PCR反应体系文章中浓度换算后工作液量
聚合酶链式反应(PCR)实验方法
聚合酶链式反应（PCR）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。
典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA 得以迅速扩增。
其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。
因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。
它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。
通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：(1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2) 由少量mRNA生成cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以进行序列测定；(5) 突变的分析；(6) 染色体步移；(7) RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。
一、试剂准备1. DNA模版2．对应目的基因的特异引物3．10×PCR Buffer4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM 5．Taq酶二、操作步骤1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer 5 μldNTP mix （2mM） 4 μl引物1（10pM） 2 μl引物2（10pM） 2 μlTaq酶（2U/μl） 1 μlDNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl加ddH2O至50 μl视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
生物化学与分子生物学实验：实验十 聚合酶链式反应(PCR)及酶切鉴定转化产物
2.9 变性温度和时间
模板DNA充分变性是PCR顺利进行的前提。
在PCR扩增开始的第一次变性时， 应给予足够的时间 和温度，使基因组DNA充分变性。
对于扩增哺乳动物基因组中单拷贝序列，模板DNA的 加入量一般为0.2-2μg。
对于质粒DNA模板只需要20ng。模板量过多，会增加 非特异性扩增机会。
2.7 Mg2+浓度：
Mg2+是维持Taq DNA聚合酶活性所必需的，还影响 DNA的Tm值、产物的特异性及引物二聚体的形成
Mg2+浓度过低时，酶活性显著降低，使产量降低； 过高时，易生成非特异性扩增产物。
产量降低，过高则导致非特异性扩增。
2.5 耐热DNA聚合酶
通常Taq DNA聚合酶用量为0.5-5U/100μl，酶量过
大会导致非特异产物的增加；
传统使用的Taq DNA聚合酶的一个致命缺点是不具
备 3′→5′校正外切酶活性，错配率高。
大约每聚合9000个核苷酸发生一次错误掺入，经过 约 20 个 循 环 后 ， 扩 增 产 物 中 随 机 突 变 率 大 致 为 1/400-1/900，
目前，限制性内切酶被广泛运用于基因分子克隆技术 中，是体外剪切DNA 片段的主要工具。
由于外源DNA 片段插入质粒中，是在两个限制性内切 酶酶切位点中进行的，因此，可以使用单酶切或双酶 切手段对转化筛选得到的重组子进行鉴定。
三、实验材料
微量移液器，硅烷化的PCR管，PCR仪，琼脂 糖凝胶电泳所需设备，台式离心机，凝胶 成像仪，制冰机以及塑料离心管、枪头等。
Rt-PCR实验步骤和反应体系优化
RT-PCR实验步骤一、实验器具与材料：1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl2、吸头：1ml、200μl、20μl3、匀浆管：5ml4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇）7、量筒：50ml、250ml、500ml8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml9、试管架：5ml、1.5ml、20μl10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水11、铝制饭盒：4个12、塑料小饭盒：1个13、大瓷缸：2个14、锡泊纸：一卷15、卷纸：2卷16、三角烧瓶：带盖，稍大二、实验器具的处理与准备1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等）先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管）2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC）三、试剂配制：1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml 容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇：用无水乙醇DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压）3、异丙醇：放入棕色瓶中4、氯仿：放入棕色瓶中5、琼脂糖四、几种缓冲液的配制：1、电泳缓冲液：Tris 54g硼酸27.5g0.5M EDTA 20ml？pH8.0蒸溜水1000ml5×TBE （贮存液）再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液450ml水--→500ml工作缓冲液2、上样缓冲液：0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青FF30%甘油6×缓冲液，4℃保存五、琼脂糖凝胶的配制：1、1.0%：1.0g琼脂糖100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳。
PCR反应体系与反应条件
PCR反应体系与反应条件--------------------------------------------------------------------------------标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA 0.1～2ugTaq DNA聚合酶 2.5uMg2+ 1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。
A TGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。
酶及其浓度目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。
PCR扩增反应的基本操作及理论知识
PCR扩增反应的基本操作及理论知识第一节移液器的使用一、移液器的工作原理移液器的工作原理是活塞通过弹簧的伸缩运动来实现吸液和放液。
在活塞推动下，排出部分空气，利用大气压吸入液体，再由活塞推动空气排出液体。
使用移液器时，配合弹簧的伸缩性特点来操作，可以很好地控制移液的速度和力度。
二、移液器的操作使用1.移液器规范操作步骤第一步设定移液体积从大体积调节至小体积时，为正常调节方法，逆时针旋转刻度即可，从小体积调节至大体积时，可先顺时针调至超过设定体积的刻度，再回调至设定体积，可保证最佳的精确度。
（见图1）第二步装配移液器吸头：将移液器端垂直插入吸头，向右微微转动（视具体移液器而定，e ppendorf可以左右微微转动），上紧即可；特别提示：用移液器反复撞击吸头来上紧的方法是非常不可取的，长期这样操作，会导致移液器中的零部件因强烈撞击而松散，甚至会导致调节刻度的旋钮卡住。
（见图 2）第三步吸液和放液吸液↓吸头尖端需浸入液面3 mm 以下↓慢吸慢放，控制好弹簧的伸缩速度↓放液时吸头尖端靠在容器内壁2.移液小技巧●预润湿吸液粘稠液体可以通过吸头预润湿的方式来达到精确移液，先吸入样液，打出，吸头内壁会吸附一层液体，使表面吸附达到饱和，然后再吸入样液，最后打出液体的体积会很精确。
●正向吸液与反向吸液正向吸液是指正常的吸液方式（见图 4），操作时吸液可将按钮按到第一档吸液，释放按钮。
放液时先按下第一档，打出大部分液体，再按下第二档，将余液排出。
反向吸液（见图5）是指吸液时将按钮直接按到第二档再释放，这样会多吸入一些液体，打出液体时只要按到第一档即可。
多吸入的液体可以补偿吸头内部的表面吸附，反向吸液一般与预润湿吸液方式结合使用，适用于粘稠液体和易挥发液体。
3.错误的操作方式错误：装配吸头时用移液器反复撞击吸头，以上紧正确：插入吸头，左右轻转旋转上紧吸头错误：吸头与移液器不匹配，影响气密性正确：选用与移液器匹配的，有质量保证的吸头错误：吸液时，移液器倾斜吸液正确：垂直吸液错误：吸头内含有未打出的液体时，移液器平置于桌面正确：将移液器垂直挂在移液器支架上错误：用大量程的移液器移取小体积的液体正确：移液体积需保证在移液器所提供的量程范围之内才符合不准确度和不精确度的要求错误：吸取具有强挥发性的液体正确：如果一定要移取强挥发性的液体，应该在移液结束后立刻拆开移液器，让蒸汽挥发，同时，建议使用外置活塞式移液器。
PCR使用说明范文
PCR使用说明范文PCR（聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction）是一种体外复制DNA的技术，通过PCR可以扩增目标DNA片段，从而大量生产足够的DNA 用于分析和研究。
PCR技术的应用广泛，包括基因突变检测、基因表达分析、遗传病诊断、DNA指纹鉴定等。
本文将详细说明PCR的原理、步骤和注意事项。
1.PCR的原理：PCR技术是通过不断重复三个步骤：变性、退火和延伸，来扩增DNA 样本中的特定片段。
具体原理如下：(1)变性：将DNA样本加热到高温（通常为94-98摄氏度），使DNA 双链解开成两条单链。
这一步骤使得DNA的碱基对断裂。
(2)退火：将温度降低至50-65摄氏度，加入一对引物（引物是用于扩增目标序列的短DNA片段），引物与目标DNA序列互补结合，作为扩增的起始点。
(3)延伸：将温度升高到72摄氏度，加入DNA聚合酶，它通过引物在DNA模板上进行延伸合成新的DNA链。
此步骤是PCR的最后一步，产生双链DNA。
PCR通过循环重复以上三步骤来扩增DNA。
每个PCR循环都会使DNA 的数量增加一倍，反复数次即可扩增目标DNA到足够多的数量。
2.PCR的步骤：(1)样本制备：将待测DNA从细胞或组织中提取出来，去除杂质，并用缓冲液将其稀释。
(2)反应混合液的制备：将模板DNA和引物，以及PCR反应液的其他成分（如引物浓度，聚合酶等）混合至PCR反应管中。
(3)PCR的循环：将反应管放入PCR仪中，依次进行变性、退火和延伸的循环，循环的次数根据待扩增DNA的数量进行调整。
(4)结果分析：通过凝胶电泳或实时荧光PCR等方法，对PCR反应结果进行分析和检测。
3.PCR的注意事项：(1)实验操作层级：为了避免PCR反应的污染，应分配操作区域，将样本制备区与PCR循环区分开，使用专门用品和设备。
(2)对于反应混合液的制备，应避免引物和循环酶的污染，严格按照实验方案中的要求制备，并进行质量控制。
PCR常见问题分析及对策
PCR常见问题分析及对策PCR常见问题分析及对策(⽆扩增产物、⾮特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：⽆扩增产物现象：正对照有条带，⽽样品则⽆原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发⽣降解4.反应条件：退⽕温度太⾼，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使⽤试剂盒提取模板DNA或加⼤模板的⽤量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间⼆聚体和链内⼆级结构）或者换⼀管新引物4.降低退⽕温度、延长延伸时间问题2：⾮特异性扩增现象：条带与预计的⼤⼩不⼀致或者⾮特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过⾼3.酶量过多4.Mg2+浓度偏⾼5.退⽕温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使⽤巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离⼦浓度5.适当提⾼退⽕温度或使⽤⼆阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。
原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退⽕温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏⾼6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提⾼退⽕温度4.适量⽤酶5.适当降低dNTP和镁离⼦的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空⽩对照出现⽬的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应⼩⼼轻柔，防⽌将靶序列吸⼊加样枪内或溅出离⼼管外；2.除酶及不能耐⾼温的物质外，所有试剂或器材均应⾼压消毒。
所⽤离⼼管及加样枪头等均应⼀次性使⽤。
3.各种试剂最好先进⾏分装，然后低温贮存琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物⼀．原理DNA⽚断的分离与回收是基因⼯程操作中的⼀项重要技术，例如可收集特定酶切⽚断⽤于克隆或制备探针，回收PCR产物⽤于再次鉴定等。
回收实验中两个最重要的技术指标是纯度和回收率：前者未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；后者不理想时往往会⼤⼤增加前期的⼯作量。
荧光定量PCR
RNA提取和反转录1、RNA提取1)匀浆：取50-100 mg子宫和卵巢组织于液氮中研磨至粉状，加入1 mL的TRIzol溶液，转移至1.5 mL EP管中，颠倒混匀数下，冰上静置5 min，使组织充分裂解。
2)除去未裂解的组织：4℃，12000 g离心5 min，吸取上清至新的EP管中。
3)分离阶段：加入200 µL氯仿（1/5 TRIzol量），剧烈振荡15-30 s，冰上静置2-5 min；4℃，12000 g离心15 min。
4)RNA沉淀：将上层水相移入新的1.5 mL EP管中，加入500μL预冷的异丙醇（1/2 TRIzol量），充分混匀，-20℃静置20-30 min；4℃，12000 g离心10 min。
5)RNA洗涤：弃上清液保留沉淀，向沉淀中加入 1 mL现配的75%的乙醇（等TRIzol量），晃起沉淀，冰上静置5 min，4℃，12000 g离心10 min。
重复洗涤一次。
6)RNA溶解：小心倒掉上清，留取沉淀置超净工作台风干30 min，使mRNA呈半透明状（不能太干，否则很难溶解）；加入10-30μL的DEPC水吹打溶解RNA沉淀。
7)RNA电泳检测：提取的总RNA电泳后得到28S、18S、5.8S（5S）三条清晰的rRNA条带，28S与18S的带宽比为2:1，说明RNA没有降解。
8)RNA浓度和纯度检测：用微量分光光度计检测提取总RNA的浓度和纯度，OD260/OD280的值应在1.8~2.0之间，样品检验合格后，用DEPC水稀释至500 ng/μL，置于-80℃冰箱保存备用或直接进行反转录。
2、反转录按照Takara反转录试剂盒说明书(Cat#RR036A)操作，其反应体系(10μL)如下：5x PrimeScript RT Master Mix 2μLTotal RNA 1μLRNase Free dH2O 7μL反应程序：37℃ 15min, 85℃ 5sec, 4℃保存。
溶液浓度计算量化溶液中的物质含量
溶液浓度计算量化溶液中的物质含量溶液浓度是指溶液中溶质的质量或摩尔数与溶剂的质量或体积之比。
溶液浓度的计算对于化学实验、药学制剂等领域都非常重要，因为它可以帮助我们准确测量溶液中所含的物质含量。
本文将介绍几种常见的溶液浓度计算方法，以帮助读者更好地理解和计算溶液的物质含量。
一、质量浓度计算公式质量浓度是指单位体积溶液中溶质的质量，常以克/升（g/L）表示。
质量浓度的计算公式为：质量浓度（g/L）= 溶质质量（g）/ 溶剂体积（L）例如，在100毫升的溶剂中，溶解了5克的氯化钠。
那么，质量浓度可以通过以下计算得出：质量浓度（g/L）= 5g / 0.1L = 50g/L二、摩尔浓度计算公式摩尔浓度是指单位体积溶液中溶质的物质的摩尔数，常以摩尔/升（mol/L）表示。
摩尔浓度的计算公式为：摩尔浓度（mol/L）= 溶质物质的摩尔数 / 溶剂体积（L）例如，在500毫升的溶剂中，溶解了0.1摩尔的盐酸。
那么，摩尔浓度可以通过以下计算得出：摩尔浓度（mol/L）= 0.1mol / 0.5L = 0.2mol/L三、体积百分比浓度计算公式体积百分比浓度是指溶质的体积与溶液总体积的百分比，常以体积百分比（%）表示。
体积百分比浓度的计算公式为：体积百分比浓度（%）= 溶质体积（ml）/ 溶液总体积（ml） × 100%例如，在200毫升的溶液中，所含乙醇的体积为40毫升。
那么，体积百分比浓度可以通过以下计算得出：体积百分比浓度（%）= 40ml / 200ml × 100% = 20%四、密度计算浓度公式密度是指单位体积溶液的质量，常以克/毫升（g/mL）表示。
有时候，为了计算溶液中物质的含量，我们需要先计算溶液的密度。
密度计算浓度的公式为：密度（g/mL）= 溶质质量（g）/ 溶液体积（mL）例如，一个溶液的质量为50克，体积为40毫升。
那么，该溶液的密度可以通过以下计算得出：密度（g/mL）= 50g / 40mL = 1.25g/mL通过上述的几种溶液浓度计算方法，我们可以准确地计算出溶液中的物质含量。
RT-PCR的操作方法(终极版)
qRT-PCR实验步骤一、试剂准备1. 自备试剂：75%乙醇（以去RNAase H₂O配置）、氯仿、异丙醇、无RNAase H₂O。
2. 相关试剂盒（给出货号）等。
3. 无菌的epp管、PCR管、tip头等耗材。
二、注意事项1. 全称佩戴手套、口罩，穿白大褂。
女生需将长发扎起。
2. 自2.3至3.1步骤，必须使用无RNAase耗材（包括枪头和epp管）。
3. 所有试剂专用，不得与其他实验混用。
三、实验步骤1. 样品准备1.1. 动物组织：取新鲜或-70°C冻存组织，每30-50 mg 组织在液氮中充分研磨，也可以加入1 ml TotalRNAExtractor，用匀浆器匀浆处理。
样品体积一般不要超过TotalRNAExtractor 体积的10%。
1.2 单层培养细胞的收集：可直接在培养容器中裂解（培养面积不超过10 cm2，细胞不超过1×107），或者使用胰蛋白酶处理后离心收集细胞沉淀。
a. 直接裂解法：吸弃培养液，PBS清洗一次。
直接在培养板中加入TotalRNAExtractor 裂解细胞，每10 cm2面积加1-2ml TotalRNAExtractor（6孔板一般使用500-1000ul)。
用移液器吹打混匀。
TotalRNAExtractor 加量根据培养板面积决定，而不是由细胞数决定，如果加入的量不够，将导致提取的RNA 中有基因组DNA 污染。
b. 胰蛋白酶处理法：收集细胞并大致确定细胞数量，用PBS 洗涤细胞后，向细胞中加入含有0.1-0.25%胰蛋白酶的PBS 处理细胞，当细胞脱离容器壁后，加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶，将细胞溶液转移至无RNase 的离心管中，5000 rpm 离心 5 min，收集细胞沉淀，去除上清，PBS重悬，清洗一次，离心去上清。
每10 cm2面积加1 ml TotalRNA Extractor。
用移液器吹打混匀。
收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则裂解不完全，降低RNA 得率。
实时荧光定量PCR全方位解析
实时荧光定量PCR全方位解析实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
1. Ct 值的定义在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。
C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
2. 荧光域值（threshold）的设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 6-15 3. Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系〔1〕，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。
因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
4. 荧光化学荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。
现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
PCR扩增的原理和操作步骤
PCR扩增反应的操作第一节PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。
PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA 膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。
反应时先将上述溶液加热，使模板DNA 在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5’→3’方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。
因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。
1．模板DNA的变性模板DNA加热到90~95℃时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。
变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。
故PCR 中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。
对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97℃，时间适当延长，即所谓的热启动。
荧光定量PCR实验及数据分析
荧光定量PCR实验及数据分析荧光定量PCR（Fluorescence Quantitative PCR，qPCR）是一种常用于检测和定量分析DNA或RNA浓度的技术。
该技术利用荧光探针与靶分子结合产生荧光信号，通过荧光信号的强度可以确定靶分子的数量。
本文将介绍荧光定量PCR实验及数据分析过程。
实验步骤：1.样品制备：根据研究需要选择DNA或RNA样品，提取并纯化目标DNA或RNA，并将其浓度测定。
2.酶切反应：如果需要对目标DNA或RNA进行酶切，可在此步骤中将其酶切为较小的片段。
3.扩增反应体系的准备：根据实验设计和厂家提供的建议，配置扩增反应所需的试剂。
4.PCR扩增：将目标DNA或RNA与引物和荧光探针一起添加到PCR反应管中，并进行PCR扩增。
根据实验设计，设置反应的温度梯度和时间。
5.实时荧光检测：在PCR扩增的过程中，使用实时PCR仪不断监测PCR反应管中的荧光信号，记录其强度变化。
6.构建标准曲线：选取一系列已知浓度的标准样品进行PCR扩增，并记录每个标准样品的荧光信号强度。
根据标准曲线绘制荧光信号强度和目标分子浓度的对应关系。
7.分析样品数据：将样品的荧光信号强度与标准曲线进行比较，可以计算样品中目标分子的浓度。
根据实验目的，可以对样品数据进行统计分析，如计算平均值、标准差等。
数据分析：1.标准曲线分析：使用标准曲线中的已知浓度和相应的荧光信号强度，通过拟合曲线或插值方法，可以计算出待测样品中目标分子的浓度。
2.相对定量分析：若需要比较不同样品之间目标分子的相对表达水平，可选取一个内参基因作为参照，通过计算目标分子基因和内参基因相对表达量的比值，进行比较分析。
3.统计分析：根据实验设计和样品数量，可以使用合适的统计方法对数据进行分析。
常见的统计方法包括t检验、方差分析等。
总结：荧光定量PCR技术在生物学研究中具有重要的应用价值，能够快速、准确地定量测定DNA或RNA的浓度。
在进行实验时，需要注意实验步骤的正确操作，并合理选择实验设计和数据分析方法，以确保结果的可靠性和准确性。
PCR质量控制2012.3
耗材、试剂
耗材 带滤芯吸头、离心管爆管和抑制物质检 试剂盒的质检 包括外观质检和性能质检 选择或更换试剂品牌：试剂性能评估 更换试剂批号：评价核酸提取效率和扩增效率
更换试剂批号质检
设置空白对照、阴性对照、低值阳性对照 试剂不合格 1)低值阳性对照和标准品均未检出，或低值阳性对照未检出而标 准品检出率大幅下降，表示试剂失效或检测灵敏度大幅下降。 2)低值阳性对照未检出，标准品检测正常，提示样品提取液存在 问题。重复新旧提取液阳性对照实验，确定提取液失效问题。 3) 阴性对照有扩增，排除其他污染可能性后，提取液存在污染可 能。 4)低值阳性对照检出，标准品未检出或扩增曲线明显系统性CT值 偏大5个循环以上，提示阳性标准品存在问题。
使用玻璃器皿，必须为密闭的、必须经高压灭菌， 以使可能存在的RNase永久性失活。
标本验收、拒收
血液标本：溶血、严重脂血等应拒收 泌尿生殖道分泌物：镜下观察到上皮细胞存在。 痰液：镜下观察上皮细胞很少，一般<10个，白细胞 一般>25个。
标本运送
实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床标本的运送条件 （温度、时间）作出相应规定。 靶核酸为DNA的标本，如在无菌条件下，则可以在室温下运送， 建议采集后8h之内送至实验室； 靶核酸为RNA的标本，如在无菌条件下，可在室温下运送，如为 较长时间，则应在加冰条件下运送，建议采集后4h之内送至实验 室； 所有标本采集后送至实验室之前，所有临床标本在采集后送至 实验室前，均应放2－8℃临时保存。 淋病奈瑟菌有自溶的特性，标本采集后应立即送检。
-2S
-3S
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
4） R4S 在同一批中两个控制结果差超出4S范围， 其中有一个超出了+2S限值，另一个超出了2S 限值。或其中一个超出了＋1.5S，另一个超出了 －2.5S限值属随机误差过大，为失控。
PCR级的质量单位换算
PCR级的质量单位换算DNA的检验方法及指标、单位换算副标题： 2002-8-1 作者：liver411 来源：HBV论坛目前检验病毒的方法，除去血清培养基方法（HIV， CMV， HBV等病毒很难在培养基中分离检验），大致有三种:：PCR (polymerase chain reaction 或RT-PCR等)，最常用的方法，很敏感，但误差大，价钱比较贵，通常单位用 copies/ml of plasma；bDNA (branched chain DNA assay)，也是目前常用的方法，敏感，常规化，结果比较稳定，价钱比较便宜，通常单位用 units/ml of plasma (pg/ml， fg/ml)；NASBA (nucleic acid sequence-based amplification)，不常用，很敏感，误差大，工时长，价钱最贵，通常单位用 units/ml of plasma (pg/ml， fg/ml)；就HBVDNA而论，目前测验HBV DNA时通常要达到两个目的。
一个是定性(qualita tive)，另外一个是定量(quantitative) 。
HBVDNA定性的测验注重于HBVDNA的存在，它通常可以测到低于100copies/ml的病毒存在。
当然还有更精确的方法，通常用于科研实验室中，可以测到更低的含量。
一般临床用的都可以测到1000-2000 copies/ml以上的精度。
定性通常只给阴性、阳性的结果。
另外一方面，定量的测定着重于HBV DNA量存在的多少。
通常用于定量的极限在0. 1-5 pg/ml (1 pg/ml = 283，000 copies/ml)之间。
同样，更精确的仪器可以测到0.0 01-0.005 pg/ml的精度。
国外常用 fg/ml 为单位。
copies/ml 比 fg/ml， pg/ml 单位更小。
fg/ml， pg/ml 显示定量比 (?) X 10?易懂不容易错。
关于PCR总结
PCR总结若模板为环状质粒，最好先用酶将其切开成线性分子。
酵母、细菌及质粒基因组，每次反应的模板最大加入量分别为10ng，1ng和1pg。
引物的设计原则1．引物的长度应适宜，一般要求18~25bp，一对引物中两个引物之间的长度差异应小于3bp。
2．基本成分：G+C的含量一般为40%~60%。
四种碱基应随机的分布，避免碱基堆积的现象。
尤其引物的3’端，不应有连续的3个G或C，否则会使引物与核酸的G或C富集区互补从而影响PCR的特异性。
3．引物自身：引物自身不应有反向重复序列或者大于3bp的自身互补序列，否则引物自身会折叠形成发夹结构，将影响引物与待增DNA中的靶序列的杂交结合。
4．引物之间：引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠以免形成引物二聚体。
由于PCR反应体系中含有高浓度的引物，即使引物之间存在极为微弱的互补作用也会使引物相互杂交，最终得到引物二聚体的扩增产物。
若引物二聚体在PCR反应的早期形成，它们将通过竞争DNA聚合酶、引物及四种单核苷酸从而抑制待增DNA的扩增。
通过精心设计引物、应用热启动PCR(hot start PCR)或者降落PCR(touch down PCR)及特制的DNA聚合酶，可以减少引物二聚体的生成。
5．3’末端：引物的3’端（羟基端）是引发延伸的起点，因此一定要与模板准确配对，应尽量避免在引物3’端的第一位碱基是A。
引物3’端最佳碱基的选择是G和C，因为他们形成的碱基配对比较稳定。
6．溶解温度：3’端引物和5’端引物应有相似的T m值（不同序列的DNA，Tm值不同。
DNA中G-C含量越高，Tm值越高，成正比关系。
），其差别不应大于5℃。
扩增产物与引物的T m值的差别应小于10℃，以确保PCR循环中的扩增产物有效的变性。
8. 引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个碱基同源。
9．引物的简并性：引物的3’端应为保守的氨基酸序列，即采用简并密码较少的氨基酸如Met、Trp，且要避免三联体密码第三个碱基的摆动位置位于引物的3’端。
核算中质量与浓度的换算
核算中质量与浓度的换算光度计测量的转换:双链DNA (ds DNA)：A260 = OD260 = 1 相当于50 µg/ml溶液单链DNA(ss DNA)：A260 = OD260 = 1相当于33 µg/ml溶液RNA：A260 = OD260 = 1相当于40 µg/ml溶液参考文献：Freifelder, D., Physical Biochemistry: Applications to Biochemistry & Molecular Biology, W.H. Freeman and Company, CA, 1982, p. 494-536.核酸分子量计算方程式：吸光度(A)＝摩尔消光系数×浓度×长度500 bp的双链DNA＝325,000 Daltons500 nt*的单链DNA＝162,500 Daltons *nt = nucleotidedNMP的平均分子量＝325 Daltons（总的也就是腺苷三磷酸 dNMP，d 是脱氧的意思,N是核苷总称(包括ATCG)，M代表1，P磷酸基团合起来就是脱氧核苷酸2’-deoxynucleoside-5’-monophosphate）寡聚体定量：寡聚体-寡聚体，是一种由数量较少的单体以共价键重复的连接而成的短多聚体，常是指氨基酸、糖、核苷酸的短多聚体。
其单体的数目一般在20以下，常为2～10个monomerie unit ( mer) ：单体单元，相当于nt或者BP都可以。
通常用于双链核酸中的单位，100 mer DNA相当于每一条链有100nt，那么整条链就是100bp20-mer，A260 = 1的贮存液含有 5 nmol寡聚体：5 nmol = 33 µg/(20×325)40-mer，A260 = 1的贮存液含有 5 nmol寡聚体：2.5 nmol = 33 µg/(40×325)pmol为单位的引物转换为µg为单位的引物：（X pmoles×长度bp×325）/ 1,000,000例：10pmoles的25-mer，则为（10pmol×25bp×325）/ 1,000,000 = 0.081 µg primerµg为单位的引物转换为pmol为单位的引物：（X pmoles×1,000,000）/（长度bp ×325）例：0.1µg的20-mer，则为（0.1µg×1,000,000）/（20bp×325）= 15.4 pmoles primer引物毫摩尔浓度（mM）= pmoles/µl例1：100µl PCR反应体系中有20pmol的引物 = 0.20 mM例2：引物为24bp，并溶解于0.1ml µl H2O中；10µl溶液稀释至1.0ml测定其A260为：A260 = OD260 = 0.76；则贮存液在260nm（A260）的吸光度为76；0.1ml的贮存液含有7.6个单位的A260；引物碱基组成为：A=6, C=6, G=6, T=6；260nm引物的摩尔消光系数 = a(16,000) + b(12,000) + c(7,000) + d(9,600)注：a、b、c、d分别是 A's、G's、C's、T's的碱基个数；PCR引物的摩尔消光系数= 6(16,000) + 6(12,000) + 6(7,000) + 6(9,600) = 267,600则PCR引物贮存液的摩尔浓度为：76/267,600 = 284 mM核酸数据(Nucleic Acid Data)Kd是kilodaltons的缩写，既千道尔顿。
pcr反应步骤及注意事项
实验中的一些好习惯1 加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均2 移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性3 一定要记着关水浴箱，切记切记4 多和大家讨论，同时多关注别人讨论的经验，这几乎是最快提高的捷径了5 所有的试剂都自己配，出了问题才好找原因6 所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存备用，以减少重复加样次数，避免污染机会。
7 PCR试剂与反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。
试验前准备，防止RNA酶污染的措施：1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。
2. DEPC处理（1）0.1%DEPC水：100ml超纯水加入0.1ml DEPC，充分混匀，高压灭菌。
（2）Tip头(枪头）、EP管等在提RNA过程中及做RT时接触RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip 头；EP管和PCR反应管等）；用0.1%的DEPC水（1000 ml超纯水加入1ml DEPC）37℃浸泡过夜，高压灭菌。
枪头盒插好枪头后，加入1-2ml的0.1%的DEPC水，再灭菌就行了。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12h以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。
所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。
6．试剂尽量分装，不要原瓶多次取用。
7. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
8. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
标本处理区，包括扩增摸板的制备；PCR扩增区，包括反应液的配制和PCR扩增；产物分析区，凝胶电泳分析，产物拍照及重组克隆的制备。