉菌、酵母菌形态结构的方法。
4．加深理解放线菌、霉菌、酵母菌形态结构特征（二）实验原理1.土壤中存在微生物土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离，纯化到许多有用的菌株。
土壤中含有多种多样的有机和无机营养物，所以被称为微生物生长和繁殖的天然培养基。
土壤的环境条件十分复杂多变，其中的微生物种类也极其丰富，1g干的农田土壤中含有几百万个细菌，数十万真菌孢子和数万个原生动物和藻类。
2.富集培养指从微生物混合群开始，对特定种的数量比例不断增高而引向纯培养的一种培养方法。
在适于目标微生物而不适于其他微生物生长的条件下继续培养，则目标微生物将成为优势种而得到纯培养。
3.微生物对营养物质的需求不同微生物需要各种各样的营养物质，其功能主要有：提供能量，提供合成原料，调节代谢活动进行，提供适宜代谢环境。
虽然微生物对各种营养物质需求不同，但是都离不开碳源，氮源，能源，生长因子，无机盐，水。
除水外，碳源所需的量最大，其次是氮源。
在自养微生物中，能源是日光能或还原态无机物，在异养微生物中，能源就是碳源。
在无机盐中，磷，硫需量稍大，钾，镁次之。
其他元素和生长因子的需要量一般很少。
4.微生物的生长速度不同一个微生物细胞在合适的外界环境条件下，会不断地吸收营养物质，并按其自身的代谢方式不断进行新陈代谢。
如果同化作用的速度超过异化作用，则其原生质的总量就不断增加，于是出现了个体细胞的生长。
在微生物的研究和应用中，只有群体的生长才有意义。
王--实验二 土壤中微生物的分离与纯化
王--实验二土壤中微生物的分离与纯化
土壤中是存在大量微生物的，包括细菌、真菌、放线菌等，在生态系统中起着重要作用。
微生物的分离与纯化是微生物学研究的重要方法之一，对于了解土壤微生物多样性、功能和应用具有重要意义。
本实验旨在通过土壤样品进行微生物分离和纯化，了解微生物分离技术和分离纯化菌株的方法。
一、实验方法
1.1 实验设备
实验室常用的分离纯化设备有平板计数器、减压灭菌器、烧杯、移液器、离心机等。
其中，平板计数器是精确测定细菌数量的仪器。
实验材料包括培养基、细菌液、土壤样品等。
1.3 分离纯化细菌的步骤
（1）将土壤样品放入离心管内。
（2）在土壤样品中加入生理盐水，摇晃离心管，使土壤样品和生理盐水充分混合。
（3）将混合物在烧杯内振荡。
（4）利用平板计数器精确测定细菌数量。
（5）从混合物中挑出单个菌落，进行菌株分离和纯化。
（6）将菌落移至培养基上，进行培养、观察和记录。
二、实验结果
通过本实验，我们共采集了5个不同土壤样品，进行菌落计数和菌株分离、纯化、培养等处理。
实验结果显示，不同土壤样品中微生物的数量和种类存在差异。
其中，含有腐殖质较多的土壤样品中微生物数量较多，且种类丰富。
2.2 结果分析
土壤微生物数量和种类的差异主要与土壤样品的营养含量及物理化学性质有关。
白灰土、黄土、红壤等含有较高营养含量和较优地理环境的土壤样品中微生物的数量和种类较多，而贫瘠荒芜的土壤样品中微生物数量和种类较少。
此外，氧分压、pH值、盐分等土壤环境因素的差异也会导致土壤中的微生物数量和种类存在差异。
土壤细菌的分离及纯化课件
生物塑料合成
02
土壤细菌可以用于合成生物塑料，如聚羟基脂肪酸酯（PHA）
。
蛋白质和酶的生产
03
土壤细菌可以用于生产各种酶和蛋白质，广泛应用于食品、医
药、化工等领域。
05 土壤细菌的研究前景
土壤细菌的基因组学研究
土壤细菌基因组学研究有助于揭示土壤细菌的 多样性和进化机制，为土壤生态系统的功能和 稳定性提供基础数据。
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稀释涂布平板法
将土壤样品稀释后涂布在 培养基平板上，通过培养 获得单菌落。
划线分离法
将土壤样品划线接种在培 养基平板上，通过培养获 得单菌落。
富集培养法
通过选择特定的培养基和 培养条件，使目标细菌大 量繁殖，再从中分离。
分离步骤
2. 制备培养基
根据分离目标选择适合的培养 基配方，按照要求制备培养基 。
通过研究土壤细菌的代谢途径，可以发现新的生物合 成途径和酶，为生物工程和生物制药等领域提供新的
资源和工具。
代谢途径研究还可以帮助了解土壤细菌在碳循环、氮 循环和硫循环等过程中的作用，为环境保护和农业可
持续发展提供理论支持。
土壤细菌的生态学研究
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土壤细菌的生态学研究有助于深入了解土壤生态 系统的结构和功能，以及土壤细菌与其他微生物 和动植物之间的相互作用。
纯化步骤
样品采集
采集具有代表性的土 壤样品，保证样品无 污染。
样品处理
将土壤样品进行破碎 、研磨、稀释等处理 ，使细菌充分释放。
分离纯化
根据纯化方法的不同 ，在固体或液体培养 基上进行细菌的分离 纯化。
菌落观察
观察菌落的形态、颜 色、大小等特征，初 步判断细菌的种类。
土壤中微生物的分离与纯化
微生物学实验报告实验名称：土壤中微生物的分离与纯化课程名称环境微生物学实验学院环境科学与工程学院专业班级2011级环境科学（1）班学号 3111007364姓名刘迪鸿联系方式2013年 12 月 10 日实验报告土壤中微生物的分离与纯化刘迪鸿（广东工业大学11级环科（1)班）摘要:各种微生物生长所需条件存在差异，根据需要配制不同的培养基可以得到只含目标菌株的纯培养.关键词:选择培养基，分离，纯化一、实验目的与要求1.明确培养基的配制原理，并通过对微生物培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。
2.掌握根据需要选取不同的环境以找到目标菌株的基本方法，学习分离纯化微生物的基本操作技术，进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术，掌握微生物培养方法以及接种方法。
二、实验方案1.实验原理培养基是人工的将多种物质按各种微生物生长的需要配制而成的一种混合营养基质，用以培养或分离各种微生物，因此,培养基质应当有微生物所能利用的营养成分（包括碳源，氮源，能源，无机盐,生长因素。
）和水，根据微生物的种类和实验目的地不同,培养基也有不同的种类和配置。
在土壤，水，空气及动、植物体中,不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起,当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分理它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。
为了获得某种微生物的纯培养,一般是根据该微生物对营养,酸碱度，氧等条件的要求不同,而供给它适宜的培养条件,或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离纯化微生物,直至得到纯菌株。
2.实验材料1)培养基与试剂牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏2.0g，蛋白胨4。
0g,氢氧化钠2.0g，琼脂6~8g,水400mL。
高氏一号培养基配方：可溶性淀粉4g，硝酸钾0.4g，磷酸氢二钾0。
土壤中微生物的分离与纯化实验报告
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以下是一篇关于土壤中微生物分离与纯化实验报告的示例文章，按照清晰的标题和不同级别的小节编写：实验报告：土壤中微生物的分离与纯化。
土壤中放线菌的分离和纯化实验(精选5篇)精选全文完整版
可编辑修改精选全文完整版土壤中放线菌的分离和纯化实验（精选5篇）第一篇：土壤中放线菌的分离和纯化实验土壤中放线菌的分离和纯化实验一、实验目的1、制作MS培养基的方法，掌握母液的保存方法。
2、掌握培养基的灭菌方法。
掌握外植体的消毒和超净工作台的使用。
4、掌握放线菌的分离纯化及染色的基本流程；5、掌握高氏一号培养基的配制方法；6、复习分离纯化放线菌的基本操作技术、培养方学会使用高压蒸汽灭菌锅。
7、培养微生物实验的设计思路和动手能力。
二、实验材料高压蒸汽锅、培养瓶、石斛的愈伤组织、超净工作台，酒精灯、酒精棉球、镊子、电子天平、称量纸、烧杯、量筒、显微镜、三角锥形瓶、无菌培养皿、接种环、酒精灯、分析天平；接种环、载玻片、盖玻片、玻璃珠、移液枪、剪刀三、实验原理植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）第 1 页或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科。
四、实验步骤1、配制MS培养基8L，称取马铃薯1600g、香蕉400g、蔗糖240g、活性炭8半勺、琼脂80g、配制母液。
2、配制培养液时应注意：①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；为防止母液被微生物污染，有机母液放在冰箱里4℃保存；②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。
溶化琼脂用粗天平分别称取琼脂9 g、蔗糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。
实验一土壤中微生物的分离纯化
目录
• 引言 • 土壤样品采集与处理 • 微生物分离纯化方法 • 微生物培养条件与培养基选择 • 微生物鉴定与结果分析 • 实验注意事项与误差分析
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引言
实验目的
分离土壤中的微生物
鉴定微生物
通过特定的培养条件，将土壤中的不 同种类微生物分离开来。
对分离纯化的微生物进行形态学、生 理生化特性等方面的鉴定。
废弃物处理
将实验废弃物分类收集，妥善处理，避免对 环境造成污染。
常见误差来源及减小误差方法
样品采集误差
试剂误差
确保采样工具干净，避免交叉污染；采样 点要具有代表性，避免偶然性误差。
使用优质试剂，确保试剂纯度和浓度准确 ；注意试剂保存条件和使用期限。
操作误差
设备误差
提高操作技能，减少操作失误；保持实验 环境稳定，避免外部因素干扰。
促进目标微生物的分离和纯化。
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鉴别培养基
在基础培养基中加入某种试剂或化学物质，依据微生物代谢产生的某种
物质与特定试剂反应，产生明显的颜色变化或沉淀，从而鉴别不同种类
的微生物。
培养条件设置（温度、pH等）
温度
不同微生物对温度的需求不同，一般分为低温、中温和高温 微生物。在实验中，需根据目标微生物的生长温度要求，设 置相应的培养温度。
采样工具及容器准备
采样工具
使用无菌的铲子、勺子或土壤钻 等工具进行采样，避免交叉污染 。
容器准备
选择无菌的塑料袋、玻璃瓶或塑 料瓶等容器，确保容器干净、干 燥、密封性好。
采样方法及注意事项
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去除表面杂质
去除土壤表面的植物残渣、石 块等杂质。
实验十二土壤中微生物的分离纯化
（三）平板菌落计数法的原理
将待测菌液经适当稀释，涂布在平板上，经过培养后在平板上形成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据稀释倍数和取样量计算出样品中细胞密度（一般选择每个平板上长有50-200个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较为合适）。
由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，平板上形成的每个菌落不一定是单个细胞生长繁殖而成，有的可能来自两个或多个细胞。因此，平板菌落记数的结果往往比样品中实际细胞数低，这就是现在使用菌落形成单位取代以前用绝对菌落数来表示样品活菌含量的原因。
实验十二 土壤中微生物的分离及纯化 （设计性实验）
此处添加副标题内容
掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；
学习平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能。
初步观察来自土壤中的三大类群微生物的菌落形态特征；
一、目的要求
二、基本原理
土壤是微生物生存的大本营，所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的，原因是什么？ 由于土壤具备了各种微生物生长发育所需要的营养、水分、空气、酸碱度、渗透压和温度等条件，所以成了微生物生活的良好环境。可以说，土壤是微生物的“天然培养基”，也是它们的“大本营”因此，土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，人们可与从中分离、纯化获得许多有价值的菌株。
从微生物群体中经分离、生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征等综合考虑。有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征（产酸产气情况、染色情况、营养要求、氧气需求、酸碱度、渗透压和温度等）鉴定方能得到。从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
从土壤中分离纯化微生物
培养 实验步骤——从土壤中分离微生物
若成片菌苔大小不到培养皿的一半,其余一半分布均匀,将此一半计数*2;
用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离,纯化;
将牛肉蛋白胨培养基平板倒置于37 C温箱 将牛肉蛋白胨培养基平板倒置于370C温箱中培养24h；
实验步骤——周围环境中微生物的观察
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中培养24h；统计所长出的菌落数； 然后同样方法，配置成稀释度为10-4，10-5，10-6的土壤溶液；
用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离,纯化;
实验仪器,材料和用具
实验材料:
菌源:土样10g;
培养基:
牛肉膏蛋白胨培养基;
实验仪器:
取液器(5000 ul, 1000ul, 200ul 个一支); 培养箱,摇床
实验仪器,材料和用具
实验试剂:
1N NaOH, 1N HCl, 0.9% 无菌生理盐水;
1N NaOH, 1N HCl, 有较大片菌苔生长时ห้องสมุดไป่ตู้弃用,以无片菌苔生长的平皿计数;
挑菌（不做） 然后同样方法，配置成稀释度为10-4，10-5，10-6的土壤溶液；
选择平均菌落数在30~300间的平板: 选择平均菌落数在30~300间的平板:
取液器(5000 ul, 1000ul, 200ul 个一支);
只有一个符合此范围时,以该平均菌落数乘稀 释倍数即为该样品中微生物总数;
有两个在30~300间时,按两者菌落总数比值决 定:比值小于2,取平均;比值大于2,取较少的菌落 总数;
实验步骤——从土壤中分离微生物
菌落计数
所有菌落数均大于300,取稀释度最高的平 均菌落数乘稀释倍数;
土壤中细菌分离纯化和鉴定
土壤中细菌分离、纯化和鉴定摘要：在自然条件下，微生物常常在各种生态系统中群居杂聚。
为了研究某种微生物的特性，或者大量培养和利用某一种微生物，必须事先从有关的生态环境中分离出所需的菌株，获得纯培养。
获得纯培养的方法称为微生物的纯种分离法。
这一过程称为微生物的分离纯化。
本文将提取泥土中所包含的微生物，并且分离、纯化，最后对其微生物种类进行鉴定。
关键字：泥土细菌分离纯化鉴定1、实验材料：分离细菌的材料：样品：新鲜土样培养基：灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、淀粉琼脂培养基、马铃薯蔗糖培养基（10mL）。
无菌水：带有玻璃珠装有45mL无菌水的三角瓶、装有9mL无菌水的试管。
其他：无菌培养皿、无菌吸管、无菌三角玻棒、台天平、记号笔、接种环、酒精灯、火柴、标签纸、胶水、水泡锅。
试剂：5000U/mL链霉素液，%重铬酸钾液。
细菌纯化鉴定材料:染色剂：草酸铵结晶紫染色液、路哥氏碘液、95%酒精、番红染色液。
培养基：淀粉培养基、石蕊牛乳培养基、真菌培养基、试管斜面。
试剂：碘液。
其它：试管、三角瓶、移液管、接种针、接种环、培养皿。
2、实验步骤制备土壤稀释液：1、称取土壤5g，放入45mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释10－1的土壤悬液。
2、另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。
取已稀释成10－1的土壤液，振荡后静止，用无菌吸管吸取1mL土壤悬液加入10－2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成10－2土壤稀释液。
同法依次连续稀释至10－4、10－5、10－6土壤稀释液。
平板划线法：1、取已熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，倒入平皿，制成平板。
2、凝固后，用接种环取相应的菌液一环（10－5或10－6）在平板上划线。
3、（1）连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。
完毕后，倒置于28～300C温室培养。
（2）分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液1环，先在培养基的一边作第一次平行划线3—4条，再转动培养皿约600C角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线会，同法依次作第三次和第四次划线。
土壤细菌的分离及纯化
第三部分
分离菌株的鉴定
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一、目的要求
掌握常用的微生物鉴定方法。 掌握生理生化试验的原理与方法。 复习以前学过的各种染色方法
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二、实验原理
1、微生物的分类鉴定是微生物的重要内容，一般从菌落特征、 细菌特点及生理生化、分子生物学等方面进行鉴定。
2、各种细菌在代谢类型上表现了很大的差异。不同的细菌分 解大分子碳水化合物、蛋白质和脂肪的能力不同，所能发 酵的类型和最终产物也不一样。不同细菌对营养的要求不 同也说明了它们有不同的合成能力。所有这些都反映了它 们是有不同的酶系统。 细菌的这种生化反应的多样性在自然界产生了两种结 果：第一、使自然界所有的有机分子都有可能得到分解； 第二、使不同细菌之间有了互相作用和互相依赖的基础， 例如，一种微生物能利用另一种微生物所分解的产物。另 一方面，微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据 之一,细菌的生化反应的多样性也被人们作为细菌的鉴定和 分类方法来利用，可以鉴别一些在形态和其它方面不易区 别的微生物。
常用的接种方法： 划线接种 点接种 穿刺接种 涂布接种 液体接种 注射接种
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四、操作步骤（6）
斜面接种时的无菌操作 (1)接种灭菌 (2)开启棉塞 (3)管口灭菌 (4)挑起菌苔 (5)接种 (6)塞）平板划线法
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四、操作步骤（8）平板划线法
2.学习几种常用培养基的配制、分装和灭 菌的操作方法.
3.进一步熟练掌握高压蒸汽灭菌锅的使用 方法。
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二、实验原理（1）
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基 质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在 自然界中，微生物种类繁多，营养类型多样，加之实验和研究的目 的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一 般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。不同微 生物对 pH 要求不一样，霉菌和酵母的培养基的 pH 一般是偏酸性的， 而细菌和放线菌的培养基的 pH 一般为中性或微碱性的 ( 嗜碱细菌和 嗜酸细菌例外 ) 。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将 培养基的 pH 调到合适的范围。