汉防己甲素的抗肿瘤分化治疗研究

汉防己甲素的抗肿瘤分化治疗研究

肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下,细胞发生基因突变导致细胞增殖与分化异常而形成的疾病。随着逐渐认识到异常的细胞分化在恶性肿瘤发生发展和治疗中的意义,肿瘤的分化治疗成为当今肿瘤治疗研究的热点之一。

诱导肿瘤细胞分化一般多用于白血病的治疗,经分化诱导剂诱导,肿瘤细胞在形态上以及生物化学方面的诸多标志均向正常细胞方向发生分化。最新的肿瘤分化治疗策略还可用于靶向促进实体恶性肿瘤干细胞的分化,使肿瘤干细胞失去干细胞特性,分化为上皮细胞表型的普通肿瘤细胞,从而克服在肿瘤治疗过程中因肿瘤干细胞产生的强耐药性,高转移侵袭性以及高复发性。

与直接快速地杀死肿瘤细胞的传统治疗方法相比,分化治疗有低毒性的优势,使肿瘤细胞较温和地发生分化直至死亡,对机体正常细胞影响较小。在非实体瘤(白血病)中,急性巨核细胞白血病(Acutemegakaryoblasticleukemia,AMKL)是巨核系造血细胞发育过程中被阻滞在某一分化阶段并进一步发生异常增殖所致的一种罕见的急性髓系白血病亚型。

因为缺乏特异性的药物,临床治疗AMKL有很大的挑战。AMKL患者白血病细胞的特点是恶性增殖并且不能发生终末分化成成熟的巨核细胞。

因此,研究者们希望开发出能促进AMKL细胞向巨核细胞发生终端分化而退出恶性增殖的药物来作为治疗AMKL的有效策略。在实体瘤中,乳腺癌一直以来是女性发病率最高的恶性肿瘤,严重威胁着全世界女性的健康甚至生命安全。

尽管目前临床上对乳腺癌的治疗较为成熟,但乳腺癌转移率和复发率一直维持在较高水平。有研究者在乳腺肿瘤组织中分离出了一类极少数具备多向分化潜能、无限自我更新能力和高致瘤性的细胞亚群,即乳腺癌干细胞(Breast cancer

stem cells,BCSCs),被认为与乳腺癌复发、侵袭转移及耐放化疗特性等密切相关。

因此,研究者们致力于发展新的乳腺癌治疗策略,能够靶向/选择性杀死乳腺癌干细胞或者促使乳腺癌干细胞失去干细胞特性,分化为普通肿瘤细胞,从而克

服在乳腺癌治疗过程中因肿瘤干细胞产生的强耐药性,高转移侵袭性以及高复发性。越来越多的研究表明,中药或者中药有效成分除了对肿瘤细胞有积极治疗作用之外,还有效缓解化疗的毒副作用、增强化疗效果和提高机体免疫等优势,能提高患者的生存质量。

汉防己甲素是一种双苄基异喹啉类生物碱,提取自防己科植物粉防己(Stephania tetrandra S Moore)的块根。近年来,许多研究显示汉防己甲素具有较好的抗肿瘤活性。

本论文分别选取了白血病中的AMKL和实体瘤中的乳腺癌作为研究对象,初

步探究了汉防己甲素的抗肿瘤分化治疗作用。通过时间梯度和浓度梯度的汉防己甲素处理,我们发现高浓度汉防己甲素能诱导白血病细胞发生凋亡,而低浓度(2 μM)汉防己甲素能抑制白血病细胞增殖,诱导细胞自噬和促进巨核细胞分化。

当用自噬抑制剂3-MA抑制汉防己甲素诱导的细胞自噬或在细胞中敲除自噬相关基因ATG7使细胞不能发生自噬,汉防己甲素促进巨核细胞分化作用随之减

弱或消失,说明汉防己甲素促进巨核细胞分化依赖于其诱导的细胞自噬。进一步机制研究发现,汉防己甲素能显著激活白血病细胞内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,通过ROS清除剂NAC清除积累的ROS后,可消除汉防己甲素对白血病细胞的自噬激活和巨核细胞分化诱导,表明ROS分子参与汉防己甲素诱导细胞自噬和分化。

此外,汉防己甲素可以激活Notch1信号,加入Notch1抑制剂DAPT或者使用

shRNA沉默Notch1能显著抑制汉防己甲素诱导的自噬和分化。同时,我们发现在汉防己激素处理前期,p-Akt水平上调,加入p-Akt抑制剂wortmannin,或者在细胞中过表达持续激活型Akt质粒能分别抑制或增强汉防己甲素诱导的自噬和巨核细胞分化。

这些结果表明Notch1和Akt信号的激活也参与了汉防己甲素的自噬诱导和分化促进作用。更进一步的研究表明,汉防己甲素是通过ROS/Notch1/Akt信号级联反应来调控细胞自噬诱导从而促进巨核细胞分化。

值得注意的是,汉防己甲素不影响正常小鼠胎肝造血干细胞的增殖且不能诱导其巨核细胞分化尽管也有自噬诱导作用,说明汉防己甲素治疗AMKL有特异性机制。最后,与体外实验结果一致,我们在K562细胞裸鼠皮下移植瘤模型和6133细胞小鼠骨髓移植AMKL模型中,均证实汉防己甲素有抗白血病作用,且能显著延长6133细胞AMKL患病小鼠的生存时间。

此外,我们发现汉防己甲素在不直接杀死乳腺癌细胞的浓度下(2 μM),能减少乳腺癌干细胞比例和抑制细胞迁移侵袭,同时上调上皮细胞标记蛋白并下调间质细胞标记蛋白,说明汉防己甲素能抑制乳腺癌干细胞的干性,分化为具有上皮细胞性质的普通癌细胞。低水平的ROS对肿瘤干细胞有稳定干性的作用,我们发现汉防己甲素能下调超氧化物歧化酶1(Superoxidedismutase1.SOD1)和过氧化氢酶(Catalase)的表达量,同时激活乳腺癌细胞中的ROS水平。

进一步用ROS清除剂NAC或者外源性加入SOD1或Catalase清除积累的ROS 后,可拯救汉防己甲素对乳腺癌细胞EMT和干性的抑制。作为公认的钙离子(Ca2+)拮抗剂,我们还发现汉防己甲素能下调线粒体单向钙离子转运蛋白(Mitochondrialcalciumuniporter,MCU)的表达,而加入Ca2+激动剂离子霉素

(Ionomycin)或过表达MCU也能显著消除汉防己甲素对乳腺癌细胞EMT和干性的抑制。

以上结果说明激活ROS分子和下调线粒体Ca2+信号参与了汉防己甲素抑制乳腺癌细胞EMT和干细胞特性。总之,本论文通过选取白血病中的急性巨核细胞白血病和实体瘤中的乳腺癌作为研究对象,探究了汉防己甲素的抗肿瘤分化治疗作用。

结果发现汉防己甲素有促进巨核细胞分化的抗AMKL作用和靶向诱导乳腺癌干细胞分化的抗乳腺癌作用,并且我们对其调控机制做了初步探讨,这些结果表明汉防己甲素有抗肿瘤分化治疗潜力,为汉防己甲素临床治疗白血病和实体瘤提供了新的理论依据。